纳米技术的进步通过将不同类型的天然生物分子（如核酸、蛋白质和脂质）组装成直径为1-100
nm的纳米颗粒（Nanoparticles:
NPs）。这些生物纳米材料构成了纳米医学应用的基础，例如靶向递送、基因调控、分子诊断和免疫调节。为了在这些应用中实现最佳性能，必须将NPs有效地递送至目标器官、组织和细胞。促进NPs递送的合理方法是在与生物系统的基本相互作用（或纳米生物相互作用）中详细和全面地理解。严格的纳米生物研究可以为解决与NPs低效和非特异性递送相关的瓶颈提供机制方面的见解，从而促进纳米药物的临床应用。细胞膜由阴离子磷脂双分子层构成，阳离子脂质体和脂质具有高效穿透细胞膜的能力，因此阳离子NPs是治疗性药物进入细胞的常规载体。然而，阳离子NPs往往会引起细胞毒性和免疫反应，这可能会阻碍它们的临床应用。与阳离子NPs相反，非阳离子NPs（无论它们在表面电荷上是接近中性的还是负的）通常表现出更高的生物相容性，但进入哺乳动物细胞的数量要少得多。有趣的是，一些类型的非阳离子NPs表现出高生物相容性和细胞摄取特性，这些特征对于细胞内递送具有吸引力。在这篇文章中，香港中文大学蔡宗衡教授团队介绍了他们对非阳离子生物纳米材料与细胞相互作用（或纳米细胞相互作用）的研究。首先，他们介绍了使用近中性聚乙二醇包被的NPs探索两个很少被提到的物理化学参数对细胞摄取的作用，即对细胞施加压力（compression）和对NPs进行烷基化（alkylation）。接下来，作者又介绍了两种典型的阴离子生物纳米材料（DNA包被和聚多巴胺（PDA）包被的NPs）与细胞的相互作用，这两种材料能有效地进入哺乳动物细胞，并在过去十年中得到了广泛的应用。在他们基于细胞的研究中，剖析了细胞内运输的途径，决定细胞摄取的途径蛋白和NPs的运输过程。他们进一步探讨了NPs在患病动物模型的各种器官和组织中的细胞水平分布的定量分析。他们的结果为实现NPs有效地在细胞内递送的重要设计准则，甚至可能指导其探索纳米医学领域，例如使用DNA包被的NPs靶向动脉粥样硬化斑块和PDA包被的等离子体纳米虫光热杀死癌细胞。最后，他们提出了通过还原论方法阐明纳米-生物相互作用的观点，强调更密切地关注官能团的作用，并对NPs的细胞器水平分布和NPs在体内分布的遗传基础进行更精细的研究。相关内容于2019年，以“Nano−Cell
Interactions of Non-Cationic Bionanomaterials”为题发表在“Accounts of Chemical Research (IF=16.4)”上，本文的第一作者是香港中文大学博士后何乐为。![]()
1. 背景介绍
纳米-生物相互作用是一门涉及阐明NPs和生物系统之间基本相互作用的学科。根据在Web of
Science的关键词搜索，在过去的二十年里，纳米-生物相互作用的出版物数量增加了100倍。纳米-生物相互作用对纳米药物的发展至关重要，因为它不仅提供了对基于NPs的药物载体设计的见解，以及表明了NPs的健康和环境风险。对纳米生物相互作用的理解不足，在一定程度上导致研究工作与治疗性NPs的临床转化之间存在巨大差距。他们研究小组在了解NPs如何在不同的生物长度尺度上与细胞相互作用（或纳米细胞相互作用）有很大的兴趣。对于体外研究，他们探索了控制细胞摄取（细胞水平）、细胞内运输途径（细胞器水平）的NPs的生物物理化学因素，以及决定NPs的细胞摄取和运输（遗传水平）的途径蛋白。为了确定体外数据是否可应用于体内，他们开始研究NPs在动物模型的各种器官中的组织水平和细胞水平分布。为了解剖纳米细胞相互作用，通常使用金NPs（AuNPs）作为模型材料。AuNPs可以定制为特定的尺寸和形状，并承受各种类型和数量的表面修饰。此外，可以通过透射电子显微镜（Transmission
Electron Microscopy: TEM）直接可视化其亚细胞定位，并通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）轻松确定其与细胞的关联程度。NPs用于纳米细胞研究的一个特性是在含血清的生物流体中的胶体稳定性。NPs可以用长的生物相容性聚合物链[如聚乙二醇（PEG）]包被，因为PEG可以通过空间位阻稳定NPs。虽然PEG具有接近中性的表面电荷，但密集PEG包被的NPs（每nm2 NPs表面负载密度高于1条PEG链）不容易在培养基和细胞内聚集或分解。致密的PEG包被层还显著抑制血清蛋白在NPs表面的吸附，减少吞噬细胞的非特异性摄取，提高靶向细胞表面受体的特异性。