微生物感染对公共健康构成重大威胁，抗生素过度使用导致的抗生素耐药性问题不断升级加剧。手性碳点（Carbon
Dots: CDs）不仅继承了CDs的抗菌特性，还表现出高选择性的杀菌活性。基于此，广东医科大学徐丽教授和合肥工业大学王峰教授团队开发由D-和L-半胱氨酸合成的手性CDs，以选择性识别和协同消除革兰氏阳性菌和真菌。手性CDs在染色革兰氏阳性细菌和真菌方面表现出很好的效果，而且对革兰氏阴性细菌表现出微弱的荧光，归因于这些病原体的膜结构的差异。与L-CDs相比，D-CDs表现出更强的荧光信号和对革兰氏阳性细菌和真菌更大的抗菌功效。在双光照射下，D-CDs通过三重模式机制增强抗菌活性，包括无光时的膜破坏、光动力治疗过程的单线态氧产生以及光热治疗过程的温度升高。动物研究还表明，在激光照射下，D-CDs显著增强了金黄色葡萄球菌感染的伤口的愈合。这项研究强调了D-CDs的手性特异性成像和抗菌潜力，为手性纳米材料在细菌诊断和治疗方面的进步铺平了道路。该研究成果以“D-cysteine-Derived
Carbon Dots for Selective Discrimination, Imaging, and Synergistic Elimination
of Gram-Positive Bacteria and Fungi”为题发表在“Advanced Functional
Materials (IF=18.5)”上，本文的第一作者Wenzhu Song。1. 背景介绍
细菌和真菌感染对人类健康产生重大威胁，每年导致数百万例疾病。目前，解决病原微生物感染的主要手段是使用抗生素。然而，抗生素的过度使用导致了多重耐药“超级细菌”和“超级真菌”的出现，引起了全球的关注。多年来，研究人员一直在努力寻找新的抗生素。然而，这些药物的开发滞后于耐药病原体的出现，形成一个恶性循环。因此，研究人员正在积极寻求新的抗菌材料或策略，为更有效地消灭微生物。手性纳米材料以其独特的手性和纳米级特征为特征，在不同领域显示出巨大的潜力。值得注意的是，在抗菌应用领域，手性纳米材料由于其独特的表面性质和生物相容性，已经成为开发新型抗菌剂有前途的途径。这些材料可以使用特定的手性源合成，例如氨基酸和多糖以及它们衍生的分子。其表面的手性官能团促进与微生物细胞壁或膜结构的特异性相互作用。这种特异性使手性纳米材料能够对特定类型的细菌或真菌表现出高度选择性的抗菌活性，从而减轻对有益的人类微生物群的影响，并最大限度地减少对抗生素的依赖和相关的耐药性风险。在抗菌应用中，手性纳米材料可以通过各种机制发挥作用，包括直接破坏微生物细胞膜的结构完整性，干扰细胞内代谢途径，或通过产生活性氧（ROS）诱导微生物死亡。此外，某些手性纳米材料可以通过光热或光动力疗法（涉及产生热量或ROS）增强其在光照下的抗菌功效。CDs是一类纳米材料，近年来由于其优异的性质，包括高光稳定性、生物相容性和可调荧光，获得了极大的关注。手性CDs拥有手性中心的同时引入了额外的功能层，使它们能够以立体特异性的方式与生物分子相互作用。这种手性在生物医学应用中特别有利，其中对映选择性至关重要，例如在与生物分子的相互作用中，这种选择性会增强药物递送系统的功效和特异性。Zhao等人利用D-谷氨酸（D-Glu）作为前体，通过一步合成工艺开发了手性CDs，显示出对金黄色葡萄球菌的优异抗菌效果。其抗菌活性的潜在机制是破坏肽聚糖（PG）的形成，具体归因于PG合成过程中MurA酶的抑制。类似地，Xin等人观察到D-Glu功能化的手性CDs通过选择性结合细胞质MurD连接酶，随后抑制PG合成酶的活性而表现出增强的抗菌性能。根据现有文献，L-半胱氨酸（L-Cys）是一种广泛分布于生物体中的氨基酸，通常用作食品添加剂和解毒。然而，其对致病菌的抗菌作用通常很小。另一方面，天然存在的L-Cys的对映异构体D-Cys对细菌表现出毒性，且潜在机制仍不清楚。尽管D-Cys表现出一定的抗菌能力，但它们的能力较弱，往往需要高浓度才能实现这一目的。因此，利用Cys作为具有抗菌活性的碳源对于开发高效抗菌手性CDs至关重要。本研究以D-或L-Cys作为唯一的碳源，通过溶剂热法合成手性CDs。合成的D-和L-CDs有效地保留了手性结构，并表现出优异的性能，包括优异的水溶性、广谱吸收、多色荧光发射和优异的生物相容性。这些手性CDs具有区分革兰氏阳性细菌和真菌以及革兰氏阴性细菌的独特能力，这一属性与微生物膜结构的差异有关。定量分析表明，与L-CDs相比，D-CDs存在于金黄色葡萄球菌和白色念珠菌时表现出更强的荧光，表明与这些微生物的相互作用更有利。此外，D-CDs在体外对革兰氏阳性菌和真菌表现出更有效的抗菌作用，突出了手性在增强其抗菌性能中的关键作用。光热疗法和光动力疗法分别利用光能产生热量或活性氧，是细菌治疗中采用的两种主要光疗形式。在双重光照射下，D-CDs在体外和体内都表现出增强的抗菌活性，这是光动力和光热疗法协同影响的结果。这种增强的功效促进了感染小鼠模型中的伤口愈合。他们的研究强调了D-CDs作为手性纳米材料在抗菌应用中的潜力，为传统抗生素的抗感染治疗提供了一种有前途的替代品（Scheme
1）。![]()
Scheme 1. Schematic illustration of multicolor Gram-positive
bacteria and fungi imaging alongside synergistic therapeutic applications. a)
Chiral CD preparation. b) Gram-positive bacteria and fungi imaging, coupled
with in vitro synergistic antibacterial sterilization. c) Mechanism of
antibacterial action and d) promotion of wound healing in S. aureus-infected
models using chiral CDs.
