细菌感染会带来重大的健康风险，因为它们有可能导致一系列疾病。如果不及时诊断和治疗，这些感染可能会迅速传播并导致并发症。因此，开发一种探针来选择性地靶向和成像致病细菌，同时杀死它们具有重要意义，因为目前尚无有效的临床解决方案。吉林大学朱守俊教授、吉林大学口腔医学院孟维艳教授以及蔡青副教授团队提出了一种使用近红外碳化聚合物点（NIR-CPDs）同时进行体内成像和治疗细菌感染的新方法。NIR-CPDs的核-壳结构有利于它们融入细菌细胞膜，从而增加荧光亮度和光稳定性。值得注意的是，NIR-CPDs表现出选择性细菌靶向特性，特异性识别金黄色葡萄球菌（S.aureus）。此外，在808 nm激光照射下，NIR-CPDs通过产生靶向和破坏细菌膜的活性氧表现出强大的光动力效应。在感染小鼠模型上进行的体内实验不仅证明了其精确的成像能力，还证明了其显著的治疗效果，伤口愈合明显改善。该研究提供了NIR-CPDs的双重功能潜力，可作为促进对抗细菌感染的医学诊断和治疗的高效工具。上述成果以“Ultra-Photostable
Bacterial-Seeking Near-Infrared CPDs for Simultaneous NIR-II Bioimaging and
Antibacterial Therapy”为题发表在“Advanced
Healthcare Materials (IF=10.0)”上，第一作者是吉林大学研究生段静旖。1. 介绍
全球公共卫生面临着由细菌感染引起的重大挑战。根据2019年的报告，细菌感染占全球死亡人数的13.6%，预测表明，细菌感染将成为全球第二大死亡原因，仅次于缺血性心脏病。细菌感染可导致人体一系列健康问题，包括皮肤和软组织感染、口腔感染、肺炎等。目前，传统的细菌感染临床诊断技术，如血液检查和组织活检，是侵入性的并且无效的，经常导致治疗延误或不确定。如果不及时治疗，细菌可能通过血液迅速扩散到全身，导致更严重的并发症。此外，抗生素的过度使用导致了耐药性感染的出现，这增加了与这些感染相关的发病率和死亡率。因此，通过改善诊断技术、优化成像技术和开发有效的抗菌治疗方法来加强卫生系统能力对于应对这一紧迫的健康威胁至关重要。体内成像技术的最新进展促使各种成像方式被广泛用于诊断细菌感染，其中包括光学成像、核磁共振成像和计算机断层扫描。在这些技术中，光学成像因其非侵入性、无辐射、实时成像能力和诊断灵敏度（可超过传统方法300％和400％）而受到越来越多的关注。然而，当前使用的大多数荧光材料仅限于可见光谱，易受光子降解和散射的影响。令人鼓舞的是，众多学者正在不断探索和推进专门为近红外窗口（NIR-I，700-900 nm；NIR-II，900-1700 nm）设计的不同类别的纳米探针。特别是，NIR-II窗口由于其能够穿透更深的组织（5-20 mm）并最大限度地减少生物组织的光子散射，在生物成像方面很有前景。然而，NIR-II窗口中的探针仍然存在一些局限性，包括光稳定性差、重金属含量和细胞毒性，这严重阻碍了它们的临床转化。此外，使用NIR-II探针进行体内细菌感染成像的研究还不够。因此，必须迅速开发一种能够在NIR-II窗口内实现体内检测细菌感染的精确诊断策略。碳化聚合物点（CPDs）是一类新兴的碳点（CDs），以其卓越的光学性能、优异的光电子转移特性和出色的生物相容性而闻名。这些纳米材料由核-壳结构组成，碳核被含有各种功能团的聚合物壳包裹。近年来，人们合成了各种类型的近红外CDs，并基于其独特的结构特征和光学特性展示了一定的体外细菌成像效果。除了成像潜力之外，CPDs还因其出色的光电转换特性而显示出良好的抗菌性能。它们可以有效吸收光子产生活性氧（Reactive
Oxygen Species: ROS），破坏细菌结构并杀死细菌，同时最大限度地降低耐药性。然而，由于碳发射波长短，穿透深度有限，限制了实时准确的体内细菌成像研究。目前，医学研究倾向于开发多功能纳米材料，这可能会限制CDs未来仅作为成像剂或抗菌剂的应用。由于其可修改的结构和多样性，CPDs可被视为治疗细菌感染的纳米材料研究中非常有希望的候选材料。因此，能够同时提供成像和抗菌功能的纳米材料可能成为推进医疗技术和患者护理的关键。在本研究中，他们提出了一种使用近红外碳化聚合物点（NIR-CPDs）进行体内成像和治疗细菌感染的策略（图1）。NIR-CPDs是通过将发色团共价连接到碳质/交联聚合物核心的主链上而合成的，从而形成了一个发射近红外光的强大的𝜋共轭系统。还发现这些NIR-CPDs表现出卓越的光动力学活性，表明它们具有作为细菌感染体内探针的潜力。他们的结果表明，NIR-CPDs可以有效地整合到细菌环境中的细菌细胞膜中，减少分子旋转，从而提高NIR-CPDs的荧光亮度和光稳定性。基于这一发现，NIR-CPDs已成功用于NIR-II成像窗口内，以准确检测细菌感染。此外，NIR-CPDs在808
nm激光照射下表现出显著的光动力效应，产生的ROS能够靶向并破坏细菌外膜。当将NIR-CPDs应用于小鼠模型中的感染伤口时，她们观察到伤口愈合明显改善。他们已成功将NIR-CPDs用于体内细菌感染的诊断和治疗，利用其在细菌环境中增强的荧光信号效应和卓越的光动力特性。因此，本研究为动物模型中细菌感染的诊断和治疗提供了一种理想且可行的策略。![]()
Figure 1. Schematic diagram of diagnosis and therapy of bacterial
infections using NIR-CPDs. This schematic diagram was created utilizing the
BioRender graphical tool.