因为PEG包被的NPs不会大量进入大多数细胞类型，他们的机制研究通常包括PEG包被的NPs作为阴性对照。在本报告的第2节中，他们使用PEG包被的AuNPs（PEG-AuNPs）作为基准来评估两个很少探索的设计参数对细胞摄取的影响，分别是对细胞施加压力和对NPs进行烷基化。另一种稳定NPs的方法是用阳离子或阴离子材料包被它们，通过静电排斥防止NPs聚集。聚阳离子脂质体或脂质NPs是基因递送的有效纳米载体，因为它们能够使用静电将核酸[如质粒DNA和小干扰RNA（siRNA）]凝聚成弱阳离子NPs，弱阳离子NPs比未复合的核酸更有效地穿透阴离子细胞膜。然而，阳离子NPs往往会损害细胞膜的完整性，引起细胞毒性和免疫反应，这可能会阻碍临床应用。与阳离子NPs相反，非阳离子NPs（阴离子、近中性或两性离子）通常表现出更高的生物相容性，但细胞摄取明显较低，这可能是由于细胞膜引起的静电排斥。有趣的是，有两种类型的非阳离子NPs可以在没有阳离子或亲脂性转染剂帮助下有效地进入哺乳动物细胞，这是纳米医学文献中的一个非常规特征。第一种类型的NPs带有与已知细胞表面受体结合的非阳离子配体。如携带甘露糖和半乳糖的聚合物NPs（分别具有总中性电荷和靶向甘露糖受体和半乳糖受体的能力）进入巨噬细胞的量是无糖聚合物NPs（也接近中性）的10-20倍。带负电荷的核糖核蛋白NPs，由前列腺特异性膜抗原（PSMA）的配体2-[3-(1,3-二羧基丙基)脲]戊二酸（DUPA）组成，与PSMA阳性前列腺癌细胞的结合效率比不含DUPA的核糖核蛋白NPs高2个数量级。第二类非阳离子NPs在细胞内应用的初始点不含已知靶向能力的配体。尽管DNA包被的NPs在十多年前就被用于基因调节和分子诊断，但直到Choi等人在2013年证明DNA包被的NPs与A类清道夫受体（SR-A）结合，才对控制其细胞进入的受体进行全面研究。同样，聚多巴胺（PDA）包被的NPs在2010年被用于癌细胞的体外成像和体内图像引导的光热癌症治疗，决定PDA包被的NPs进入细胞的途径仅在2017年报道，而参与其内吞作用的受体仍然难以捉摸。注：A类清道夫受体（Class
A scavenger receptor: SR-A）是一种主要表达于巨噬细胞的模式识别受体,在机体的自然免疫中发挥重要作用。SR-A还与多种疾病的发生密切相关,其调控的异常是许多重要疾病的重要病理生理学基础。SR-A主要以吞噬多种多样的配体而实现自身的功能。
他们的研究小组热衷于探索缺乏已知靶向能力配体的非阳离子NPs如何进入细胞。在这篇文章中，他们还介绍了对三类代表性纳米粒子的纳米细胞相互作用的机理研究（图1a），即近中性烷基封端的PEG-AuNPs（第2节）、阴离子DNA包覆的纳米粒子（第3节）和阴离子PDA包覆的纳米粒子（第4节）。他们在第5节中总结了他们对纳米生物相互作用的观点。![]()
Figure 1. (a) This Account features three classes of non-cationic
bionanomaterials that abundantly enter mammalian cells, including
alkyl-PEGcoated NPs, DNA-coated NPs, and PDA-coated NPs. (b) Association of
PEG-AuNPs, dodecyl4%-PEG-AuNPs, T30-AuNPs, and PDA-AuNPs to
different cell types after 24 h of incubation, keeping the NP core diameter and
NP concentration constant at 20 nm and 1 nM, respectively. Dodecyl4%denotes the loading of 4 mol % of dodecyl chains in the PEG shell. T30 denotes
an oligonucleotide with 30 repeating thymidines. The stability of these NPs in
cell culture medium was confirmed by dynamic light scattering and UV−vis
spectrophotometry.