图1. 多色革兰氏阳性菌和真菌成像以及协同治疗应用的示意图。a)手性CDs的制备。b)革兰氏阳性菌和真菌成像，结合体外协同抗菌灭菌。c)抗菌作用机制和d)使用手性CDs促进金黄色葡萄球菌感染模型中的伤口愈合。
2. 结果与讨论
2.1 手性CDs的表征
通过简单的水热法合成了手性D-和L-CDs，使用D-/L-半胱氨酸作为前体。测得D-和L-CDs粗溶液的pH值分别为13.06和12.93。纯化后，将D-CDs的pH值调整为7.41，L-CDs的pH值调整为7.29。这种转变表明通过进一步纯化CDs溶液实现了显著的中和。D-CDs在紫外光下连续照射1小时，表现出显著的光稳定性。此外，D-CDs在宽范围的pH水平（pH 4-10）、NaCl浓度（0.025-1
M）和温度（25-65 °C）下表现出强大的物理化学稳定性。重要的是要强调，当pH低于4或超过11时，CDs的荧光逐渐下降至其初始强度的一半。此外，D-/L-CDs在较长的时间内保持稳定性，直到第14天既没有表现出显著的褪色也没有聚集。尽管手性D-和L-CDs具有相同的物理和化学性质，但他们表现出不同的圆二色性信号，这取决于它们各自的手性源D-或L-Cys（图1a）。此外，与游离半胱氨酸的光谱相比，D-CDs和L-CDs的圆二色性光谱表现出显著差异。值得注意的是，在242 nm处发现了新的镜像圆二色性信号，同时保留了源自半胱氨酸分子的217 nm峰。这一观察结果与文献中报道的类似。在240-300 nm光谱范围内观察到的圆二色性信号可能源于附着在CDs表面或内部形成的聚集体内低能级手性半胱氨酸的杂交。为了检验这一假设，评估了pH对D-和L-CDs圆二色性信号的影响。发现将pH降低到1导致在240-300 nm的光谱范围内圆二色性信号的振幅增加。总的来说，可以推断，在200-300
nm范围内检测到的CDs的手性信号来自其前体的固有手性，偶尔与CDs本身表面和内部形成的聚集体的信号一致。透射电子显微镜（TEM）分析显示，手性D-和L-CDs的直径分别为4.3和5.2 nm（图1b, d）。在高分辨率透射电子显微镜（HRTEM）图像中，两种变体都表现出0.21 nm的晶格间距，对应于石墨碳的（100）刻面（图1c, e）。手性D-/L-CDs的紫外-可见吸收光谱显示出宽的吸收峰，来自260 nm处芳环C=C键处的π-π*电子跃迁，以及320 nm处C=O键处的n-π*电子跃迁。此外，跨越400–700
nm的宽吸收范围分别对应于与C=S和S=O键相关的π-π*和n-π*电子跃迁（图1f）。此外，紫外-可见吸收分析（240 nm处的吸收）的结果与圆二色光谱获得的结果一致。对手性D-/L-CDs光学性质的进一步研究包括分析不同激发波长（280-500
nm）的光致发光谱，揭示荧光发射中独特的红移（图1g, h）。这些D-/L-CDs分别表现出8.1%和7.9%的光致发光量子产率。手性D-/L-CDs的电位都表明表面带负电（图1i）。使用傅立叶变换红外光谱（FTIR）和X射线光电子能谱（XPS）分析对手性D-/L-CDs的特定官能团和化学组成进行了深入表征（图1j）。D-/L-CDs的红外光谱显示出相似性，其特征在于指示3430
cm-1处的羟基（-OH）振动、3205 cm-1处的N-H振动、以及C-H（2965 cm-1）、C=O（1690 cm-1）、C-O（1135 cm-1）、和C-N、N-H和COO-键（1390
cm-1）的拉伸振动（图1j）。此外，1591、1185、1038和782 cm-1处的不同峰分别归因于与C=C/N=O、C=S、SO3-和C-S键相关的振动。通过XPS测定的D-和L-CDs的元素组成，发现这些D-/L-CDs主要由碳（C）、氮（N）、硫（S）和氧（O）元素组成。该组成与其前体材料的元素组成一致。手性D-/L-CDs的综合XPS光谱显示了对应于S 2p、C 1s、N 1s和O 1s的峰。C 1s光谱确定了五个不同的峰，代表C-C、C-S、C-N、C-O和C=O键。N 1s峰的特征是吡啶N、吡咯N和N=O的贡献，而O 1s峰由C-O、C=O/N=O和π-π*摇动贡献组成。值得注意的是，S 2p光谱突出了两个对应于C-S-C键的突出峰（S 2p 3/2和S 2p 1/2），中心位于163.1和164.3 eV。位于167.9和169.0 eV的其他峰归因于氧化硫形式，如磺酸盐或硫酸盐（-SO2和-SO3基团），存在于C-SOx-C构型（其中x=2, 3, 4）。另外要提到的一点是，虽然原料中S-S键的存在可能表明胱氨酸分子的形成，但D-/L-CDs的拉曼光谱未能显示515
cm-1附近的S-S拉伸振动峰。![]()
Figure 1. a) Circular dichroism spectra of D- and L-CDs. TEM and
HRTEM images for b,c) D-CDs and d,e) L-CDs. f) UV–vis absorption spectra of D and
L-cysteine, D- and L-CDs. Inlet: Expanded spectra for D- and L-CDs covering the
range from 400 to 700 nm. Fluorescence emission spectra for g) D-CDs and h)
L-CDs. i) 𝜁-potential measurements for D- and L-CDs. j) FTIR spectra of
cysteine, D- and L-CDs.
