2019年，东南大学吴富根教授等在对苯二胺（p-phenylenediaminep, pPDA）的水热处理过程中通过加入不同的金属离子，可以形成发射波长高达700 nm的荧光碳点（CDs）。引人注目的是，虽然金属离子在合成具有不同QY的CDs中起着至关重要的作用，但在形成的CDs中却没有金属离子，即得到的CDs是无金属的，金属离子在CDs形成过程中起着类似于“催化剂”的作用。此外，本文以pPDA和镍离子（Ni2+）为原料，制备了具有最高QY的Ni-pPCDs，并表现出各种优异的荧光特性，包括非激发依赖性发射，良好的光稳定性，极性敏感和核酸响应性。体外和体内实验表明，Ni-pPCDs具有很高的生物相容性，可以实现对小鼠和斑马鱼的细胞核实时、免洗、高分辨率成像和高对比度成像。相关成果于2019年以Nucleolus-Targeted Red Emissive Carbon
Dots with PolaritySensitive and Excitation-Independent Fluorescence Emission:
High Resolution Cell Imaging and in Vivo Tracking为题发表在ACS Appl. Mater. (IF = 8.3)上，第一作者为东南大学的Hua, Xian Wu。1. 背景
虽然在优化红光发射CDs的荧光发射方面已经取得了巨大的进展，但繁琐的纯化步骤、激发依赖性荧光、水分散性差和/或不能靶向特定细胞器仍然是难题。迄今为止，只有少数报道关注CDs的特异性细胞器靶向能力。例如，Liu等开发了溶酶体靶向CDs，并实现了甲醛的比例成像，在此之前，该团队还制备了两种类型的荧光CDs用于线粒体和细胞核成像。由于在制备时加入金属往往可以使CDs的一些基本性质得以改变，故而探索CDs与金属离子的相互作用已成为一个热点，如金属离子的检测和含金属纳米材料的制备。对于前者，由于CDs的表面官能团不同（可能来自不同的碳源），它们对金属离子表现出不同的亲和力，并且CDs与金属离子之间的相互作用通常导致CDs的荧光猝灭。对于后者，通过CDs和Cu2+在水溶液中的相互作用合成了两种非荧光含铜制剂，用于有效的癌症治疗。此外，进一步研究了不同金属离子对水热法制备CDs的影响，出乎意料的是，获得了一系列非荧光金属掺杂纳米材料。以上两个探索方面共同指出，金属离子的加入可以削弱CDs的荧光。迄今为止，很少有研究报道金属离子对CDs QYs的增强作用，这仍然是一个有待探索的研究领域。此外，各种有机分子和无机纳米材料（特别是量子点）分别因其高QY和光稳定性而被广泛应用于STED（Stimulated Emission Depletion Microscopy, STED）显微镜①。然而，有机分子的光稳定性差（限制了长期成像），无机纳米材料中重金属元素的潜在毒性均仍然严重阻碍了它们的STED成像应用。事实上，具有高QYs、不依赖于激发和长波发射、理想的细胞摄取和独特的细胞定位的CDs可以成为亚细胞细胞器STED成像的优秀候选人。注：① 受激发射损耗显微术（STED）是一种有效的光学超分辨方法。通过引入一束损耗光以受激发射的方式来抑制有效荧光的发射，STED可以实现超衍射极限的分辨率。
2. CDs的制备与表征
在本研究中，发现通过水热处理pPDA或pPDA-Ag+、pPDA-Cu2+、pPDA-PtCl42-、pPDA-Fe3+、pPDA-PdCl42-和pPDA-Ni2+的二元混合物可以制备出具有不同QYs的红发射CDs，所得到的CDs分别被称为pPCDs、Ag-pPCDs、Cu-pPCDs、Pt-pPCDs、Fe-pPCDs、Pd-pPCDs和Ni-pPCDs（scheme1）。令人吃惊的是，上述所有CDs都不含金属元素，这保证了它们具有良好的生物相容性。