图1. (a)本报告以大量进入哺乳动物细胞的三类非阳离子生物纳米材料为主，包括烷基-聚乙二醇包被的NPs、DNA包被的NPs和PDA包被的NPs。(b)孵育24 h后，PEG-AuNPs、dodecyl4%-PEG-AuNPs、T30-AuNPs和PDA-AuNPs与不同细胞类型的关联，使NP核直径和NP浓度分别保持在20 nm和1 nm。“dodecyl4%”表示在PEG壳层中装载了4 mol
%的十二烷基链。T30表示具有30个重复胸腺嘧啶的寡核苷酸。通过动态光散射和紫外-可见分光光度法证实了这些NPs在细胞培养基中的稳定性。
2. 聚乙二醇包被纳米颗粒
在过去十年中，使用机械力促进细胞摄取NPs（如流动诱导的剪切应力和超声微泡）已经获得了相当大的关注。然而，对细胞施加压力对细胞摄取NPs的影响仍不清楚，这可能是由于缺乏可行的实验装置在细胞摄取过程中施加压力。2018年，他们报道了细胞外压力作为促进PEG包被的NPs细胞内递送的新物理参数。具体来说，他们采用自动化微机械系统将规定水平的压缩应变（ε）施加到琼脂糖凝胶上，然后琼脂糖凝胶将~70和~200
Pa之间规定量的压缩应力（σzz）传递到凝胶下的单层C2C12成肌细胞（图2a）。在将PEG-AuNPs以相同浓度引入培养基和凝胶内部后，证实压缩不会导致NPs从凝胶严重泄漏到培养基中。值得注意的是，在不会严重降低细胞活力的情况下，发现140
min的细胞外压缩显著提高了20 nm以下的PEG-AuNPs与细胞的结合高达5倍（图2b）。共聚焦成像数据显示，尺寸为13 nm的PEG-AuNPs进入压缩细胞的量明显高于未压缩细胞（图2c）。最佳σzz随NPs大小的增加而单调增加。此外，他们讨论了压力对摄取途径的影响。RNAi-介导的网格蛋白重链（Clhc）的基因敲除显著减弱了NPs与压缩细胞的结合，但仅适度降低了NPs与未压缩细胞的结合（图2d），表明网格蛋白介导的内吞作用仅在细胞被施加压力的状态时是主要途径，并且压缩会导致“纳米细胞”相互作用的细微变化。虽然他们基于施加压力的递送方法需要相当复杂的仪器，但它提供了对生物力学和纳米细胞相互作用的新见解。他们观察到的C2C12细胞的压力效应是否适用于肌肉骨骼系统中其他细胞类型（如成肌细胞和软骨细胞），还需要额外的研究来验证。由于细胞膜的硬度不同，其他细胞类型在NPs大小和σzz上可能表现出不同的细胞摄取特性。通常，细胞特征的内在差异可能导致纳米细胞相互作用的变化。就细胞性别而言，量子点进入女性人羊膜干细胞比男性细胞更有效，但它们进入从男性唾液腺分离的原代成纤维细胞比女性受试者更有效。就细胞周期而言，聚苯乙烯NPs在肺癌细胞的G2/M期进入肺癌细胞最多，其次是S和G0/G1期。就细胞表型而言，具有M2样表型的单核细胞衍生的巨噬细胞和Kuffer细胞比具有M1样表型的细胞摄取AuNPs更多。最后，就细胞起源而言，巨噬细胞对聚苯乙烯NPs的摄取显著高于癌上皮细胞。![]()
Figure 2. Promoting the intracellular delivery of PEG-AuNPs via compression.
(a) A slab of hydrogel containing NPs of different core diameters is placed on
top of myoblasts. An indenter is applied on top of the gel to exert defined
levels of compressive strain (ε), which transmits compressive stress to the
cells. Culture medium containing NPs is added to the dish. (b) Quantification
of cellular association as a function of ε and NP diameter by ICP-MS. (c)
Confocal imaging shows higher entry of Cy5-labeled NPs into compressed cells
than uncompressed cells. (d) Genetic knockdown of Clhc attenuates the cellular
association of NPs with and without compression.
图2. 通过压力促进PEG-AuNPs的细胞内递送。(a)在成肌细胞顶部放置一块含有不同核直径的NPs的水凝胶板。在凝胶顶部施加压痕以施加规定水平的压应变（ε），从而将压应力传递给细胞。在培养皿中加入含有NPs的培养基。(b) ICP-MS定量细胞关联与ε和NPs直径的关系。(c)共聚焦成像显示cy5标记的NPs进入压缩细胞的频率高于未压缩细胞。(d)基因敲低Clhc会减弱NPs在压缩和不压缩下的细胞关联。
用生物分子修饰NPs是一种增强细胞内递送的方法。例如，Choi等人证明，将转铁蛋白分子（癌细胞过表达的转铁蛋白受体的配体）修饰到PEG-AuNPs上超过临界量是实现体内肿瘤内癌细胞递送所必需的。最近，他们从生物分子水平扩展到官能团水平，并开始对使用非阳离子官能团增强细胞摄取感兴趣。烷基在用于纳米医学应用的生物纳米材料中含量丰富，例如用于分子成像的磷脂包被的量子点和用于基因递送的脂质NPs。以前，研究人员将与细胞膜的疏水相互作用作为细胞摄取含烷基NPs的机制，然而他们将NPs视为单一的疏水实体，而没有解决其烷基如何决定细胞摄取。2017年，他们通过制备“烷基封端的聚乙二醇化AuNPs（烷基-PEG-AuNPs）”，研究了烷基化如何促进PEG包被的NPs的细胞摄取，该AuNPs由AuNP核、致密的PEG壳和PEG壳上具有确定碳链长度（n）和PEG壳上负载密度的烷基组成（图3a）。为了解耦烷基化和疏水性的影响，他们通过将PEG壳中烷基链的总质量分数限制在0.2%以内，比脂质体或脂质NPs低2个数量级，使整体NPs在很大程度上保持亲水性。