图 1. a) D-CDs和L-CDs的圆二色性光谱。b, c) D-CDs和d, e) L-CDs的TEM和HRTEM图像。f) D和L-半胱氨酸、D-CDs和L-CDs的紫外可见吸收光谱。插图：D-CDs和L-CDs的放大光谱，范围从400到700 nm。g) D-CDs和h) L-CDs的荧光发射光谱。i) D-CDs和L-CDs的𝜁电位测量。j)半胱氨酸、D-CDs和L-CDs的FTIR光谱。
2.2 手性CDs的光热和光动力学性质
图2a描绘了从光敏剂从基态（S0）激发后的能量跃迁途径。这个过程从处于最低单线激发态（S1）的电子开始，经历了辐射和非辐射弛豫。这导致荧光发射和能量释放，从而促进光热效应。此外，S1和激发态三重态（T1）之间存在增强的系间窜越（ISC），这对ROS的产生至关重要。使用660 nm激光光源系统地研究了D-/L-CDs的光热性质。观察到的温度升高表现出依赖于浓度和激光功率的特性（图2c）。红外热成像证实了温度升高（图2b），即使在D-/L-CDs的660 nm激光开/关的五个循环之后，也显示出稳定的温度变化（图2d）。光热转换效率（η）被量化，D-CDs的值为65.53 %，L-CDs的值为54.76 %（图2e）。在相同的实验参数下（100 μg·mL-1, 1.5 W cm−2, 图2f），在660 nm激光下照射10 min导致D-CDs溶液中的温度升高24 °C，L-CDs溶液中的温度升高21 °C。这一结果表明，与L-CDs相比，D-CDs的光热效应稍微更明显。此外，当D-CDs暴露于双激光照射（0.5/1.5 W cm-2，405/660
nm）时，观察到与仅660 nm激光照射相似的光热曲线。这一观察结果表明，当暴露于405 nm激光时，D-CDs没有光热效应。为了探索手性CDs的光动力学性质，使用405 nm激光照射进行了广泛的评估。该评估旨在利用荧光2’, 7’-二氯荧光素试验定量ROS的产生，如羟基自由基（·OH）、单线态氧（1O2）和超氧阴离子（·O2-）。ROS存在时，2’, 7’-二氯荧光素被氧化，导致形成亮绿色荧光二氯荧光素（DCF）。在405 nm激光（100 μg·mL-1,
0.5 W cm−2）照射下，D-和L-CDs都表现出DCF荧光的显著时间依赖性增加（图2g）。值得注意的是，D-CDs表现出更高的荧光强度，表明更突出的ROS产生。相反，未处理的2', 7'-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）溶液在暴露于405 nm激光照射时显示出可忽略的荧光变化。随后分别使用绿色单线态氧传感器（SOSG）、对苯二甲酸、和超氧阴离子检测试剂盒验证了1O2、·OH和·O2-的产生。在三种荧光探针中，D-和L-CDs在405 nm光照射下（100 μg·mL-1,
0.5 W cm-2），都表现出仅依赖于浓度的荧光增强。在相同的实验条件下，D-CDs比L-CDs产生更多的1O2（图2h）。值得注意的是，当用660 nm激光照射时（100 μg·mL-1, 1.5 W cm-2），没有观察到1O2的产生。双光照射（405/660
nm）下SOSG的荧光强度趋势与仅用405 nm激光观察到的荧光强度趋势相似，表明1O2的产生仅由405 nm激光诱导。为了进一步证实1O2的产生，采用电子自旋共振（ESR）实验，利用2, 2,
6, 6-四甲基哌啶（TEMP）作为自旋捕获剂。在405 nm激光照射前后记录ESR光谱。在405 nm激光照射后，观察到ESR信号强度显著增强，表明2, 2, 6, 6-四甲基哌啶-1-氧基（TEMPO）的形成。对照实验没有给出由405 nm激光照射触发的任何ESR信号增强。总的来说，这些结果强调了与L-CDs相比，D-CDs表现出略好的光热效应和更高的光诱导1O2生成，支持了它们作为光热和光动力治疗应用中使用的有效试剂的潜力。PDT和PTT的功效取决于激光波长与相应光敏剂和光热剂的吸收光谱的匹配。D-和L-CDs具有400-700 nm的宽吸收范围，适合两种疗法的优选吸收带。PDT的405 nm波长是最佳的，因为它与许多光敏剂的峰值吸收密切对应，有利于有效的光能吸收和随后用于细菌细胞破坏的ROS产生。在PTT中，选择660 nm波长是因为其有效的光热转换，符合许多光热剂的吸收特性，以及其更深的组织穿透能力。在纯化的CDs溶液的pH值（pH = 7）下，使用半胱氨酸进行了额外的生物实验（光热效果、ROS产生）。实验条件同上，结果表明，D-和L-Cys在405/660 nm双光照射下不能产生光热和光动力效应。![]()
Figure 2. Photothermal and photodynamic properties of D- and L-CDs.
