核仁参与许多重要的细胞活动，是评估细胞或生物体状态的理想靶点。基于此，东南大学吴富根教授团队通过刚果红和对苯二胺的一步水热反应合成了具有激发独立/极性依赖性荧光发射的明亮发光碳点（称为CPCDs）。CPCDs可以在活细胞中实现免洗、实时、长期和高质量的核仁成像，以及两种常见模型动物——斑马鱼和秀丽隐杆线虫（C.elegans）的体内成像。值得注意的是，CPCDs首次在细胞水平上实现了斑马鱼器官/流动血细胞的核仁成像，秀丽隐杆线虫的出色的核仁成像表明，精囊中的生殖细胞可能没有完整的细胞核。这些以前未实现的细胞/组织/器官成像结果可以指导斑马鱼相关的研究，并有益于秀丽隐杆线虫发育的研究。更重要的是，开发了一种基于CPCDs的材料/药物（如Ag+）体内毒性评估的新策略，该策略可以直观地描述斑马鱼中原本看不到的损伤。总之，CPCDs是一种可视化活斑马鱼和秀丽隐杆线虫结构和动态行为的强大工具，并可能在细胞生物学和毒理学中找到重要的应用。本文以“See
the Unseen: Red-Emissive Carbon Dots for Visualizing the Nucleolar Structures
in Two Model Animals and In Vivo Drug Toxicity”为题，发表在Small(IF=13.0)上，本文的第一作者是Ke-Fei Xu。
1. 介绍
核仁是负责核糖体RNA的合成和加工一种关键的亚核结构。此外，核仁参与许多重要的细胞活动，如有丝分裂的调节，应激反应，以及多种核糖核蛋白颗粒的生物合成，这些活动与多种人类疾病有关。例如，之前的研究表明，核仁的动态形态变化（大小和/或形状）和数量通常可以预测一些疾病的发生。因此，可视化核仁结构有利于监测细胞的状态/活性并确定疾病的性质。不幸的是，目前市面上只有一种用于核仁靶向荧光成像的染料（SYTO
RNASelect），并且该染料的成本高、染色条件苛刻（仅适用于固定细胞染色）和染料发射绿光等缺点限制了其在体外和体内的应用。为了解决这些问题，已经报道了分子探针、配体修饰的量子点和荧光碳点（Carbon
Dots: CDs）来实现活细胞核仁成像。然而，这些探针仍然存在一些限制，尤其是体内成像性能不佳。与体外成像条件相比，探针穿透组织的深度、细胞器靶向效率和生物相容性会影响体内成像结果。例如，该课题组开发了一种红色发射CDs，可以实现令人满意的体外核仁成像结果，但无法实现高质量的体内成像。重要的是，核仁的动态/实时体内成像对于跟踪活体动物模型中的细胞行为或器官/组织的变化至关重要，这对于一些生物医学领域如发育生物学、体内药物功效评估和体内毒理学研究非常重要。因此，开发荧光探针以实现理想的体外和体内核仁成像是极其重要的。CDs通常是指尺寸较小（<10 nm）的碳纳米颗粒，具有优异的光学性质、良好的生物相容性和易于制备/修饰，在生物成像、能源、传感、纳米医学和催化等许多方面具有潜在用途。对于生物成像而言，制备具有高质量红光/近红外（NIR）发射性质的CDs至关重要，因为红光/NIR发射CDs可以穿透深层生物组织，避免组织自发荧光的干扰，最终提供高信噪比，实现优异的成像结果。尽管研究人员已经尽最大努力开发红光/NIR发射CDs，但由于纯化过程复杂、水分散性和低效的细胞内细胞器的靶向仍然限制了CDs的进一步应用。因此，用于高质量细胞内和体内成像的红光/NIR发射CDs。在此，他们通过刚果红和对苯二胺（pPDA）的一步水热反应制备了一种红光发射CDs（称为CPCDs）（Scheme
1）。pPDA可以提供核仁靶向能力和共轭结构以形成CPCDs的荧光团，刚果红可以扩大CPCDs的π共轭结构域的尺寸以发射红色荧光，还可以提高合成CPCDs的水分散性/生物相容性。所获得的CPCDs在二甲基亚砜（DMSO）中呈现出激发独立/极性依赖性的荧光发射和高光致发光量子产率（PLQY≈40%），考虑到细胞微环境（如细胞器）相对疏水，极性依赖性荧光发射的性质表明CPCDs具有实现免洗荧光成像的潜力。此外，体外荧光成像结果也证实了CPCDs的实时、高质量和长期成像能力。为了进一步研究CPCDs用于体内成像的潜力，她们将CPCDs应用于斑马鱼和秀丽隐杆线虫（C.elegans）。值得注意的是，CPCDs首次在细胞水平上成功地可视化了斑马鱼的器官/流动血细胞。此外，秀丽隐杆线虫出色的核仁成像表明，精囊中的生殖细胞没有完整的细胞核，这种有趣的染色结果以前没有报道过。这些有趣的体内成像结果表明，CPCDs可以用作动态可视化两种活体模型动物的核仁结构的强大工具。此外，他们成功地利用CPCDs通过观察核仁的形态变化和细胞的荧光强度来可视化银离子（Ag+）对哺乳动物细胞的毒性。有趣的是，CPCDs还可以在器官水平（大脑和眼睛）上可视化Ag+对斑马鱼造成的其他看不见的损伤。因此，这种基于CDs介导的核仁成像策略在研究材料/药物体内毒性方面具有巨大潜力。![]()
Scheme
1. Schematic illustration of the fabrication of CPCDs and their use
for in vitro/in vivo nucleolus imaging and toxicity evaluation.