值得注意的是，将十二烷基（n=12）或十八烷基（n=18）基团结合到PEG壳中，在孵育24小时后，五种不同哺乳动物细胞类型的摄取提高10倍至800倍，但他们没有检测到含有己基（n=6）基团或不含烷基的PEG-AuNPs的摄取明显增加（图1b和3b）。由于PEG包被的NPs不会大量进入细胞，他们得出结论，烷基-PEG-AuNPs强大的细胞进入能力主要源于烷基化，而不是疏水性。虽然药理学抑制（图3d）和基因敲低图3e）方法显示烷基-PEG-AuNPs的摄取不是由网格蛋白、小窝或动力蛋白介导的，但TEM图像显示，烷基-PEG-AuNPs主要通过丝状体介导的途径进入Kera-308细胞，这一点可以通过它们与细胞膜突起的关联得到证明，细胞膜突起相互交错以触发细胞摄取的内陷的形成（图3c）。对于致密的PEG壳，烷基-PEG-AuNPs的NPs核不会在含血清的培养基中不可逆地聚集，并在孵育24 h后保持单分散在细胞质、晚期核内体和溶酶体中（图3f）。在整个24 h观察时间窗内，15%的NPs持续积累在细胞质（图3g），证实了PEG包被的NPs在细胞质中积累的报道。烷基PEG-AuNPs具有强大的细胞摄取、细胞内稳定性和胞质积累，代表了一个有吸引力的细胞内递送平台。后续将继续使用“官能团-PEG-AuNP”平台来剖析其他官能团对纳米细胞相互作用的影响。注：基因敲低是将基因表达水平下调，而不涉及靶基因DNA本身的变化，基本是不可遗传的。
![]()
Figure 3. Effect of alkylation on the nano−cell interactions of
PEG-AuNPs. (a) Tuning alkylation by adjusting the fractional loading and length
of alkyl chains on the PEG shell. (b) At a constant alkyl loading of 4%,
dodecyl-PEG-AuNPs and octadecyl-PEG-AuNPs enter four different cell types more
than methoxy-PEG-AuNPs and hexyl-PEG-AuNPs. (c) TEM images depict filopodia-mediated
endocytosis. (i, ii) Tip engagement (arrow) and formation of invaginations
(asterisk). (iii) Cellular entry. (d) Pharmacological blocking analysis. (e)
RNAi-mediated genetic knockdown analysis. (f) Intracellular trafficking of
dodecyl4%-PEG-AuNPs. (g) Localization of dodecyl4%-PEG-AuNPs
in the cytosol.
图3. 烷基化对PEG-AuNPs纳米细胞相互作用的影响。(a)通过调整PEG壳上烷基链的分数负载和长度来调节烷基化。(b)烷基负载恒定为4%时，十二烷基-PEG-AuNPs和十八烷基-PEG-AuNPs比甲氧基-PEG-AuNPs和己基-PEG-AuNPs更多地进入四种不同的细胞类型。(c) TEM描绘丝状体介导的内吞作用。(i, ii)尖端接合（箭头）和内陷形成（星号）。(iii)细胞进入。(d)药理阻断分析。(e) RNAi介导的基因敲低分析。(f) dodecyl4%-PEG-AuNPs的细胞内转运。(g) dodecyl4%-PEG-AuNPs在细胞质中的定位。
3. DNA包被的纳米颗粒
由于DNA寡核苷酸的致密层附着在AuNPs的表面，尽管DNA-AuNPs带有多阴离子电荷，但仍可大量进入细胞。例如，具有20 nm
Au核和T30寡核苷酸（具有30个重复胸腺嘧啶）的DNA-AuNPs进入三种细胞类型的数量是具有相同大小Au核的PEG-AuNPs的300-480倍（图1b）。Choi等人之前使用基因敲除来证明DNA-AuNPs主要通过靶向SR-A的小窝介导的摄取进入C166内皮细胞。2016年，鉴于文献中报道的不一致，他们小组使用DNA-AuNPs来阐明NPs几何形状和受体靶向对细胞摄取的综合影响。一些研究人员指出，细胞内化纳米球比纳米棒更多，但另一些研究人员认为，通过更有效地结合细胞表面受体，靶向纳米棒比靶向纳米球更容易地进入细胞。他们制备了四种不同纵横比（ARs）的AuNPs，范围从1到7，但体积相似（图4a），一组AuNPs包被T30寡核苷酸用于靶向SR-A，另一组包被PEG链作为非靶向对照。而PEG-AuNPs与C166细胞的结合程度随着AR的增加而单调降低，但较短的DNA包被的纳米棒（AR=2）与细胞的关联程度高于纳米球（AR=1）和较长的DNA包被的纳米棒（AR=4或7）（图4b）。在用岩藻聚糖（一种SR-A的配体）预处理后，较长的DNA包被的纳米棒比DNA包被的纳米球和短纳米棒表现出细胞结合急剧减少（图4c），这表明受体靶向在摄取长靶向纳米棒中的重要性。通过TEM成像，他们提供了靶向纳米棒进入细胞多长时间的直接证据。它们以近乎平行的方式排列在细胞膜上，然后旋转90°以垂直穿过细胞膜（图4d），随后主要运输到晚期内核体，而不进入溶酶体（图4e）。这些数据将有利于需要靶向各向异性NPs的应用，如分子成像和光热疗法。![]()
Figure 4. Effects of AR and DNA coating on the nano−cell
interactions of Au nanorods. (a) PEG-AuNPs and DNA-AuNPs of a similar Au mass
per NP but different ARs. Each DNA strand contains 30 thymidines (denoted T30).