a) A schematic representation of the potential photophysical activation
processes of CDs. b) Thermal imaging photographs displaying various concentrations
of D-CDs solution exposed to 1.5 W cm−2 660 nm light irradiation for
10 min. c) Photothermal curves of D-CDs solution under varying power densities
of 660 nm light at pH 7.4 with a concentration of 100 μg mL−1. d)
Heating and cooling curves of D-CDs solution (100 μg mL−1) across
five on/off cycles (660 nm, 1.5 W cm−2). e) Determination of the
photothermal conversion efficiency of D-CDs at 660 nm. The blue line represents
the temperature rise and fall profiles of D-CDs over a specific period, while
the red line indicates the time constant (𝜏s) derived from the cooling period using linear time data. f)
Temperature elevation in D- and L-CDs solution at varying concentrations
exposed to 660 nm light irradiation (1.5 W cm−2, 10 min). g)
Time-dependent changes in DCF fluorescence intensity and h) variations in SOSG
fluorescence at 525 nm, in the presence of D- or L-CDs (100 μg mL−1),
with or without 405 nm light irradiation (0.5 W cm−2).
图2. D-CDs和L-CDs的光热和光动力学特性。a) CDs潜在光物理活化过程的示意图。b)热成像照片显示不同浓度的D-CDs溶液在1.5 W cm-2 660 nm光照射10 min。c)浓度为100
μg mL-1、pH为7.4且在不同功率密度的660 nm光下的光热曲线。d) D-CDs溶液（100 μg mL-1）在五个开/关循环（660
nm，1.5 W cm-2）中的加热和冷却曲线。e)确定D-CDs在660
nm下的光热转换效率。蓝线表示D-CDs在特定时间段内的升温降温曲线，红线表示使用线性时间数据从冷却期得出的时间常数（𝜏s）。f)不同浓度的D-和L-CDs溶液在660
nm光照射（1.5 W cm−2，10 min）下的温度升高。g) DCF荧光强度随时间的变化和h)在存在D-或L-CDs（100
μg mL−1）的情况下，有或没有405 nm光照射（0.5 W cm−2）时，SOSG在525
nm处的荧光变化。
2.3 革兰氏阳性菌和真菌的选择性成像
手性CDs用于微生物成像，特别是区分革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及真菌。值得注意的是，金黄色葡萄球菌（S.aureus）、大肠杆菌（E.coli）和白色念珠菌（C.albicans）分别被选为革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌的代表。在不同的激发波长下（蓝色为Ex=405
nm，绿色为Ex=488
nm，红色为Ex=552
nm），金黄色葡萄球菌和白色念珠菌通过手性CDs均表现出不同伪色荧光。相比之下，在相同的实验条件下，大肠杆菌没有表现出任何可检测的荧光信号（图3a）。该结果表明了手性CDs具有选择性鉴定革兰氏阳性细菌和真菌的潜力，同时强调了无法区分革兰氏阴性细菌。为了进一步验证它们的适用性，用手性CDs对更广泛的微生物进行成像。值得注意的是，多种革兰氏阳性菌，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）、枯草芽孢杆菌（B.subtilis）和粪肠球菌（E.faecalis），以及真菌近平滑念珠菌(C. parapsilosis)，都表现出选择性染色。然而，革兰氏阴性菌，如奇异变形杆菌（P.
mirabilis）和鼠伤寒沙门氏菌（S.
typhimurium）则表现出微弱的荧光。在含有金黄色葡萄球菌，大肠杆菌和白色念珠菌的混合微生物溶液中，仅观察到金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的选择性点亮，而大肠杆菌不发出荧光信号（图3b）。该证据支持D-和L-CDs能够有效区分革兰氏阳性菌和真菌与革兰氏阴性菌的结论。流式细胞术分析进一步证实了这些区别，在与D-和L-CD孵育后，检测到革兰氏阳性细菌和真菌的荧光信号显著增加。在金黄色葡萄球菌和白色念珠菌中，D-CDs表现出比L-CDs更强的荧光。相反，革兰氏阴性菌的荧光强度变化最小。600
nm的光密度测量证实，在金黄色葡萄球菌和白色念珠菌中，浓度为10 μg
mL-1的D-/L-CDs没有细菌毒性，表明它们适用于活细菌和真菌的荧光成像。透射电子显微镜（TEM）进一步显示，D-CDs在革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌和真菌白色念珠菌的表面上表现出增强的吸附，形成聚集体。相反，革兰氏阴性菌大肠杆菌的膜看起来是光滑的，并且在其表面上没有CDs（图3f-h）。当将D-或L-CDs与金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌混合后，观察结果表明金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的表面电位没有显著变化，而大肠杆菌的表面电位略有降低。这一观察结果对于理解CDs和微生物细胞之间的分子水平相互作用机制至关重要，这可能会影响它们的生存力或行为。![]()
Figure 3. a) Confocal laser scanning microscope images of
Gram-positive S. aureus, Gram-negative E. coli, and the fungus C. albicans
treated with a D-CD solution. b) Selective imaging highlighted S. aureus and C.
albicans within bacteria mixtures using D-CDs. A red arrow points to E. coli.