Scheme
1. CPCDs的制备示意图以及它们在体外/体内核仁成像和毒性评估中的应用。
2.结果与讨论
2.1 CPCDs的表征
如Scheme 1所示，以刚果红和pPDA为原料，采用水热法（200 °C，8 h）合成CPCDs。透射电子显微镜（TEM）结果（图1a）表明，获得的CPCDs在水溶液中分散良好，平均尺寸为5.6 ± 4.2 nm（图1b）。此外，CPCDs的高分辨率TEM显示晶格间距约为0.24 nm。由于刚果红的磺酸基团，制备的CPCDs带负电荷，zeta电位为-15.1 ± 3.8
mV（图1c）。为了探索CPCDs中的化学成分和官能团，进行了X射线光电子能谱（XPS）和傅立叶变换红外光谱（FTIR）实验。如图1d所示，完整的XPS曲线显示CPCDs由硫（S）、碳（C）、氮（N）、氧（O）和钠（Na）元素组成，原子百分比分别为6.4%、51.3%、11.4%、23.8%和7.1%。高分辨率C1s曲线揭示了C=C/C-C（284.5
eV）、C-S（285.1 eV）、C-N（285.5 eV）、C-O（285.8 eV）和C=O（288.7 eV）的存在（图1e）。N 1s中分析为399.2和401.1 eV成两个峰，分别代表吡啶型和石墨型N（图1f）。O 1s在530.9和532.1 eV包含两个峰，分别来自C=O和S=O/S-O/C-O（图1g）。S 2p带可分为168.9和170.2 eV的两个峰（图1h），分别代表-SO3和-SO4。在CPCDs的FTIR光谱中（图1i），在3670-3090 cm-1范围内观察到N-H和O-H键的拉伸振动。此外，通过对比刚果红和pPDA的FTIR光谱，可以发现CPCDs、刚果红和pPDA在3670-3090
cm-1（N-H和/或O-H伸缩振动）范围内表现出相似的吸收带，并在1629 cm-1（C=O伸缩振动）、1516 cm-1（C=C伸缩振动）和1280-1150
cm-1（C-N伸缩振动）处出现峰值。此外，CPCDs在1146和720 cm-1处显示两个峰，分别表明S=O/S-O/C-O和S-C的存在，这进一步证明了CPCDs中磺酸基团的存在。![]()
Figure 1. a) TEM image and b) corresponding size distribution
histogram of CPCDs. c) Zeta potential of CPCDs in PBS (10×10−3 M,
pH=7.4). d) Survey XPS curve of CPCDs and the high-resolution XPS patterns of
e) C 1s, f) N 1s, g) O 1s, and h) S 2p. i) FTIR spectrum of CPCDs.
图1. a) TEM图像和b) CPCDs相应的尺寸分布直方图。c) PBS（10×10−3 M，pH=7.4）中CPCDs的Zeta电位。d) CPCDs的XPS曲线和e) C 1s、f) N 1s、g) O 1s和h) S 2p的高分辨率XPS图案。i) CPCDs的FTIR光谱。
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Figure 2. a) UV–vis absorption spectrum of CPCDs (dispersed in
water, 20 µg mL−1 ). b) 3D fluorescence spectra and
excitation–emission contour plot of CPCDs (dispersed in water, 20 µg mL−1). c) Fluorescence (FL) emission spectra of CPCDs (dispersed in water, 20 µg mL−1) collected at different excitation wavelengths (460–520 nm). d) CIE
chromaticity diagram of CPCDs (dispersed in water, 20 µg mL−1 ). e)
Relative viabilities of A549 cells incubated with different concentrations of
CPCDs for 24 h.