(b) Association of PEG-coated and DNA-coated nanorods to endothelial cells. (c)
Pharmacological blocking analysis. (d) Longer DNA-coated nanorods align
themselves to the cell membrane and then rotate by ∼90°
to cross the cell membrane. (e) Longer DNA-coated nanorods accumulate in late
endosomes but not lysosomes.
图4. AR和DNA包覆对金纳米棒纳米细胞相互作用的影响。(a)每个NPs具有相似Au质量但ARs不同的PEG-AuNPs和DNA-AuNPs。每条DNA链含有30个胸腺嘧啶（记为T30）。(b)聚乙二醇包被和DNA包被纳米棒与内皮细胞的关联。(c)药理阻断分析。(d)较长的DNA包被纳米棒与细胞膜对齐，然后旋转约90°以穿过细胞膜。(e)较长的DNA包被纳米棒在晚期核内体而不是溶酶体中积累。
为了转变对DNA包被的NPs的体外思路，他们研究了DNA包被是否能促进体内NPs的细胞摄取。最初，他们通过将T30寡核苷酸连接到PEG包被的SPIONs上来制备DNA包被的超顺磁性氧化铁NPs（DNA-SPIONs）（图5a），结果表明，DNA-SPIONs比PEG-SPIONs更容易地进入RAW264.7细胞，DNA-SPIONs主要通过SR-A进入RAW264.7细胞。这一观察结果证实了他们对C166细胞DNA包被纳米棒的工作和早期的报告，该报告表明巨噬细胞对多阴离子NPs的摄取高于中性NPs。注意到动脉粥样硬化斑块中巨噬细胞的丰度和巨噬细胞SR-A的高表达，他们假设外部DNA涂层促进了NPs向动脉粥样硬化斑块的递送。为了验证他们的说法，他们将DNA-SPIONs和PEG-SPIONs注射到载脂蛋白E敲除（ApoE-/-）小鼠（一种已建立的动脉粥样硬化模型）中，然后在多个生物长度尺度上跟踪SPIONs的体内分布。在器官水平上，近红外荧光成像显示，注射后30 min，DNA-SPIONs在心脏和主动脉（ApoE-/-小鼠斑块的主要部位）中的明显定位，但没有发现PEG-SPIONs（图5b）。通过ICP-MS分析，DNA-SPIONs的主动脉铁含量在注射后2 h达到峰值（~60% ID/g），但PEG-SPIONs需要8 h才能达到峰值量（~44% ID/g）。在组织水平上，他们的共聚焦成像数据显示DNA-SPIONs比PEG-SPIONs更丰富地递送到斑块，如在主动脉根部巨噬细胞的区域中DNA-SPIONs的荧光斑块比PEG-SPIONs更大（图5c）。在细胞水平上，他们的流式细胞术证明，注射0.5和2 h后，DNA-SPIONs与主动脉M2巨噬细胞的关联比PEG-SPIONs与更大（图5d），这与他们对RAW264.7巨噬细胞的体外数据一致。他还检测到DNA-SPIONs与脾巨噬细胞、脾树突状细胞和肝内皮细胞的相关性高于PEG-SPIONs。这项工作是DNA纳米结构靶向动脉粥样硬化斑块的首次应用，与许多含有肽、脂蛋白和糖的基于NPs的动脉粥样硬化斑块的载体相反。正在进行的功效研究需要使用核酸包被的NPs来递送siRNA，以调节与动脉粥样硬化形成相关的基因的表达。![]()
Figure 5. Promoting the intravenous delivery of NPs to
atherosclerotic plaques by DNA coating. (a) PEG-SPION and DNA-SPION. Each DNA
strand contains 30 thymidines (denoted T30). (b) Ex vivo near-infrared
fluorescence imaging and ICP-MS measurements of Cy5.5-labeled SPIONs in the
heart and aorta of apolipoprotein E knockout (ApoE−/−) mice with
atherosclerotic plaques (organ-level distribution). (c) Immunofluorescence
images of the aortic root show the tissue-level distribution of SPIONs. (d)
Flow histograms show the cellular-level distribution of SPIONs in the liver,
spleen, and aorta.