Excitation wavelengths are 405, 488, and 552 nm, respectively. Scale bar: 5 μm.
Flow cytometric results to quantify the fluorescence intensities of c) S.
aureus, d) E. coli, and e) C. albicans before (control) and after being treated
with the D-CD solution. TEM images of f) S. aureus, g) E. coli, and h) C.
albicans after treatment with the D-CD solution. Each of these microorganisms
was mixed with 10 μg mL−1 D-CDs for 30 min at 37 °C.
图3. a)用D-CDs溶液处理的革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性大肠杆菌和真菌白色念珠菌的共聚焦激光扫描显微镜图像。b)使用D-CDs选择性成像突出显示细菌混合物中的金黄色葡萄球菌和白色念珠菌。红色箭头指向大肠杆菌。激发波长分别为405、488和552 nm。比例尺：5 μm。流式细胞术结果量化了c)金黄色葡萄球菌、d)大肠杆菌和e)白色念珠菌在用D-CDs溶液处理之前（对照）和之后的荧光强度。用D-CD溶液处理后f)金黄色葡萄球菌、g)大肠杆菌和h)白色念珠菌的TEM图像。将每种微生物与10 μg mL−1 D-CDs在37 °C下孵育30 min。
2.4 体外抗菌效果
该研究进一步探索了对革兰氏阳性、革兰氏阴性和真菌病原体的抗菌作用。结果表明，D-和L-Cys对金黄色葡萄球菌的抗菌活性比D-和L-CDs低至少20倍。然而，大肠杆菌和白色念珠菌的最低抑菌浓度（MICs）和最低杀菌浓度（MBCs）值太高，无法进行进一步的细菌研究。在没有激光照射的情况下，测定了D-和L-CDs对八种致病菌和真菌的MICs和MBCs。值得注意的是，即使在没有光照的情况下，D-和L-CDs也表现出内在毒性，影响所有检测的革兰氏阳性菌（MICs=0.2-0.8
mg mL-1）和真菌（MICs=0.4-0.6
mg mL-1）。相反，发现所评估的革兰氏阴性细菌的MICs大于1 mg ml-1。在双波长（405/660
nm）光照射下用D-CDs处理10 min后，手性CDs促进的1O2的扩增产生和有效的光热转化显著降低了金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的MICs。MICs分别降低至无光照记录水平的1/8和1/5，显示了PDT和PTT的协同作用。在双激光照射下，L-CDs的表现相当，尽管MICs相对较高。有趣的是，D-CDs对所有测试的革兰氏阳性物种和白色念珠菌表现出增强的抗菌性能，这可归因于手性CDs促进的立体选择性相互作用。值得注意的是，他们的研究结果显示，D-和L-CDs对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌活性比抗生素低至少10倍。然而，白色念珠菌的MICs和MBCs值与抗生素相当。在405/660 nm双光照射下，与抗生素相比，D-CDs对白色念珠菌表现出更强的活性，对金黄色葡萄球菌表现出相当的抗菌活性。然而，对于大肠杆菌，D-CDs表现出至少低15倍的抗菌活性。然而，与传统抗生素相比，D-CDs不太容易在细菌和真菌中诱导耐药性，因此在对抗微生物耐药性方面提供了显著优势。使用标准菌落计数方法进一步研究了手性CDs通过PDT和PTT的组合机制对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、革兰氏阴性大肠杆菌和真菌白色念珠菌的协同抗菌作用。手性CDs的缺乏导致可忽略不计的抗菌活性，表明单独用405 nm光进行PDT，或者甚至405/660
nm双光照射组合用于PDT和PTT都不足以有效根除这些微生物。D-CDs在黑暗条件下消除金黄色葡萄球菌和白色念珠菌方面显示出浓度依赖性功效。当接受405/660
nm双光照射时，浓度为100 μg
mL-1的D-CDs对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌均达到95%的灭菌效果，优于相同浓度的L-CDs的有效性。值得注意的是，利用D-和L-CDs的组合PDT和PTT策略对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌产生了优异的抗菌效率，超过了单独405或660 nm光照射所实现的效率。这突出了PTT和PDT之间的协同相互作用。相比之下，D-和L-CDs对革兰氏阴性大肠杆菌的抗菌作用与其对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的影响相比表现出差异。值得注意的是，应用100 μg
mL-1手性CDs单独或与10 min的405 nm光照射组合未显示出针对大肠杆菌的显著抗菌有效性，表明手性CDs对该细菌缺乏PDT作用。然而，使用405/660 nm双光照射10 min后，浓度为100
μg mL-1的D-CDs和L-CDs分别显示出37%和15%对大肠杆菌的杀菌活性。使用D-和L-CDs的双激光对大肠杆菌诱导的抗菌作用归因于含有CDs的溶液内温度的升高。此外，金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的生存力在双光照射10 min的过程中逐渐降低，这是D-CDs产生的1O2和热能的结果。类似地，对于大肠杆菌，在用D-CDs进行双光照射的持续时间内，观察到细菌活力下降，这归因于持续产生热量。一方面，使用SYTO 9/PI染色评估D-和L-CDs的抗菌功效。SYTO 9是一种荧光染料，通过与细菌细胞的DNA和RNA结合来标记所有细菌细胞，无论膜的完整性如何，都会发出绿色荧光。另一方面，碘化丙啶（PI）选择性地染色死细菌，其膜已经受损，发出红色荧光。在没有CDs存在的情况下，使用405/660 nm双光照射下，金黄色葡萄球菌和白色念珠菌都表现出绿色荧光，表明它们的生存能力。然而，在加入D-和L-CDs后，出现红色荧光信号，表明具有特定的抗菌作用。值得注意的是，当在405/660
nm双激光照射时，金黄色葡萄球菌和白色念珠菌在用D-和L-CDs处理后都显示出红色荧光，与L-CDs相比，D-CDs在组合的PDT和PTT中显示出增强的毒性（图4c）。关于大肠杆菌，当在405/660 nm双光照射下，有D-和L-CDs的存在时，细菌死亡最少。此外，当大肠杆菌细胞单独用D-CDs或L-CDs处理时，没有观察到细菌细胞死亡。使用扫描电子显微镜（SEM）和TEM评估微生物的形态变化。细菌和真菌细胞在使用双光照射后表现出完整的细胞壁和光滑的表面。然而，在用D-或L-CDs处理后观察到一定程度的细胞塌陷。具体地，当在405/660