图2. a) CPCDs（分散于水中，20 µg mL−1）的紫外可见吸收光谱。b) CPCDs（分散于水中，20 µg
mL−1）的3D荧光光谱和激发-发射轮廓图。c)在不同激发波长（460–520 nm）下采集的CPCDs（分散于水中，20 µg mL−1）的荧光（FL）发射光谱。d)
CPCDs（分散于水中，20 µg mL−1）的CIE色度图。e)与不同浓度的CPCDs孵育24 h后A549细胞的相对活力。
为了进一步研究CPCDs的光学性质，采集了紫外-可见（UV-Vis）吸收光谱和荧光光谱。根据紫外-可见吸收光谱（图2a），CPCDs在≈280 nm处显示吸收峰，这归因于芳香族C=C键的π-π*跃迁，在400-550
nm区域具有吸收带，该吸收带与C=N和C=O键的n-π*跃迁有关。为了研究CPCDs的荧光性质，分析3D荧光光谱，结果表明最佳激发波长为480 nm，相应的发射波长为630
nm（图2b）。由于其较大的斯托克斯位移（≈150 nm），当CPCDs应用于生物样品进行体内或体外成像时，可以大大避免背景噪声的干扰。同时，测量了CPCDs在不同激发波长下的发射光谱（图2c），发现CPCDs表现出与激发波长无关的荧光发射，这可能避免了与其他荧光探针可能产生的荧光重叠。此外，确定CPCDs的CIE坐标为（0.595，0.402），证实了CPCDs的红色发射（图2d）。对于荧光探针来说，良好的生物相容性是保证其良好成像性能的重要特征。这里。他们选择了A549（人肺癌细胞系）和L02（正常人肝细胞系）细胞通过MTT法测试了CPCDs的细胞相容性，图2e显示，在最高浓度（400 μg mL-1）下，细胞仍然存活（相对细胞活力≥95%），表明CPCDs具有良好的生物相容性。此外，还测量了CPCDs在不同溶剂（水、乙醇和DMSO）中的荧光光谱和绝对PLQYs。结果表明，CPCDs在DMSO（39.9%）中的PLQY高于在乙醇（18.9%）和水（2.7%）中的PLQY，这与相对PLQY非常一致。考虑到一些细胞微环境（如细胞器）相对疏水，CPCDs在极性较低的有机溶剂（DMSO和乙醇）中的PLQYs高于在水中的PLQYs，这表明CPCDs可能能够在细胞内实现免洗和高质量的荧光成像。![]()
Figure 3. a) Confocal fluorescence images of fixed A549 cells
costained by Hoechst 33342 (5 µg mL−1), SYTO RNASelect (1×10−6M), and CPCDs (50 µg mL−1) for 30 min. b) Intensity correlation
plots of Hoechst 33342 (blue) and CPCDs (red) channels in (a). c) Intensity
correlation plots of SYTO RNASelect (green) and CPCDs (red) channels in (a). In
(b) and (c), PCC means Pearson’s correlation coefficient, and OLC means overlap
coefficient. d) Line-scan FL intensity profiles of the marked region (the red
arrow) in (a). e) Confocal fluorescence images of fixed A549 cells after
continuous laser irradiation for different time periods (0, 3, 5, and 10 min).
The laser intensity was set as 30% of the laser output of the confocal
microscope, and the laser wavelengths used for CPCDs and SYTO RNASelect were
552 and 488 nm, respectively.