图1. 使用NIR-CPDs诊断和治疗细菌感染的示意图。该示意图是利用BioRender图形工具创建的。
2. 结果与讨论
2.1
NIR-CPDs的光物理特性
NIR-CPDs的合成基于他们之前的两步自下而上的策略，包括水热反应形成带有醛基的稳定碳核，然后通过Knoevenagel反应连接分子发射中心。实验表明，在细菌存在的情况下，NIR-CPDs的亮度显著增强，表明其有可能成为细菌成像的有效工具。他们选择了金黄色葡萄球菌（S.
aureus）和大肠杆菌（E. coli）作为代表性革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，以测试CPDs的细菌寻迹特性。首先，在获取NIR-II图像之前，将细菌与浓度为0.1
mg mL−1的NIR-CPDs在不同细菌负荷（107、108、109和1010 CFU
mL−1）下孵育1 h（图2a）。结果表明，在细菌浓度为1010 CFU
mL−1时，NIR-CPDs对金黄色葡萄球菌的亮度约为5.5倍，对相同浓度的大肠杆菌的亮度约为2.5倍（图2b）。这表明，当环境中的微生物数量超过某个阈值时，NIR-CPDs的发光特性会增强。此外，还观察到不同细菌种类之间的亮度变化（图2c）。为了评估NIR-CPDs在细菌环境中的光稳定性并验证其一致的光学性能，他们借鉴了以前的研究成果，该研究表明NIR-CPDs的核心结构形成了交联共轭网络，显著提高了它们的光稳定性。与具有相似发射中心的市售染料吲哚菁绿（ICG）相比，NIR-CPDs的光稳定性显着提高（图2d）。他们发现，ICG的荧光强度在连续暴露于光下10 min后降至接近零；而NIR-CPDs在1 h后保持稳定。因此，他们选择2 h的时间来验证NIR-CPDs和ICG在细菌环境中的光稳定性。具体而言，在金黄色葡萄球菌存在的情况下，NIR-CPDs的亮度几乎保持不变，表明其具有出色的光稳定性。相反，ICG的稳定性不如NIR-CPDs（图2e）。在大肠杆菌存在的情况下，NIR-CPDs和ICG都表现出好的光稳定性，它们的稳定性相当。基于这些观察，NIR-CPDs因为它们具有卓越而持久的光稳定性，可以作为持续监测和分析微生物活动的理想选择。为了研究NIR-CPDs的光动力疗法（PDT）性能，他们检查了ROS的产生。当暴露于单线态氧（1O2）时，DPBF（1, 3-二苯基异苯并呋喃）会发生不可逆氧化，导致420 nm处的吸收强度降低。在固定浓度的NIR-CPDs存在下，他们测量了不同功率密度下808
nm激光器照射下ROS生成情况。观察到DPBF分解在65 mW cm-2辐照度下以缓慢的速率发生。随着功率增加到1 W cm-2，吸收强度急剧下降，表明ROS产生剧烈（图2f、g）。相比之下，水环境中的ICG在暴露于不同程度的激光辐照时产生的ROS非常少（图2h）。根据计算，NIR-CPDs的1O2量子产率约为ICG的2.9倍。此外，电子自旋共振（ESR）技术表现出准确检测自由基类型的出色能力。ESR结果表明，在808 nm辐照下，可以在NIR-CPDs溶液中清晰地捕获特征性的1O2、·OH和•O2−信号。NIR-CPDs产生ROS可能是因为N掺杂的CPDs在光激发下往往表现出表面态，有利于光激发下单线态和三线态激发态之间的有效系间窜越。当三线态氧在CPDs中主要通过非辐射机制还原时，一部分吸收的能量会转移到介质中分散的三线态氧（3O2），从而生成单线态氧。值得注意的是，在受感染的微环境中，谷胱甘肽（GSH）水平常常异常升高，这会对氧化过程产生抵抗力并阻碍抗菌剂的作用。因此，必须确定NIRCPDs是否能在富含GSH的环境中有效产生ROS以发挥其抗菌作用。为了解决这一问题，他们使用DTNB（Ellman试剂）研究了NIR-CPDs体外消耗GSH的能力。在NIR-CPDs与GSH孵育不同时间后，418 nm处的特征吸收峰逐渐下降，表明GSH持续消耗。因此，NIR-CPDs在富含GSH的环境中仍具有良好的抗菌潜力。上述实验观察为NIR-CPDs在临床环境中的应用提供了宝贵的见解。由于NIR-CPDs在低功率水平下产生的ROS较少，且光学性能优异，因此非常适合安全的体内成像应用。此外，NIR-CPDs具有卓越的PDT功效，能够在高功率激光辐射下产生大量ROS，这使得NIR-CPDs能够有效消灭感染部位的细菌，使其成为一种有前途的抗菌治疗工具。![]()
Figure 2. Photophysical properties of NIR-CPDs. a) NIR-II
fluorescence imaging of different concentrations of S. aureus (left) and E.