图5. DNA涂层促进NPs静脉输送至动脉粥样硬化斑块。(a) PEG-SPIONs和DNA-SPIONs，每条DNA链含有30个胸腺嘧啶（记为T30）。(b)载脂蛋白E敲除（ApoE−/−）小鼠心脏和主动脉中Cy5.5标记的SPIONs的离体近红外荧光成像和ICP-MS测量（器官水平分布）。(c)主动脉根部的免疫荧光图像显示SPIONs在组织水平上的分布。(d)流式直方图显示SPIONs在肝脏、脾脏和主动脉的细胞水平分布。
4. 聚多巴胺包覆的纳米颗粒
PDA由多巴胺（DA）在碱性条件下的聚合，是一种用于包被不同类型基底（包括NPs）的粘合材料。PDA包被的纳米粒子的主要优点是（1）它们具有吸附额外生物分子和纳米级构件的粘合性，用于构建结构复杂的生物纳米材料，以及（2）尽管它们带有阴离子电荷，但它们进入细胞具有高能力。在粘附性方面，利用PDA涂层的金（Au）和银（Ag）NPs作为粘附核心材料，通过逐层组装构建具有多个Fano共振和局部场热点的同心等离子体纳米壳。通过实验和模拟表征了同心纳米壳的光学性质。在进入细胞时，携带20 nm
Au核的PDA包被的AuNPs（PDA-AuNPs）进入三种细胞类型的数量是具有相同尺寸Au核的PEG-AuNPs的100-400倍（图1b）。注：Fano共振：在物理学中，法诺共振（Fano
resonance）是一种会产生非对称线形的散射共振现象。背景和共振散射之间的干涉产生一种非对称的线形。
通过利用PDA包被的NPs的两个优势，他们团队在2015年联合报道了使用DNA吸附的PDA-AuNPs检测微小RNA（miRNAs）作为活体人间充质干细胞（hMSCs）分化的特异性标记。他们的纳米探针需要一个带有荧光标记发夹DNA链（hpDNAs）的PDA-AuNPs吸附有荧光标记的（图6a）。这些hpDNAs可识别细胞内的特定miRNA靶点，并增强hMSCs对PDA-AuNPs的摄取（图6b），hMSCs是一种很难转染的细胞类型。PDA-AuNPs核在荧光hpDNAs遇到靶miRNA之前猝灭。与靶标结合释放hpDNAs并导致荧光恢复。他们的纳米探针支持在经历成骨分化的hMSCs中无创检测miR-29b（骨形成的标志物），但不支持未分化的hMSCs（图6c）。细胞内荧光在孵育后持续5天，避免了再用新鲜纳米探针补充hMSCs以捕获长期细胞内事件的需要，如分化。他们的纳米探针揭示了干细胞生物学的见解，并催化了干细胞转化为再生疗法。![]()
Figure 6. DNA-adsorbed, PDA-coated gold nanoprobe (hpDNA-PDA-AuNP)
for tracking stem cell differentiation. (a) Definition sketch of the nanoprobe.
(b) Association of PDA-AuNPs and hpDNA-PDA-AuNPs with human mesenchymal stem
cells (hMSCs). (c) Confocal images of living hMSCs treated with nanoprobe
targeting miR-29b show time-dependent expression of miR-29b (green) during
osteogenic differentiation.
图6. HpDNA-PDA-AuNP用于跟踪干细胞分化。(a)纳米探针的定义示意图。(b) PDA-AuNPs和hpDNA-PDA-AuNPs与人间充质干细胞（hMSCs）的关联。(c)靶向miR-29b的纳米探针处理的活hMSCs的共聚焦图像显示成骨分化过程中miR-29b（绿色）的时间依赖性表达。
许多合成方案采用完全不同的聚合时间和DA量，可能产生具有不同PDA壳厚度和粘附程度的NPs。2018年，通过制备聚合时间和DA浓度跨越2个数量级的PDA-AuNPs，他们发现这两个反应参数对于控制PDA-AuNPs的形态、蛋白质吸附和细胞摄取至关重要（图7a）。经过几个小时的聚合，对于所有测试的DA浓度，PDA-AuNPs大多表现为随机聚集体（图7b）。在聚合2天或更长时间后，用最佳浓度的DA制备的PDA-AuNPs几乎单分散，然而用过量的DA涂覆柠檬酸盐包被的AuNPs触发它们组装成“纳米蠕虫”。血清蛋白的吸附可防止PDA-AuNPs在培养基中的随机聚集，并有助于进入细胞而不是与细胞膜结合。液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）分析显示，随着DA浓度的增加，PDA-AuNPs的蛋白质冠中白蛋白含量减少，血红蛋白亚基含量增加（图7c）。随着聚合时间从数小时增加到数天，细胞对PDA-AuNPs的细胞摄取量显著下降（图7d）。他们的数据支持PDA包被的NPs可重复制备，在细胞内应用中产生更可靠的性能。总的来说，除了NPs的物理化学特性外，血清培养条件也影响蛋白质冠的分布。温度影响结合到氧化铁NPs上的蛋白质的类型和数量，在37和41 °C之间的生理相关窗口中最敏感。当在梯度血浆而不是非梯度血浆中孵育时，吸附到聚苯乙烯和二氧化硅NPs上的小分子量蛋白质（<25 kDa）的量会减弱。最后，来自患有不同疾病和医疗状况（如乳腺癌、普通感冒和糖尿病）的人类受试者血浆的蛋白质以不同的量吸附到聚苯乙烯和二氧化硅NPs上，从而产生了“个性化蛋白质冠”的概念。![]()
Figure 7. Nano−Cell interactions of PDA-AuNPs. (a) PDA-AuNPs
prepared by different dopamine (DA) concentrations and polymerization times.