图3. a)用Hoechst 33342（5 µg mL−1）、SYTO RNASelect（1×10−6 M）和CPCDs（50 µg mL−1）共染色30 min后固定的A549细胞的共聚焦荧光图像。b)
(a)中Hoechst 33342（蓝色）和CPCDs（红色）通道的强度相关图。c) (a)中SYTO RNASelect（绿色）和CPCDs（红色）通道的强度相关图。在(b)和(c)中，PCC表示皮尔逊相关系数，OLC表示重叠系数。d) (a)中标记区域（红色箭头）的线扫描FL强度分布。e)固定的A549细胞在连续激光照射不同时间段（0、3、5和10 min）后的共聚焦荧光图像。激光强度设定为共聚焦显微镜激光输出的30%，CPCDs和SYTO RNASelect使用的激光波长分别为552 nm和488 nm。
2.2 体外核仁显像
为了探索CPCDs的生物成像潜力，将A549细胞与不同浓度的CPCDs（10、25、50和100 μg mL-1）在37 °C下孵育5 min。当浓度达到50 µg mL−1时，CPCDs实现了出色的免洗成像性能。为了研究CPCDs的细胞内定位，将CPCDs（50 μg mL-1）与A549细胞一起孵育，同时用Hoechst 33342（5 μg mL-1）染色10
min，结果显示CPCDs仅部分染色细胞核，这通过共定位实验进一步证实。根据先前的研究，基于pPDA的CDs具有核仁靶向能力。此外，较高的N元素含量对于实现材料和细胞中核仁的有效相互作用非常重要，刚果红进一步提高了CPCDs中的N元素含量，以提高CPCDs的核仁靶向能力。为了研究CPCDs在细胞核中的分布，选择了用于固定细胞核仁成像的商业染料SYTO
RNASelect进行共定位。考虑到SYTO
RNASelect只能对固定细胞染色，首先用甲醇固定A549细胞，再将Hoechst 33342（5 µg
mL-1）、SYTO
RNASelect（1×10−6M）和CPCDs（50 µg mL-1）与固定细胞孵育30 min。根据成像结果，CPCDs显示出与SYTO
RNASelect相似的分布（图3a），共定位测定证实CPCDs与SYTO
RNASelect共定位效果优于与Hoechst
33342的共定位（图3b, c）。此外，测量了合并图像中标记箭头的各通道的荧光信号，并且CPCDs也显示出与SYTO RNASelect相似的荧光信号（图3d）。上述结果证明，CPCDs可以在活细胞和固定细胞中实现免洗和高质量的核仁成像。为了研究CPCDs的光稳定性，将不同波长的连续激光照射（30%的激光输出）CPCDs和SYTO
RNASelect处理后的细胞上，照射不同时间。结果显示，SYTO
RNASelect在3 min后被显著猝灭，但CPCDs在连续激光照射下可以持续稳定地发出红色荧光（图3e），表明CPCDs比商业染料具有更好的光稳定性。为了研究CPCDs的长期成像能力，将A549细胞与50 µg mL−1 CPCDs一起孵育不同时间段（0.5、1、2、4、12和24 h）。之后，通过共聚焦显微镜分析CPCDs处理的细胞，并通过流式细胞术测量细胞相应的荧光强度。图4a中的共聚焦显微镜结果清楚地揭示了CPCDs可以实现至少24 h的稳定核仁成像，图4b中所示的流式细胞术结果得到验证。此外，从图4b可以看出，A549细胞对CPCDs的摄取在4 h后达到饱和。为了证实其通用的染色能力，将CPCDs应用于B16细胞（鼠黑色素瘤细胞系）、HPAEpiCs（人肺泡上皮细胞系）和L02细胞，这些细胞的核仁也被很好地染色。为了探索CPCDs的内吞途径，将A549细胞与5-(N,N二甲基)-盐酸阿米洛利（阿米洛利）（10 µg mL−1）、甲基-β-环糊精（MβCD）（5 mg mL−1）、盐酸氯丙嗪（CPZ）（5µg mL−1）和染料木黄酮（50 µg
mL−1）孵育。在用PBS洗涤后，将细胞与CPCDs（50 μg mL-1）一起孵育，然后通过流式细胞术测试这些细胞。图4c中的结果显示，与对照组相比，只有CPZ处理的细胞呈现降低的荧光强度，这揭示了CPCDs的摄取依赖于网格蛋白介导的内吞途径。总之，上述结果表明，CPCDs表现出通用成像能力（对于活细胞和固定细胞）、长期成像性能（至少24 h）和比商业染料（SYTO RNASelect）更好的光稳定性，这使它们成为核仁成像的极好荧光探针。![]()
Figure 4. a) Confocal fluorescence images and b) corresponding FL
intensities of A549 cells incubated with CPCDs (50 µg mL−1) for
different time periods (0.5, 1, 2, 4, 12, and 24 h). c) Relative uptake
efficiencies (based on the FL intensities) of A549 cells after various
treatments. Data are presented as mean ± standard deviation (n = 3) and
analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA) (*p<0.05).