nm双光照射下用D-CDs或L-CDs处理金黄色葡萄球菌和白色念珠菌时，与L-CDs相比，DCDs引起了的损伤更大。这种损伤表现为异常的膜折叠和表面融合，表明抗菌效力增强（图4d）。对于大肠杆菌，当在405/660 nm双光照射下，有D-和L-CDs存在时，观察到轻微的表面损伤。然而，在仅用D-和L-CDs处理的细胞中没有明显的表面损伤。![]()
Figure 4. a) Images of agar plates and b) the relative bacterial
viability of S. aureus treated with or without chiral CDs (100 μg mL−1)
under conditions of darkness, 405 nm light irradiation (0.5 W cm−2,
10 min), 660 nm light irradiation (1.5 W cm−2, 10 min), and 405/660
nm (0.5 W cm−2, 1.5 W cm−2, 10 min) dual light
irradiation, respectively. Error bars denote means ± standard deviations (SDs)
for n = 3 experiments: **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. c)
Fluorescent live/dead assay of S. aureus treated with or without chiral CDs (100
μg mL−1) in darkness and under 405/660 nm (0.5, 1.5 W cm−2,
10 min) dual light irradiation. Live bacteria emitted green fluorescence, while
dead bacteria emitted red fluorescence. Scale bar: 5 μm. d) SEM and TEM images
of S. aureus incubated with or without chiral CDs (200 μg mL−1) in darkness and
under 405/660 nm (0.5 W cm−2, 1.5 W cm−2, 10 min) dual
light irradiation. Scale bar for SEM: 2 μm; Scale bar for TEM: 0.5 μm.
图4. a)琼脂平板图像和b)在黑暗、405 nm光照（0.5 W cm-2，10 min）、660 nm光照（1.5 W cm-2，10 min）和405/660
nm（0.5 W cm-2、1.5 W cm-2，10 min）双光照条件下，用或不用手性CDs（100
μg mL-1）处理的金黄色葡萄球菌的相对细菌活力。误差线表示n=3次实验的平均值±标准差（SD）：**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。c)在黑暗条件下和405/660 nm（0.5、1.5 W cm-2、10 min）双光照射下，用或不用手性CDs（100
μg mL-1）处理的金黄色葡萄球菌的荧光活/死测定。活细菌发出绿色荧光，而死细菌发出红色荧光。比例尺：5 μm。d)在黑暗条件下和405/660 nm（0.5 W cm-2、1.5 W cm-2、10 min）双光照射下，用或不用手性CDs（200
μg mL-1）孵育的金黄色葡萄球菌的SEM和TEM图像。SEM比例尺：2 μm；TEM比例尺：0.5 μm。
2.5. 抗菌机制
在确认D-CDs和L-CDs成功产生细胞外1O2后，继续使用荧光探针DCFH-DA检查微生物内的ROS产生情况。这项评估试图利用流式细胞术测量405
nm光照射下D-CDs和L-CDs触发的内源性ROS水平。与对照组相比，D-CDs和L-CDs在405 nm光照射后均表现出ROS水平显著增加，对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌均有影响。相反，大肠杆菌的ROS水平没有显著增加，突显了D-CDs和L-CDs在405 nm光照射下对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的光动力活化能力增强。值得注意的是，在405
nm光照射下，与L-CDs相比，D-CDs诱导的ROS产生更明显。因此，内源性ROS的产生被确定为杀菌作用的关键机制，尤其是在金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的情况下。使用碘化丙啶（PI）染料评估D-和L-CDs对微生物细胞膜造成的损伤。PI能够渗透受损膜，与细胞DNA结合，然后发出荧光，作为膜完整性的指标。与对照组相比，当分别用100
μg mL−1的D-和L-CDs处理时，金黄色葡萄球菌和白色念珠菌中的PI荧光信号在照射时间从0到10 min内持续增加。D-CDs对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的细胞膜破坏作用更显著，表明其能有效穿透细胞膜并严重破坏细胞结构完整性。然而，由于光热效应有限，其对大肠杆菌的影响微乎其微（图5a-c）。ATP是一种细胞内能量货币，在细胞代谢、呼吸和酶促反应中起着至关重要的作用。监测微生物细胞ATP的消耗可以深入了解能量解偶联的影响，表明D-和L-CDs对细胞代谢的潜在破坏。因此，他们研究了D-和L-CDs在独立作用和在双重光照射下对细菌和真菌细胞ATP水平的影响（图5d-f）。当经受双重光照射时，与L-CDs相比，D-CDs导致金黄色葡萄球菌和白色念珠菌中ATP更明显的减少。相反，在双光照射下D-和L-CDs对ATP耗竭的影响对于大肠杆菌来说并不显著。这些观察结果共同强调了D-CDs在双光照射下的显著ATP消耗活性，特别是针对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌，展示了它们干扰细胞代谢的能力。在与手性CDs或手性CDs在双光照射下孵育后，评估微生物核酸的泄漏情况（图5g-i）。用D-CDs处理导致金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的核酸泄漏增加，浓度分别达到4.22和3.61 ng