此外，CDs的不同QY表明这些不同的金属离子对CDs的结构产生不可缺少但又不同的影响。pPCDs在DCM、DMSO和水中的QY分别为23.7%、15.8%和0.6%。相比之下，Ni-pPCDs在DCM中表现出最高的QY，为64.9%，DMSO为45.6%，水中为1.2%，而Ag-pPCDs在DCM中表现出最低的QY，为2.3%，DMSO为1.6%，水中为0.1%。其中，Ni-pPCDs的红色荧光QY最高，达到45.6%（在DMSO中），并且具有良好的水分散性和光稳定性、激发无关和极性响应的荧光发射以及核仁靶向性能等优点，使其能够实现核仁的高质量STED成像。上述结果表明，这些CDs在两种有机溶剂（DCM和DMSO）中的荧光发射比在水中强得多，并且这些CDs在DCM中的QYs最高，这表明溶剂极性也影响了这些CDs的荧光性质。接下来，选择了Ag-pPCDs（QY最低）、pPCDs（不含金属离子合成）和Ni-pPCDs（QY最高）作为三种典型的CDs进行进一步研究。如图1a-g所示，Ag-pPCDs、pPCDs和Ni-pPCDs的尺寸分别为2.0 ± 0.4、2.5 ± 0.5和2.9 ± 0.5 nm，这些CDs的zeta电位分别为26.3 ± 2.5、25.3 ± 1.5和23.7 ± 2.1 mV，表明较大的尺寸和较低的表面电位可能有利于获得更高的QY。![]()
Scheme 1.
Schematic Illustrating the Synthetic Methods of a Series of Red Emissive CDs
(Au/Cu/Pt-pPCDs, pPCDs, and Fe/ Pd/Ni-pPCDs) and Bioimaging Applications
(Including the STED-Based Nucleolar Imaging in Mammalian Cells and in Vivo
Imaging in Tumor-Bearing Mice and Zebrafish) Using Ni-pPCDs.
Scheme 1. 利用Ni-pPCDs合成一系列红光发射CDs（Au/Cu/Pt-pPCDs、pPCDs和Fe/Pd/Ni-pPCDs）及其生物成像应用（包括基于STED的哺乳动物细胞核仁成像和肿瘤小鼠和斑马鱼体内成像）的示意图。
这些CDs的紫外-可见吸收光谱（图1h）显示出在204、243和286 nm处有三个尖峰和一个以510 nm为中心的宽带。前三个峰来自芳香C=C键的π−π*跃迁，后一个峰来自C=N、C-N-C、C=O和C-O键的n−π*跃迁。三种CDs的傅里叶红外光谱显示，所有样品在3430~3090 cm-1的吸收带归属于N-H和/或O-H拉伸振动，峰值位于1275~1260 cm-1是源于C-N拉伸振动而1165~1130 cm-1归因于C-O拉伸振动。此外，Ni-pPCDs在1632和1517 cm-1处有两个峰，pPCDs在1644和1517 cm-1处有两个峰，Ag−pPCDs在1608和1484 cm-1处有两个峰，表明这三种CDs中存在C=O、N−H和C=C（C=C键来源于pPDA的苯环）。此外，Ni-pPCDs比pPCDs表现出更高的C=O拉伸振动吸收，表明氧化程度的增加伴随着更高的QY。![]()
Figure 1.
Characterization of CDs. (a−c) TEM images and (d−f) corresponding size distribution
histograms of Ag-pPCDs, pPCDs, and Ni-pPCDs. (g) Zeta potential histogram, (h)
UV−vis absorption spectra, and (i) FTIR spectra of the three kinds of CDs.