图4. a)共聚焦荧光图像和b)用CPCDs（50 µg mL−1）孵育不同时间段（0.5、1、2、4、12和24 h）的A549细胞的相应FL强度。c)经过不同处理后A549细胞的相对摄取效率（基于FL强度）。数据以平均值±标准差（n=3）表示，并通过单因素方差分析（ANOVA）进行分析（*p < 0.05）。
2.3 体内核仁成像
根据先前的研究，红色荧光探针可以最大限度地减少组织背景自发荧光的干扰和对生物样品的光毒性。因此，红光CPCDs在体内荧光成像方面可能具有巨大潜力。本文选择斑马鱼和秀丽隐杆线虫作为成像对象，因为它们是生物和医学研究中常用的模式生物。2.3.1 斑马鱼
斑马鱼是一类重要的模式生物，因为它们的世代时间短，胚胎发育快，已被广泛用于药物毒性筛选和体内成像。根据以前的研究，人类和斑马鱼的基因组是相似的，一些与人类疾病相关的基因也存在于斑马鱼中。因此，在体内观察斑马鱼细胞的核仁有助于研究一些疾病的进展。为了更好地介绍实验结果，在图5a中提供了具有重要器官的斑马鱼的示意图。为了观察CPCDs的成像性能，将24/48
hpf（受精后数小时）斑马鱼胚胎在含有CPCDs（100 μg mL−1）的培养基中浸泡15
min，并在不洗涤的情况下拍摄共聚焦显微镜图像。绒毛膜是围绕斑马鱼成熟卵的无细胞包膜，可以防止外部物质进入胚胎，因此许多荧光染料无法穿透绒毛膜对斑马鱼胚胎进行染色。令人惊讶的是，图5b显示CPCDs可以穿透绒毛膜对斑马鱼胚胎进行染色（24
hpf），这一结果表明CPCDs具有监测斑马鱼胚胎早期发育阶段的能力。此外，孵化的斑马鱼（48 hpf）也被CPCDs很好地染色（图5b），这表明CPCDs出色的体内成像性能。![]()
Figure 5. a) Diagram of zebrafish. b) Confocal microscopic images
of zebrafish embryos (24 or 48 hpf) incubated with CPCDs (100 µg mL−1)
for 15 min.
图5. a)斑马鱼示意图。b)与CPCDs（100 µg mL−1）一起孵化15 min的斑马鱼胚胎（24或48
hpf）的共聚焦显微镜图像。
鉴于CPCDs对整条斑马鱼的成像性能良好，他们希望进一步探索使用CPCDs在细胞水平上可视化斑马鱼器官的可行性。斑马鱼的重要器官（如图5a所示）已被广泛研究。例如，斑马鱼在受伤后可以再生大脑，因此它是研究再生神经发生机制的有用模式生物，斑马鱼也成为研究人类眼睛发育和疾病的宝贵脊椎动物系统。因此，实现这些器官的高质量荧光成像将有利于相关研究。在此，将斑马鱼（48
hpf）在含有CPCDs（100 μg mL-1）的培养基中孵育15 min，并观察斑马鱼的不同部位。斑马鱼的头部被清楚地观察到（图6a中的箭头指示大脑区域），这证明了CPCDs优异的组织穿透能力。对于耳朵部分，耳朵的内部结构通过CPCDs可视化，两个耳石周围的细胞由箭头所示（图6b）。如图6c所示，眼睛也被CPCDs清楚地染色。引人注目的是，在眼球的放大图像中，眼球内的细胞也清晰可见。此外，还捕获了由圆圈标记的眼睛区域中的移动血细胞。这些结果表明，CPCDs可用于未来眼科/脑疾病和眼/脑发育的研究。如图6d所示，卵黄囊的表皮细胞被CPCDs清晰染色。有趣的是，当观察斑马鱼的鳍时，箭头所示的血细胞也被CPCDs染色（图6e）。为了动态跟踪流动的血细胞，在鳍区域采集了一段视频，其揭示了血细胞的精确运动轨迹。值得注意的是，血管中也有几个静止的血细胞。考虑到CPCDs在细胞水平上对不同器官中的高质量成像性能，他们认为CPCDs是染色斑马鱼结构和跟踪斑马鱼细胞运动的强大荧光探针。![]()
Figure 6. Confocal microscopic images of a) brain, b) ear, c) eye,
d) yolk sac, and e) fin in zebrafish (48 hpf) incubated with CPCDs (100 µg mL−1)
for 15 min. Brain: the three white arrows indicate the brain region. Ear: the
two white arrows indicate the cells surrounding the two otoliths. Fin: the two
white arrows in the enlarged fluorescence image indicate the flowing blood
cells.