(b) TEM images show the morphological diversity of PDA-AuNPs. (c)
Polyacrylamide gel electrophoresis of the adsorbed serum proteins. (d) Cellular
association.
图7. PDA-AuNPs与细胞的相互作用。(a)不同多巴胺（DA）浓度和聚合时间制备的PDA-AuNPs。(b)TEM显示了PDA-AuNPs的形态多样性。(c)吸附血清蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳。(d)细胞相互作用。
最近，他们利用他们发现的自组装PDA包被的金纳米虫（PDA-AuNWs）来探索它们的细胞内的应用（图8a）。通过能量色散X射线光谱（EDX），他们证明了他们的组装方法也支持从柠檬酸盐封端的AgNPs制备PDA-AgNWs和双金属PDA-Au/Ag
NWs。DA的质子化伯胺和儿茶酚基团具有通过氢键和静电吸引与柠檬酸根离子相互作用的能力，对DA介导的组装至关重要。通过等离子体核心，他们的PDA-AuNWs散射可见光并吸收近红外（NIR）光（图8b）。通过PDA外壳，它们进入HeLa细胞的次数是未组装的PDA-AuNPs的8倍，并作为完整的实体垂直穿过细胞膜，主要通过大胞饮作用（图8c, d）。TEM图像显示相当一部分PDA-AuNWs不定位细胞内区室（图8e），表明它们作为治疗或成像分子的载体具有吸引力。共聚焦图像显示，在孵育后24 h，游离吲哚菁绿（ICG）染料分子显著存在HeLa细胞的晚期内体或溶酶体中，而固定在PDA-AuNWs表面的ICG染料则没有（图8f）。此外， TEM图像没有描述等离子体NW结构在细胞内的剧烈分解（图8e），这对于等离子体激元驱动的应用，包括暗场散射成像（图8g）和癌细胞的光热杀伤（图8h）来说是一个明显的优势。这是首次报道DA作为等离子体NPs组装的分子触发器和围绕纳米链构建保护壳的成分的双重作用。我们的DA介导的组装方法克服了等离子体纳米链在细胞内应用相关的障碍，例如低生物相容性、低效的细胞摄取和细胞内分解。![]()
Figure 8. PDA-coated plasmonic NWs. (a) DA-mediated assembly of
citrate-capped AuNPs and/or silver NPs into NWs and formation of an outer PDA
shell under alkaline conditions. (b) PDA-AuNWs via DA-mediated assembly
effectively absorb NIR light. (inset) Scanning electron microscopic (top) and
dark field (DF) scattering image (bottom) of an individual NW. (c) Association
of PDA-AuNWs and unassembled PDA-AuNPs with HeLa cells. (d) Pretreatment with
amiloride (an inhibitor of micropinocytosis) suppressed cellular association of
PDA-AuNWs. (e) TEM images of cells incubated with PDA-AuNWs for 2 and 24 h. (f)
Confocal micrographs of cells treated with ICG-adsorbed PDA-AuNWs or free ICG
molecules. (g) DF scattering micrographs of cells incubated with PDA-AuNWs and PDA-AuNPs.
(h) Viability staining (calcein, green) of cells irradiated by an 809 nm laser
for 5 min at 4 W/cm2 with or without prior treatment with PDA-AuNWs for 24 h.