图1. CDs的表征。(a−c) Ag-pPCDs、pPCDs和Ni-pPCDs的TEM图像和(d−f) 相应尺寸分布直方图。(g) 三种CDs的Zeta电位直方图，(h) 紫外-可见吸收光谱，(i) 红外光谱。
利用X射线光电子能谱进一步研究了CDs的化学结构和组成。图2a、2e和2i所示在~285 eV（C1s）、~398 eV（N1s）和~532 eV（O1s）处存在三个典型峰。令人惊讶的是，在Ag-pPCDs（图2a）和Ni-pPCDs（图2i）的曲线中，没有发现Ag或Ni元素，验证了所得CDs的无金属特性。在高分辨率能谱中，Ag-pPCDs/pPCDs/Ni-pPCDs的C1s波段可以拟合成284.5/284.5/284.5、285.6/285.5/285.5和288.4/287.2/287.4
eV三个峰，分别对应于sp2碳（C−C/C=C）sp3碳（C−N/C−O）和羰基碳（C=O）（图2b、2f和2j）。Ag−pPCDs/pPCDs/Ni−pPCDs的N1s波段可以拟合为398.1/398.4/398.3、399.6/399.6/399.3和401.4/401.1/400.9
eV三个峰，分别代表C-N-C、N-C和N-H（图2c、2g和2k）。O1s波段包含两个峰，分别位于531.0/530.8/531.0和532.2/532.6/532.4
eV，分别来自C=O和C−O/O−H（图2d、2h和2l）。同时，288.4/287.2/287.4 eV处的峰值强度从Ag-pPCDs逐渐增加到pPCDs，再到Ni−pPCDs，表明CDs中羰基含量相应增加。此外，在O1s高分辨率曲线中，pPCDs和Ni-pPCDs的C=O含量高于Ag-pPCDs，表明Ni-pPCDs和pPCDs的表面氧化程度更高，这可能会导致更多的表面缺陷。众所周知，尺寸、表面状态和交联增强发射效应是决定相应CDs荧光性质的主要因素。对于Ni-pPCDs，与之前报道的Fe3+催化形成红发射CDs类似，在水热反应过程中加入的Ni2+也可能作为“催化剂”促进Ni-pPCDs的形成。如图1和图2所示，与Ni2+制备的CDs相比，不含金属离子制备的CDs和用其他金属离子（如Ag+）制备的CDs尺寸更小，氧含量更低，这表明Ni2+在CDs形成过程中不可或缺。因此提出Ni2+离子可以与原料（pPDA）的官能团（即伯胺基）发生强的配位相互作用，形成Ni2+-pPDA网络，NiCl2溶液、pPDA溶液以及NiCl2和pPDA混合溶液的不同颜色证明了这一点。形成的Ni2+-pPDA网络可以形成更大的具有延伸碳核的CDs，交联增强了CDs的荧光发射，并提高了相应CDs的表面氧化程度，这有利于CDs的荧光发射。因此，更大的尺寸、更高的表面氧化程度和交联增强的发射效应是Ni-pPCDs的QYs显著增加的原因。![]()
Figure 2. XPS
curves of (a−d) Ag-pPCDs, (e−h) pPCDs, and (i−l) Ni-pPCDs, including survey
scans (a, e, and i) and the high-resolution XPS peaks of C 1s (b, f, and j), N
1s (c, g, and k), and O 1s (d, h, and l), respectively.