图6. 斑马鱼（48 hpf）与CPCDs（100 µg mL−1）孵育15 min后的共聚焦显微镜图像，a）大脑、b）耳朵、c）眼睛、d）卵黄囊和e）鳍。大脑：三个白色箭头表示大脑区域。耳朵：两个白色箭头表示两个耳石周围的细胞。鳍：放大的荧光图像中的两个白色箭头表示流动的血细胞。
2.3.2 秀丽隐杆线虫
秀丽隐杆线虫是一种体长约1 mm（成虫体型）的线虫，其身体实质上时一种由消化道、角质层和表皮组成的管状体。秀丽隐杆线虫包括以下系统：消化系统、生殖系统、神经系统和排泄系统，身体的详细结构如图7a所示。秀丽隐杆线虫作为一种常用的模型动物，具有透明、快速生命周期（3 d）、短寿命（2-3周）、恒定的细胞数量、不变的发育轨迹和良好的基因组注释等优点，因此被广泛用于阿尔茨海默病、人类代谢调节、纳米毒理学、生物成像和基因组学的研究。在这项工作中，选择秀丽隐杆线虫作为评估CPCDs体内成像性能的代表性模型。首先，将野生型秀丽隐杆线虫在含有CPCDs（50 μg
mL-1）的M9缓冲液中孵育15 min，通过共聚焦显微镜观察处理过的秀丽隐杆线虫，无需洗涤。如图7b所示，秀丽隐杆线虫的长度约为1 mm，表明秀丽隐杆线虫是成年个体，图7c所示的荧光图像揭示了CPCDs令人满意的体内成像性能。值得注意的是，可以清楚地看到箭头所示的卵，因为只有这些卵不能被CPCDs染色（图7c）。此外，还收集了秀丽隐杆线虫不同部位的单细胞水平荧光图像。如图7d所示，秀丽隐杆线虫的咽部被清楚地染色，并且由箭头指示的一些“红点”被认为是神经元细胞或脂滴。为了鉴定“红点”，将另一条活的秀丽隐杆线虫通过CPCDs（50 µg mL−1）、Hoechst
33342（5 µg mL−1）和BODIPY 493/503（1 µg
mL−1）共染色15 min。在本文中，选择Hoechst 33342来确认细胞核的定位，并且BODIPY
493/503是用于脂滴染色的商业染料。结果显示，CPCDs仅与Hoechst 33342部分共定位，未显示与BODIPY
493/503共定位，这证明了CPCDs具有高效的核仁靶向能力以及对神经元细胞的成功染色。此外，近端性腺中箭头所示的生殖细胞的核仁被清晰染色（图7e）。此外，由虚线圆圈标记的大量“红点”的分布与脂滴的分布相似（图7e）。为了确认这些“红点”的定位，将秀丽隐杆线虫通过BODIPY
493/503和CPCDs进行共染色，合并的图像证明这些“红点”也不是脂滴，这进一步证实了CPCDs出色的选择性核仁染色能力。然而，在箭头所示的卵中未发现CPCDs的荧光信号（图7f），这表明卵可能对CPCDs具有抗性。如图7g所示，远端性腺中箭头所示的生殖细胞也被CPCDs清楚染色。![]()
Figure 7. a) Diagram of C. elegans. b–g) Confocal microscopic
images of wild-type C. elegans (adult) incubated with CPCDs (50 µg mL−1)
for 15 min. b) Bright field image, c) corresponding FL image of (b), d–g)
enlarged FL images of the different parts marked in (b).
图 7. a)秀丽隐杆线虫图。b–g)与CPCDs（50 µg mL−1）孵育15 min的野生型秀丽隐杆线虫（成年）的共聚焦显微镜图像。b)明场图像，c) (b)对应的FL图像，d–g) (b)中标记的不同部分的放大FL图像。
为了研究图7f中有趣的结果，用CPCDs（50 µg mL−1）、Hoechst
33342（5 µg mL−1）和BODIPY 493/503（1 µg
mL−1）对一条秀丽隐杆线虫染色15 min。观察秀丽隐杆线虫的子宫区域，并在BODIPY 493/503的通道中标记精囊和子宫（图8a）。令人惊讶的是，发现Hoechst 33342未能对精囊区域中箭头所示的生殖细胞进行染色（图8a）。这一有趣的结果表明，这些生殖细胞中没有完整的细胞核可能是由于有丝分裂/减数分裂，并且这种成像结果以前从未观察到过。此外，由箭头指示的子宫外层中的细胞也通过CPCDs和BODIPY 493/503染色（图8a）。根据这些结果可以推测，外层可能阻止CPCDs进入子宫，因此卵没有被CPCDs染色（图7c, f）。然后，为了进一步研究图7e的圆圈中大量“红点”的分布，用CPCDs、Hoechst
33342和BODIPY
493/503对一条秀丽隐杆线虫进行染色。如图8b所示，Hoechst 33342对肠细胞的细胞核成功染色，并且在细胞核内也观察到CPCDs的荧光信号，表明核仁的定位。有趣的是，合并图像中的箭头位置发现几个“红点”围绕着细胞核（图8b）。根据之前的文献，这些“红点”与人类细胞中的卡哈尔体或核仁周围区相似。此外，箭头所指的表皮细胞的核仁被CPCDs清晰染色，而只有两个细胞核可以被圆圈标记的Hoechst
33342清晰地染色（图 8c）。根据上述成像结果，CPCDs因其高选择性和突出的穿透能力，可以清楚地显示活体动物中一些“看不见”的结构。![]()
Figure 8. Confocal microscopic images of a) uterus region, b) body
part, and c) epidermal cells in C. elegans stained by CPCDs (50 µg mL−1),
Hoechst 33342 (5 µg mL−1), and BODIPY 493/503 (1 µg mL−1)
for 15 min.