μL-1。这种升高表明D-CDs可以破坏细胞膜，导致核酸的释放。值得注意的是，双光照射导致用D-CDs处理的金黄色葡萄球菌和白色念珠菌中细菌核酸的泄漏加倍，核酸浓度分别达到8.12和8.34 ng μL-1。L-CDs表现出类似的作用，尽管与D-CDs相比，它们的膜破坏功效不太明显。相反，D-和L-CDs在没有光照射的情况下在大肠杆菌中引起最小的核酸泄漏。然而，在双光照射下观察到泄漏的轻微增加，分别导致2.34和1.98 ng μL-1的浓度。![]()
Figure 5. Investigation of antibacterial mechanisms. a–c)
Fluorescence of PI, d–f) ATP levels, and g–i) nucleic acid concentrations were
obtained after treating S. aureus, C. albicans, or E. coli with 100 μg mL−1D- and L-CDs, followed by exposure to designated dual light irradiation times.
Error bars denote means ± SDs for n = 3 experiments: ns indicates no
significant difference, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p
< 0.0001.
图5. 抗菌机制研究。用100 μg mL−1 D-和L-CDs处理金黄色葡萄球菌、白色念珠菌或大肠杆菌，然后使用指定的双光照射时间后，获得a-c) PI荧光、d-f) ATP水平和g-i)核酸浓度。误差线表示n=3次实验的平均值±SD：ns表示无显著差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
2.6 生物相容性评估
通过细胞毒性和溶血活性测定来评估手性CDs的生物相容性。D-CDs对LO2细胞表现出最小的细胞毒性，即使在高达600 μg
mL-1的浓度下也是如此。在405/660 nm双光照射后，D-CDs导致细胞活力适度下降，但在600 μg
mL-1的浓度以下，LO2细胞的存活率保持在90%以上。该浓度显著超过了所研究细菌记录的最高MICs值。相反，无论双光照射如何，LCDs在等于或低于400 μg
mL-1的浓度下保持了80%以上的细胞活力。因此，D-和L-CDs对LO2细胞都表现出可忽略的暗毒性或光毒性。溶血评估显示，即使在405/660
nm双光照射下，浓度为MICs八倍的D-和L-CDs也不会诱导对2%兔红细胞的显著溶血活性。这些发现共同强调了手性CDs在测试浓度下的良好生物相容性。2.7 细菌感染伤口的体内治疗
为了评估手性CDs的抗菌功效和伤口愈合特性，使用感染金黄色葡萄球菌的全层皮肤伤口模型并进行光照（图6a），使用左氧氟沙星作为比较的基准。在405 nm和660
nm双光照射10 min后，D-CDs的应用导致伤口部位的温度升高至56 °C，而L-CDs导致温度升高至47 °C（图6b, c）。温度的差异表明，与L-CDs相比，D-CDs在体内具有更有效的PTT效应。图6d, g提供了伤口的代表性图像和描绘在第1, 3, 5, 8, 9, 10, 11和12天跨越五个治疗组的伤口愈合进展的示意图。治疗5天后，与其他三组相比，在405/660 nm双光照射下用D-和L-CDs治疗的伤口恢复情况更好。值得注意的是，在405/660
nm双光照射下用D-CDs治疗的组在5天后显示出最小的伤口面积和最显著的杀菌效果。令人印象深刻的是，该组在第10天实现了几乎完全的伤口愈合。用L-CDs治疗并接受双重光照射的组在10天后也表现出治疗有效性。定量分析表明，在第9天，D-CDs和双光治疗组的伤口面积减少百分比为84.8%，L-CDs和双光组为66.4%，左氧氟沙星治疗组为64.4%，未治疗对照组为46.0%，单独接受双光的对照组为41.5%（图6e）。此外，通过分析来自小鼠伤口的匀浆组织分散体中的细菌计数，定量评估了用双光处理的D-CDs组的抗菌治疗效果。如图6f所示，与用L-CDs和双光治疗的组相比，用D-CDs和双光治疗的组在第5天表现出减少的细菌定植，突出了当与双光照射组合时D-CDs增强的治疗效果。![]()
Figure 6. Synergistic antibacterial efficacy and in vivo wound
healing assessment: a) A schematic illustration of S. aureus skin wound
infection and treatment with D- and L-CDs (200 μg mL−1) using
405/660 nm (0.5 W cm−2/1.5 W·cm−2) dual light
irradiation. b) Infrared thermal images of mice with or without D- and L-CDs
(200 μg mL−1) under 660 nm (1.5 W·cm−2) light
irradiation. c) Temperature elevation at the wound site in infected mice under
660 nm (1.5 W cm−2) light irradiation. d) Representative photographs
of infected wounds following various treatments across designated time intervals.
e) Wound area measurement in infected wounds across various treatment groups at
different time points. f) Statistical analysis of bacterial counts obtained
from the wound tissues. g) Schematic depiction of wound contraction in
different sample treatment groups. Error bars denote means ± SDs for n = 3
experiments: ns indicates no significant difference, *p < 0.05, **p <
0.01, ***p < 0.001.