图2. (a−d) Ag-pPCDs、(e−h) pPCDs和(i−l) Ni-pPCDs的XPS曲线，包括全扫描（a、e、i）和C1s（b、f、j）、N1s（C、g、k）和O1s（d、h、l）的高分辨率XPS峰。
3. 活细胞/固定细胞的核仁成像
由于Ni-pPCDs具有较高的QY，因此选择它作为进一步研究的对象。如图3a所示，Ni-pPCDs具有独特的与激发波长无关的荧光发射，发射范围为535~700 nm，可以在很大程度上避免与其他荧光染料的荧光干扰，在STED成像中具有很大的应用前景。荧光结果与CIE（Commission Internationale de l´Eclairage, CIE）色坐标（0.58, 0.42）相对应（图3b），进一步证明了Ni-pPCDs的红色发射。此外，Ni-pPCDs在pH值为3~10或不同浓度（0~1000 mM）NaCl溶液中也表现出良好的荧光稳定性（Em=605 nm）。考虑到Ni-pPCDs可能存在的极性依赖性荧光发射，还收集了Ni-pPCDs在水、三氯甲烷（TCM）、DCM、DMSO、乙醇和甲醇等不同溶剂中的荧光发射光谱。结果表明，在500 nm处激发的荧光表现出蓝移发射（从红色发射到绿色发射），并且荧光强度在溶剂中呈随极性递减的趋势（溶剂极性顺序为：水 > 甲醇 >乙醇 >
TCM > DCM）。虽然DMSO的极性大于乙醇和甲醇，但CDs在DMSO中的荧光强度高于其他两种溶剂，这可能是由于CDs在DMSO中的分散性较好。此外，当CDs从水溶液转移到更疏水的细胞内环境时，其荧光强度增加，CDs的这种极性响应荧光发射特性对其实现免洗荧光成像非常重要。接下来，文章探索了Ni-pPCDs的细胞内定位。用Ni-pPCDs（5 μg/mL）处理A549细胞在0.5、1、2、4、6、9、12和24 h后，对处理后的细胞进行免洗共聚焦成像和流式细胞术分析。结果显示，核仁在每个时间点都被亮红色荧光照亮，这可以解释为CDs在核仁中的选择性积累和/或CDs在核仁中的分散性提高导致其荧光开启。染色细胞的荧光强度首先急剧增加，在4 h达到最大，然后保持稳定，表明CDs的快速和大量的细胞摄取。此外，当孵育时间固定为30 min时，细胞对Ni-pPCDs的摄取随着CDs浓度的增加而增加。为了研究核仁成像机制，进行了Ni-pPCDs和SYTO RNASelect（一种商用核仁成像染料）②的染色实验。首先，用Ni-pPCDs和SYTO RNASelect同时处理活细胞30 min。图3c和3d的结果显示，Ni-pPCDs用鲜红色荧光染色核仁，然而，SYTO RNASelect不能染色活细胞的核仁，这严重限制了其在实时核仁跟踪中的应用。随后，在固定细胞上进行了Ni-pPCDs和SYTO RNASelect的染色实验。如图3e和3f所示，依次用Ni-pPCDs和SYTO RNASelect染色的固定细胞的细胞核中红色荧光信号（来自Ni-pPCDs）与荧光强度相当的绿色荧光信号（来自SYTO RNASelect）很好地重叠。然而，当SYTO RNASelect和Ni-pPCDs同时染色或先用SYTO RNASelect再用Ni-pPCDs染色固定细胞时，核仁的红色荧光强度远低于绿色荧光强度，表明Ni-pPCDs和SYTO RNASelect与核仁发生了竞争性相互作用。上述结果表明，Ni-pPCDs与SYTO RNASelect具有相同的核仁成像机制——RNA与Ni-pPCDs/SYTO RNASelect的选择性结合导致核仁内两种染料的荧光“开启”。注：② 核仁是在细胞核内存在的非膜结构体，是进行核糖体RNA转录的位置。SYTO RNASelect Green荧光细胞染料是一种细胞通透性核酸染料，可选择性标记RNA。在不结合核酸的情况下，SYTO RNASelect染料几乎不发荧光，与RNA结合后会发出明亮的绿色荧光，与DNA结合后会发出微弱的荧光信号。SYTO RNASelect染料可用于检测核仁，并可结合DAPI等核染料复染细胞。
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Figure 3. (a)
Fluorescence emission spectra of Ni-pPCDs (dispersed in water; 20 μg/mL)
collected at different excitation wavelengths (420−620 nm). (b) CIE
chromaticity diagram of Ni-pPCDs dispersed in water. (c) Confocal images of
live A549 cells simultaneously treated with Ni-pPCDs and SYTO RNASelect for 30
min. (d) Line-scan fluorescence intensity profiles of the marked region (the
white arrow) in c. (e, g, and i) Confocal images of fixed A549 cells costained
by Ni-pPCDs and SYTO RNASelect with different staining procedures: Fixed cells
in e were sequentially stained with Ni-pPCDs (30 min) and SYTO RNASelect (30
min); fixed cells in g were simultaneously treated with Ni-pPCDs and SYTO RNASelect
for 30 min; fixed cells in i were sequentially stained with SYTO RNASelect (30
min) and Ni-pPCDs (30 min). (f, h, and j) Line-scan fluorescence intensity
profiles of the marked regions (the white arrows) in e, g, and i.