图8. 用CPCDs（50 µg mL−1）、Hoechst 33342（5 µg mL−1）和BODIPY
493/503（1 µg mL−1）染色15 min的秀丽隐杆线虫a)子宫区域、b)身体部位和c)表皮细胞的共聚焦显微镜图像。
2.4 基于CPCDs的核仁成像用于药物/材料体内毒性评估
最近，越来越多的具有特定性质和功能的药物/材料已经被制备用于各种生物医学应用。在临床试验之前，这些药物/材料应进行仔细的体内生物相容性评价。虽然毒性预测的最佳标准仍然是哺乳动物毒性研究，但昂贵且耗时的体内试验限制了传统哺乳动物毒性评估的进一步应用。由于斑马鱼的成本效益高、繁殖力强、发育阶段特征明确和光学过性等优点，人们已经开发了基于斑马鱼的分析用于毒理学研究。通常，斑马鱼与药物/材料一起孵育一定时间，然后测量斑马鱼的孵化率/存活率，以判断这些药物/材料的毒性。此外，荧光成像技术也被应用于可视化药物/材料对斑马鱼的毒性，因为它们可以更直观地揭示由这些药物/材料引起的细胞变化。此外，一些研究侧重于可视化斑马鱼伤口愈合过程的动态变化。然而，基于核仁荧光成像的斑马鱼毒性评估策略尚未被报道。在此，银（Ag）被选为进行基于核仁荧光成像的斑马鱼毒性评估的模型药物/材料，因为其在生物医学领域如抗菌和抗肿瘤治疗中广泛应用。具体来说，将不同浓度（0、3、6、12.5、25和50 µg mL−1）的Ag+（以AgNO3的形式）与L02细胞孵育进行MTT测定，发现≥ 6 µg
mL−1的Ag+表现出严重的细胞毒性。此外，使用CPCDs（50 μg
mL-1）对用Ag+（0、3、6、12.5、25和50 μg mL-1）预处理24 h的L02细胞进行染色，然后通过共聚焦显微镜观察细胞，并通过流式细胞术测量细胞相应的荧光强度。共聚焦图像显示，Ag+（≥ 6 μg mL-1）处理的细胞呈现出比健康细胞更高的CPCDs荧光强度（图9a），这通过相应的流式细胞术结果得到证实（图9b）。结合MTT结果，可以推测细胞被Ag+（≥ 6 µg mL−1）损伤/杀死，从而使CPCDs容易进入细胞。为了观察Ag+处理细胞的详细形态和荧光变化，将L02细胞与Ag+（25 µg mL−1）和CPCDs（50 µg mL−1）共孵育不同时间段，并使用活细胞成像系统进行观察。结果显示，由于Ag+的毒性，箭头所示的细胞核边界在15 min后变形，并且细胞质在15 min后呈现出增加的荧光信号（图9c）。为了研究细胞质中红色荧光染色结构的组成，通过SYTO
RNASelect和CPCDs对用Ag+（25 µg
mL-1）预处理24 h的L02细胞进行了共染色，结果显示，红色荧光细胞质成分含有RNA，这些RNA可能来自细胞凋亡过程中受损的细胞核。为了探索Ag+的体内毒性，将斑马鱼胚胎与不同浓度（0、12.5、25和50 µg mL−1）的Ag+孵育不同时间。记录斑马鱼的孵化率/存活率，Ag+（≥ 25 μg mL−1）对斑马鱼胚胎表现出严重毒性（图10a, b）。具体来说，根据图10a, b中的结果，当应用浓度为12.5 μg mL-1时，Ag+似乎是安全的。然而，当Ag+（12.5 µg
mL−1）处理的斑马鱼通过CPCDs染色时，发现由圆圈标记的区域（在大脑中）显示出大量的“红点”（图10c），并且这些点具有比周围健康细胞更强的荧光信号。此外，随着Ag+浓度的增加，越来越多的区域出现由圆圈标记的“红点”，并且当Ag+的应用浓度达到50 μg mL−1时，在眼睛中也发现了许多“红点”（图10c）。根据体外结果（图9a, b），与健康细胞相比，Ag+处理的细胞呈现更强的荧光信号。因此，可以确认这些“红点”是由Ag+引起的死亡/损伤细胞，并且该结果证明Ag+（12.5 μg mL-1）也表现出明显的体内毒性，而传统指标（孵化/存活率）无法揭示这一点。为了更好地证明这种毒性评估策略的有效性，在大脑区域的放大图像中在死亡细胞（亮红点）及其周围的健康细胞上画一个白色箭头，以量化荧光强度。Ag+（12.5和25 µg mL-1）处理的斑马鱼中的死细胞（亮红点）显示出显著的荧光与对照组（0 µg mL−1）相比的信号变化，证实了脑损伤。有趣的是，在相同浓度的Ag+下，大脑区域比眼睛区域表现出更严重的损伤（图10c），这可能表明大脑中Ag+的富集，最终导致斑马鱼的死亡。他们相信基于CPCDs的核仁染色策略将成为评估药物/材料在体内毒性的一种新颖而重要的方法。![]()
Figure 9. a) Confocal fluorescence images and b) corresponding FL
intensities of L02 cells stained by CPCDs (50 µg mL−1) for 5 min.