图 6. 协同抗菌功效和体内伤口愈合评估：a)使用405/660 nm（0.5 W cm-2/1.5 W·cm-2）双光照射，金黄色葡萄球菌皮肤伤口感染和用D-和L-CDs（200 μg mL-1）治疗的示意图。b)在660
nm（1.5 W·cm-2）光照射下，有或没有D-和L-CDs（200
μg mL-1）的小鼠的红外热图像。c)在660 nm（1.5 W cm-2）光照射下，感染小鼠伤口部位的温度升高。d)在指定时间间隔内进行各种治疗后感染伤口的代表性照片。e)在不同时间点，不同治疗组的感染伤口的伤口面积测量。f)从伤口组织中获得的细菌计数的统计分析。g)不同样品治疗组中伤口收缩的示意图。误差线表示n=3次实验的平均值±SD：ns表示无显著差异，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
在第1、5和12天对伤口皮肤组织进行组织学分析，采用苏木精和伊红（H&E）和Masson染色技术（图7）。在第1天，所有组均出现表皮缺损和炎症细胞浸润水平显著降低。这是由于伤口组织内感染金黄色葡萄球菌所致。到第5天，对照组和对照/光照组均出现大量炎症细胞。相反，与对照组和对照/光照组相比，用D-CDs/光照、L-CDs/光照和左氧氟沙星治疗的组炎症细胞浸润水平显著降低。到第12天，对照组和对照/光照组出现伤口愈合不完全和表皮损伤明显的迹象（黑色箭头所示）。与此形成鲜明对比的是，D-CDs/光照、L-CDs/光照和左氧氟沙星组显示出边界清晰、完整的表皮层（黄色虚线突出显示）。值得注意的是，用D-CDs/光照组和用左氧氟沙星治疗的组显示伤口组织内形成了新的毛囊（绿色箭头所指）和血管（红色箭头所指），表明愈合处于晚期阶段。此外，在D-CDs/光照组的皮肤组织中还观察到炎症细胞的存在减少。这些发现共同表明，D-CDs/光照组促进了高效的伤口愈合，这归因于其有效的抗菌活性。此外，使用Masson染色可视化胶原纤维，呈现蓝色。与其他组相比，D-CDs光组显示出明显更蓝的颜色和显著更高丰度的胶原纤维，表明组织再生增强。为了验证D-CDs的安全性，在整个研究过程中密切监测受感染小鼠的体重，所有组都显示出一致和稳定的体重模式。此外，在第12天，在治疗组之间没有观察到器官与体重比的显著变化。此外，治疗12天后，对主要器官（包括心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）的H&E染色切片的检查显示，所有组的器官损伤或病理异常没有明显差异，强调了D-CDs在这种情况下的无毒作用。![]()
Figure
7. H&E staining of the wound section in different treatment groups on days 1,
5, and 12. Scale bar: 100 μm.
图7. 第1、5、12天不同治疗组伤口切片的H&E染色。比例尺：100μm。
3. 结论
由于其固有的特性，CDs为商业上使用的传统抗菌剂提供了一种替代品，这大大增强了它们在不同治疗环境中的适应性和易用性。CDs作为抗菌剂的有效性和卓越品质源于其广谱功效、优异的生物相容性和多功能的抗菌作用。这些特征使CDs成为解决不断升级的细菌耐药性问题和现有抗菌方法的缺点的有前途的解决方案。总的来说，他们已经开发出能够选择性识别、成像和协同根除革兰氏阳性细菌和真菌的手性CDs。与革兰氏阴性细菌相比，D-和L-CDs对活革兰氏阳性细菌和真菌的优先渗透和染色可归因于这些微生物外包膜的结构差异。D-CDs表现出更强的荧光信号，这是由于它们更高的细菌内化效率以及CDs与细菌细胞之间的手性相互作用。此外，D-CDs有效抑制革兰氏阳性细菌和真菌的生长，表现出高度依赖手性的行为。与L-CDs相比，在双光照射下，D-CDs通过卓越的化学、PDT和PTT三模式协同方法表现出增强的针对革兰氏阳性菌和真菌的抗菌能力。机理研究表明，D-CDs在双重光照射下对微生物产生大量的ROS和热量，导致微生物膜的破坏、核酸的泄漏和ATP产生的抑制。值得注意的是，D-CDs对人细胞表现出低毒性，同时显著增强细菌感染伤口的愈合。这个成功的例子强调了手性CDs在选择性鉴别、成像和协同消除革兰氏阳性细菌和真菌方面的巨大潜力。本文引入了一种精确工程微生物表面的新策略，并为诊断和治疗细菌和真菌感染提供了新的途径。