图3. (a) Ni-pPCDs（20 μg/mL分散在水中）的荧光发射光谱；(b) 分散在水中的Ni-pPCDs的CIE色度图。(c) 同时用Ni-pPCDs和SYTO RNASelect处理A549活细胞30 min的共聚焦图像。(d) c图中标记区域（白色箭头）的线扫描荧光强度谱。(e, g, i) 用Ni-pPCDs和SYTO RNASelect分别用不同染色方法染色固定A549细胞的共聚焦图像：e中的固定细胞依次用Ni-pPCDs（30 min）和SYTO RNASelect（30 min）染色；g中的固定细胞同时用Ni-pPCDs和SYTO RNASelect处理（30 min）；i中分别用SYTO RNASelect （30 min）和Ni-pPCDs（30 min）对固定细胞进行染色。(f, h, j) e, g, i中标记区域（白色箭头）的线扫描荧光强度分布图。
4. CDs和DNA/RNA之间的相互作用
考虑到细胞核中大多数RNA（尤其是rRNA）聚集在核仁中（核仁中也含有一些DNA），进一步评估了Ni-pPCDs的核仁靶向机制。首先，研究了DNA/RNA消化对Ni-pPCDs细胞定位的影响。先对A549细胞用脱氧核糖核酸酶处理，然后用Ni-pPCDs和SYTO RNASelect对其染色发现仍然可以染色核仁，与细胞核中的其他区域形成明显的对比（图4a），表明DNA酶切的影响可以忽略不计。与此相反，先用核糖核酸酶处理细胞，再用Ni-pPCDs或SYTO RNASelect固定/渗透后，核仁区不能被清晰地染色，这归因于核仁中RNA含量的减少。为了进一步评价Ni-pPCDs对RNA/DNA结合的荧光响应，测量了加入RNA或DNA前后Ni-pPCDs分散体的荧光。为了比较，还测量了SYTO RNASelect溶液加入RNA或DNA前后的荧光。如图4b和4c所示，Ni-pPCDs和SYTO RNASelect对两种核酸均有荧光“开启”反应，且两种试剂与RNA结合后的荧光增强高于与DNA结合后的荧光增强。Ni-pPCDs对RNA和DNA的不同荧光响应可能是由于两种核酸的结构差异，从而影响了带正电的CDs和带负电的核酸之间的静电相互作用。综上所述，得益于其极性敏感和选择性RNA响应的荧光特性，Ni-pPCDs在进入疏水细胞内环境时，特别是进入核仁时，显示出高度增强的荧光发射，在核仁中，它们可以与RNA结合并发出强荧光。因此，Ni-pPCDs可以成功地在活的哺乳动物细胞中实现免洗和选择性核仁靶向成像。![]()
Figure 4. (a)
Confocal images of A549 cells before (control) and after treatment with DNase
(25 μg/mL) or RNase (25 μg/mL) at 37 °C for 2 h. Before imaging, cells were
fixed by methanol, permeabilized by 0.5% Triton X-100, and costained by Ni-pPCDs
(5 μg/mL, Ex 552 nm), SYTO RNASelect (1 μM, Ex 488 nm),
and Hoechst 33342 (5 μg/mL, Ex 405 nm) for 15 min. (b and c)
Fluorescence spectra of Ni−pPCDs (5 μg/mL, Ex 500 nm) and SYTO
RNASelect (1 μM, Ex 488 nm) in water, RNA solution, or DNA solution
(RNA or DNA concentration: 150 μg/mL).