The L02 cells were pretreated with Ag+ (0, 3, 6, 12.5, 25, and 50 µg
mL−1) for 24 h. For b), data are presented as mean ± standard
deviation (n = 3) and analyzed by one-way analysis of variance (ANOVA) (****p
< 0.0001). “ns” stands for nonsignificant difference. c) Real-time and in
situ confocal fluorescence images of L02 cells treated with Ag+ (25
µg mL−1) and CPCDs (50 µg mL−1). The cells were recorded
at 37 °C using a live cell imaging system. The arrows indicate the
morphological change of the nucleus.
图 9. a)共聚焦荧光图像和b)用CPCDs（50 µg mL−1）染色5 min的L02细胞的相应FL强度。用Ag+（0、3、6、12.5、25和50 µg
mL−1）预处理L02细胞24 h。对于b），数据表示为平均值±标准差（n = 3）并通过单因素方差分析（ANOVA）（****p<0.0001）进行分析。“ns”代表无显著差异。c)用Ag+（25 µg mL−1）和CPCDs（50 µg mL−1）处理的L02细胞的实时和原位共聚焦荧光图像。使用活细胞成像系统在37 °C下记录细胞。箭头表示细胞核的形态变化。
3. 结论
总之，以刚果红和pPDA为原料，通过一步水热法制备了一种核仁靶向红光发射碳点（CPCDs）。研究发现CPCDs的最佳激发波长为630 nm，荧光发射是激发波长独立性且具有极性依赖性、良好的生物相容性/水分散性/光稳定性以及在DMSO中的高绝对PLQY（≈40%），并且可以实现各种活体动物细胞中核仁的免清洗、实时和高质量成像。重要的是，CPCDs实现了活细胞的长期（24 h）核仁成像，并且比商业染料（SYTO
RNASelect）具有更好的光稳定性，商业染料只能染色固定的死细胞。为了进一步探索CPCD在体内成像中的潜力，将其应用于活斑马鱼和秀丽隐杆线虫。CPCDs由于其优异的光致发光特性和组织穿透能力，首次在细胞水平上实现了活斑马鱼的高质量核仁成像。具体来说，CPCDs可以清楚地显示器官，尤其是大脑和眼睛，这些以前未获得的细胞/组织/器官成像结果可以指导斑马鱼相关的研究。此外，CPCDs还表现出高超的秀丽隐杆线虫核仁成像性能，神经元和表皮细胞的核仁成像可能有利于秀丽隐杆线虫表皮相关形态发生运动的研究。引人注目的是，发现精囊中的生殖细胞没有完整的细胞核，这一尚未报道的有趣染色结果可能有助于秀丽隐杆线虫发育的研究。此外，他们提出了一种基于CPCDs的核仁染色方法来评估药物/材料的体内毒性，与传统的毒性指标（孵化率/存活率）相比，这种新策略可以可视化斑马鱼大脑/眼睛中看不见的损伤（由Ag+引起）。他们相信红光发射的CPCDs可以作为许多生物医学应用的杰出荧光探针，特别是活斑马鱼/秀丽隐杆线虫的体内成像。秀丽隐杆线虫和药物/材料的体内毒性评估。阅读这篇文章，更新了我们对碳点的理解。本文所展示的碳点应用是更加全面，更加专业，让我们对碳点的未来充满信心。本文中的这些实验过程非常详细，值得我们借鉴和学习。对班马鱼和秀丽隐杆线虫这两种实验模型有了更全面的了解，通过这两个实验模型，可以解决很多科学问题。
个人简介：
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廖成霜，2632704939@qq.com