图8. PDA包被的等离子体NWs。(a)在碱性条件下，DA介导柠檬酸盐包被的AuNPs和/或AgNPs组装成NWs，并形成PDA外壳。(b)通过DA介导组装的PDA-AuNWs有效吸收近红外光。插图：单个NW的扫描电子显微镜（上）和暗场（DF）散射图像（下）。(c) PDA-AuNPs和未组装的PDA-AuNPs与HeLa细胞的相互作用。(d)阿米洛利预处理（一种微胞饮抑制剂）抑制了PDA-AuNWs的细胞关联。(e)与PDA-AuNWs孵育2和24 h的细胞的TEM。(f)与吸附了ICG的PDA-AuNWs或游离ICG分子处理的细胞的共聚焦显微图像。(g)与PDA-AuNWs和PDA-AuNPs孵育的细胞DF散射显微图。(h)细胞活力染色（钙黄蛋白，绿色），809 nm激光以4 w/cm2照射5 min，事先用或不事先用PDA-AuNWs处理24 h。
5. 总结和展望
他们已经描述了他们对三种非阳离子生物纳米材料的纳米细胞相互作用的机理研究，这些材料大量穿过多种细胞类型的阴离子细胞膜，包括烷基封端的PEG包被的NPs、DNA包被的NPs和PDA包被的NPs。从这些研究中，他们确定了实现最佳细胞内递送的材料设计参数，包括烷基-PEG-AuNPs的烷基链长度和DNA-AuNPs的纵横比。在某些情况下，他们的机制研究甚至引导其探索了纳米医学应用，例如使用DNA包被的纳米粒子靶向动脉粥样硬化斑块内的巨噬细胞，以及使用PDA包被的等离子体纳米粒子光热杀死癌细胞。这些例子说明了理解纳米生物相互作用以及机理研究和实际应用之间的相互作用的优点。虽然这里主要使用AuNPs作为核心材料，但可从他们的机制研究中获得的知识将有利于纳米医学应用，这些应用涉及使用其他组合物的NPs核心，前提是NPs显示烷基封端的PEG、DNA或PDA涂层，例如用于体外刺激巨噬细胞的DNA涂层聚合物NPs和用于体内成像和光热消融肿瘤细胞的PDA涂层碳酸锰NPs。将PEG、DNA和PDA涂层到各种类型的NPs核或基底上的方法现已在文献中牢固确立。提倡用还原论的方法来研究纳米生物相互作用。从纳米材料的角度来看，呼吁缩小到官能团水平，因为现在大多数研究仍停留在NPs水平（例如，尺寸和表面电荷）和生物分子水平（例如，生物分子的类型和负载密度）（图9a）。在第2节中，他们描述了烷基-PEG-AuNPs的设计，用于解耦疏水性和烷基化对NPs细胞摄取的作用（图3）。类似的问题也适用于其他类别的生物纳米材料。例如，胺和儿茶酚基团在PDA包被的NPs进入细胞中的作用是什么？哪一个有助于DNA包被的NPs与SR-A、DNA主链中的磷酸基团或核碱基的胺基团结合？通过筛选各种类型的天然生物分子，将鉴定具有所需纳米细胞特征（例如，高细胞进入和细胞内稳定性）的官能团。筛选工作将丰富我们对纳米生物相互作用的分子理解，并将性能最佳的官能团合理组装成合成生物分子（和纳米粒子）以用于纳米医学应用铺平道路。从生物学的角度来看，呼吁对NPs的细胞器水平分布进行更精细的研究，这超越了分析由共定位系数提供的细胞共焦图像的传统实践（图9b）。由于超分辨率成像支持以50 nm的XY分辨率描绘细胞内细胞器，它可以捕获相似物理尺寸的单个NPs。三维（3D）电子断层扫描将告知不同类型细胞器中NPs的精确数量和位置，以及运输过程中不同细胞器大小的变化。这些先进的成像数据将提供NPs细胞内命运的整体描述。此外，他们邀请纳米医学界在遗传水平上剖析体内纳米生物相互作用，注意到最先进的研究已经定量描述了NPs在各种器官中的细胞水平分布，如肝脏和动脉粥样硬化斑块（图5）。最近使用基因组编辑来确定稳定蛋白-2作为斑马鱼内皮细胞从血液循环中去除阴离子纳米粒子的受体，这是沿着还原论方向的一个令人鼓舞的发展。我期待斑马鱼的这些遗传水平见解在未来转化为高等动物。注：还原论或还原主义（英语：Reductionism，又译化约论），是一种哲学思想，认为复杂的系统、事物、现象可以将其化解为各部分之组合来加以理解和描述。
![]()
Figure 9. A reductionist approach to elucidating nano−bio
interactions. (a) From a nanomaterial perspective, we call for attention to the
roles of functional groups. (b) From a biology perspective, we advocate the
studying of the interactions at the organelle and genetic levels.
图9. 一个简化的方法来阐明纳米-生物相互作用。(a)从纳米材料的角度来看，呼吁关注官能团的作用。(b)从生物学的角度，提倡从细胞器和遗传水平研究相互作用。
![]()
廖成霜
邮箱：xhu.lcs2xl@foxmail.com
主要学习工作经历：
2018年09月-2022年06月 西华大学理学院化学专业本科学习
2022年09月-至今 西华大学理学院生物与医药专业