图4. （a）在37 ℃下用DNase（25 μg/mL）或RNase（25 μg/mL）处理2 h之前（对照）和之后的A549细胞的共聚焦图像。在成像之前，用甲醇固定细胞，用0.5% Triton X-100透化，并用Ni-pPCDs（5 μg/mL，EX 552
nm）、SYTO RNASelect（1 μM，EX 488nm）和Hoechst 33342（5 μg/mL，Ex405nm）共染色15 min。(b和c) 在水、RNA溶液或DNA溶液（RNA或DNA浓度：150 μg/mL）中的Ni-pPCDs（5 μg/mL，EX 500nm）和SYTO RNASelect（1 μM，EX 488nm）的荧光光谱。
5. Ni - pPCDs的光稳定性和内吞机制
如图5a和5b所示，在552 nm连续激光照射1 h后，Ni-pPCDs的红色荧光仍然很亮（>原始强度的65%）。相比之下，SYTO RNASelect在488 nm激光照射1 h后，其绿色荧光强度明显下降至原始强度的16%。以上结果证实了Ni-pPCDs优异的抗光漂白性能，确保了其长期荧光成像应用的适用性。考虑到Ni-pPCDs的高细胞摄取效率，也研究了它们的细胞内化途径。通常，有四种类型的内吞作用，包括巨胞吞作用、网格蛋白介导的内吞作用（Clathrin-mediated endocytosis, CME）、小窝蛋白介导的内吞作用（caveolae-mediated endocytosis, CvME）和脂筏介导的内吞作用（lipid-raft-mediated endocytosis, LrME)。文章评估了4 °C（抑制能量供应）和4种内吞抑制剂③对Ni-pPCDs细胞内化的影响。与对照组（细胞用Ni-pPCDs染色，不做任何其他处理）的荧光相比，4 °C组的荧光明显下降了~ 90%（图5c和5d）。同时，阿米洛利、CPZ、染料木素和Methyl-β-cyclodextrin组的荧光分别下降11%、8%、28%和70%。这些结果表明，Ni-pPCDs的细胞内化主要涉及温度依赖性转运和LrME。注：③ 上述四种内吞抑制剂为： 5-(N,N-二甲基)-阿米洛利盐酸盐，抑制巨胞吞作用；氯丙嗪（Chlorpromazine, CPZ），抑制CME；染料木素，抑制CvME；Methyl-β-cyclodextrin，抑制LrME。
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Figure 5. (a)
Confocal fluorescence images of Ni-pPCDs (red)- and SYTO RNASelect
(green)-stained A549 cells after continuous irradiation (552 nm for Ni-pPCDs-stained
cells and 488 nm for SYTO RNASelect-stained cells) for different time periods.
(b) Photostability evaluation results of Ni-pPCDs and SYTO RNASelect.
Fluorescence intensities were obtained from the confocal images shown in a. *P
< 0.05. (c) Confocal fluorescence images of treated A549 cells, and (d)
corresponding fluorescence intensities. Control: Cells were stained with Ni-pPCDs
(5 μg/mL) for 30 min without other pretreatments; 4 °C, amiloride, CPZ,
genistein, or MβCD: Cells were first incubated at 4 °C for 30 min or
treated with amiloride, CPZ, genistein, or MβCD for 2 h and then stained
with Ni-pPCDs (5 μg/mL) for another 30 min.
图5. (a) 不同时间连续照射（Ni-pPCDs染色细胞, SYTO RNASelect染色细胞)后，Ni-pPCDs（红色）和SYTO RNASelect（绿色）染色的A549细胞的共聚焦荧光图像。(b) Ni-pPCDs和SYTO RNASelect的光稳定性评价结果。荧光强度由a.得到，*P < 0.05。(c) 处理A549细胞的共聚焦荧光图像，(d) 相应的荧光强度。对照组：细胞用Ni-pPCDs（5 μg/mL）染色30 min，不作其他预处理；4 °C、阿米洛利、CPZ、染料木素或MβCD处理的细胞先在4 °C孵育30 min，或用阿米洛利、CPZ、染料木素或MβCD孵育2 h，然后用Ni-pPCDs（5 μg/mL）染色30 min。
6. Ni−pPCDs处理细胞的STED成像
CDs还具有优异的荧光特性，包括良好的光稳定性、高QY和独特的胞内性能，如细胞器特异性靶向。上述结果表明本文的CDs特别适合STED成像。使用商用660 nm损耗激光器配备徕卡TCS SP8 STED 3X显微镜（成像分辨率为~ 80 nm），可以实现更清晰的荧光成像，分辨率显著提高。因此，用Ni-pPCDs（5 μg/mL）处理活细胞30 min，然后用552 nm激光激发和660 nm激光激发进行免洗STED成像。细胞及其核仁的共聚焦和STED图像如图6所示，放大的核仁标记位置（白色箭头）的荧光强度结果显示，STED图像（图6I1−III1和6I2−III2）的全宽为172、146和164 nm，而常规共聚焦图像（图6IV1−VI1和6IV2−VI2）的全宽为443、852和426 nm。这是当时首次免洗处理的红发射CDs实现核仁的超分辨率成像，显示了CDs在精密生物成像和核仁相关研究中的巨大应用潜力。![]()
Figure 6. (a) STED
image and (b) confocal image of a representative A549 cell stained by Ni−pPCDs.
(I1, II1, and III1) Enlarged STED images of
the nucleoli of the A549 cell in a, and (I2, II2, and III2)
corresponding fluorescence intensity analysis results of the marked lines in I1,
II1, and III1. (IV1, V1, and VI1)
Enlarged confocal images of the nucleoli of the A549 cell in b, and (IV2,
V2, and VI2) corresponding fluorescence intensity
analysis results of the marked lines in IV1, V1, and VI1.
图6. (a) 经Ni-pPCDs染色的A549细胞的STED图像和(b) 共聚焦图像。(I1,II1,
III1) a中A549细胞核仁的放大STED图像，(I2,II2, III2) I1,II1,
III1中标记对应的荧光强度分析结果。(IV1、V1、VI1) b中A549细胞核仁共聚焦放大图像，(IV2、V2、VI2) IV1、V1、VI1中标记对应荧光强度分析结果。
7. Ni−pPCDs进行体内成像
考虑到长波发射染料可以最大限度地减少对生物样品的光毒性和细胞和组织的背景自身荧光的干扰，红色发射Ni-pPCDs可能在体内荧光成像中具有很大的前景。在体内成像之前，对Ni−pPCDs的生物相容性进行了评估，显示，当Ni-pPCDs浓度高达50 μg/mL时，仍有80%以上的细胞存活，因此Ni−pPCDs对AT II正常肺细胞和A549肺癌细胞的毒性较低。随后，评估了Ni-pPCDs在荷瘤小鼠和斑马鱼体内的成像性能。如图7a和7b所示，小鼠瘤内注射Ni-pPCDs（剂量为0.5 mg/kg）后，肿瘤区域发出鲜红色荧光。随着时间的推移，肿瘤区域的荧光强度逐渐降低。肿瘤荧光的高信噪比归因于CDs优异的荧光特性。进一步研究了Ni-pPCDs的生物分布，分别于注射后1、3、7天切除治疗小鼠的主要器官和肿瘤组织，用体内荧光成像系统成像。如图7c和7d所示，Ni-pPCDs主要在注射后1、3和7天积聚在肿瘤部位，在心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏的分布可以忽略不计，表明Ni-pPCDs具有良好的生物安全性。由于斑马鱼表皮细胞上有一层保护性的黏液层，大多数疏水染料很难对整个斑马鱼进行成像鉴于开发新型荧光染料对斑马鱼成像具有重要意义，本文进一步研究了Ni-pPCDs在斑马鱼中的成像性能。受精后48 h，将斑马鱼在含Ni-pPCDs（10 μg/mL）的培养基中孵育30 min，然后用共聚焦显微镜成像。如图7e和7f所示，整个斑马鱼被Ni-pPCDs染色良好，荧光呈亮红色，表明Ni-pPCDs可以成功地穿过黏液层并与斑马鱼细胞相互作用，这可能归因于它们的超小尺寸，带正电的表面，以及两亲性（来自苯环和氨基）。CDs所取得的出色的斑马鱼成像也证明了它们在斑马鱼相关研究中的巨大潜力。![]()
Figure 7. (a) In
vivo fluorescence images and (b) corresponding fluorescence intensity results
of the tumors after intratumoral injection of Ni-pPCDs (dose: 0.5 mg/kg). Blue
dotted circles in a indicate the tumor areas. “Pre” indicates the mice before
injection. (c) Ex vivo fluorescence images and (d) corresponding fluorescence
intensity results of hearts (H), livers (L), spleens (S), lungs (Lu), kidneys
(K), and tumors (T) of the mice after intratumoral injection of Ni-pPCDs (dose:
0.5 mg/kg) for different time periods (1, 3, or 7 days). **P < 0.01, ***P
< 0.001. (e) Confocal fluorescence and (f) bright field images of zebrafish
stained by Ni-pPCDs (10 μg/mL) for 30 min.
图7. (a) 瘤内注射Ni-pPCDs（剂量：0.5 mg/kg）后肿瘤的体内荧光图像和(b) 相应的荧光强度结果。a中的蓝色虚线圈表示肿瘤区域。“Pre”为注射前小鼠。(c) 瘤内注射Ni-pPCDs（剂量：0.5 mg/kg）不同时间段（1,3,7天）小鼠的心脏（H）、肝脏（L）、脾脏（S）、肺（Lu）、肾脏（K）和肿瘤（T）的离体荧光图像和(d) 相应的荧光强度结果。**p < 0.01， **p < 0.001。(e) 用Ni-pPCDs（10 μg/mL）染色30 min的斑马鱼共聚焦荧光和(f) 亮场图像。
5. 总结
本文通过水热处理pPDA和金属离子，合成了一系列具有不同QY的红致发光CDs。结果表明，虽然形成的CDs中不含金属离子，但金属离子对CDs的性能有显著影响。在这些CDs中，Ni-pPCDs具有各种优点，具有最高的荧光QY，可以实现免洗、高分辨率和高质量的核仁成像。Ni-pPCDs对核仁的高亲和力、良好的光稳定性和极性RNA结合响应性的开启荧光赋予了Ni-pPCDs优异的核仁成像性能，与商业核仁染料SYTO RNASelect相比具有很大的优势，后者发出绿色荧光，只能染色固定死细胞的核仁。此外，得益于其独特的荧光激发/发射波长，Ni-pPCDs可以实现高达146 nm的成像分辨率的STED成像。最后，由于Ni-pPCDs具有红色荧光发射和良好的生物相容性，在小鼠和斑马鱼模型中也获得了令人满意的体内成像。在大多数CDs的应用中，离子检测是一个频繁出现的方向，大多数离子对CDs有一定的荧光猝灭作用。在本文中作者通过利用不同离子进行了不同CDs的制备，对于Ni2+为何特别也给予了恰当的解释。最后得到的Ni-pPCDs在生物应用上也具有较好的优势。
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刘俨漫，24岁，四川广安人；
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