coli (right) cocultured with NIR-CPDs (0.1 mg mL−1). b) FL intensity
of corresponding groups imaging in (a). c) Schematic diagram of fluorescence
enhancement of NIR-CPDs in S. aureus (left) and E. coli (right) environments.
This schematic diagram was created utilizing the BioRender graphical tool.
Photostability of NIR-CPDs and ICG with equivalent OD at 808 nm in PBS (d) and
S. aureus environments (e). Imaging condition: 808 nm laser excitation with 65
mW cm−2 power density, 900 + 1000 nm long-pass filters.
Time-dependent absorbance spectra of NIR-CPDs (0.2 mg mL−1) reacting
with DPBF under 1 W cm−2 808 nm irradiation (f) and linear fitting
of the degradation of DPBF (g). h) Comparison of normalized absorbance of DPBF
irradiated by NIR-CPDs and ICG at different power levels of 808 nm. ESR spectra
were obtained for the captured (i) 1O2, (j) •OH and (k)
•O2−generated under different reaction conditions. n = 3;
means ± SD; ***P < 0.001.
图2. NIR-CPDs的光物理特性。a)与NIR-CPDs（0.1 mg mL−1）共培养的不同浓度金黄色葡萄球菌（左）和大肠杆菌（右）的NIR-II荧光成像。b)
(a)中相应组成像的FL强度。c)金黄色葡萄球菌（左）和大肠杆菌（右）环境中NIR-CPDs荧光增强的示意图。该示意图是利用BioRender图形工具创建的。在PBS（d）和金黄色葡萄球菌环境（e）中，808 nm处具有等效OD的NIR-CPDs和ICG的光稳定性。成像条件：808 nm激光激发，功率密度为65 mW cm−2，900+1000 nm长通滤光片。NIR-CPDs（0.2
mg mL−1）在1 W cm−2 808 nm辐射下与DPBF反应的时间相关吸收光谱(f)和DPBF降解的线性拟合（g）。h）在不同808
nm功率水平下，NIR-CPDs和ICG照射的DPBF的归一化吸光度比较。获得了在不同反应条件下捕获的（i）1O2、（j）•OH和（k）•O2−的ESR光谱。n=3；平均值±SD；***P<0.001。
2.2.
NIR-CPDs特异性标记细菌用于NIR-II成像
他们进行了共培养实验，以确定NIR-CPDs与细菌结合的发光特性是否随时间而变化。他们将1010
CFU mL−1的细菌与NIR-CPDs（0.1 mg mL−1）混合，并跟踪荧光强度的变化。从图3a、b中观察到，系统的荧光强度随时间逐渐增加，在6 h后达到稳定水平。相反，PBS中的NIR-CPDs的亮度随时间逐渐降低。根据这些结果，NIR-CPDs的亮度在细菌环境中以时间依赖性方式增强，尤其是金黄色葡萄球菌表现出更明显的影响。这种发光的增加可能是由多个NIR-CPDs与复杂细菌结构相互作用引起的，随着NIR-CPDs数量的增加，信号逐渐放大。此外，它再次证实了与金黄色葡萄球菌相关的荧光强度高于大肠杆菌。为了探索NIR-CPDs在细菌环境中的浓度依赖性，他们将细菌（1010
CFU mL-1）与不同浓度的NIR-CPDs（0.0、0.1、0.3和0.5 mg
mL-1）共培养。接下来，他们收集了细菌悬浮液、沉淀物、上清液和细菌沉淀物重悬浮液的NIR-II图像（图3c）。在没有NIR-CPDs的情况下，在细菌样品中未检测到NIR-II信号。随着NIR-CPDs浓度的增加，他们观察到复合系统的荧光强度相应增加。为了进一步了解细菌环境中NIR-CPDs亮度增加的原因，对混合系统进行离心，并在去除上清液后使用PBS重新悬浮细菌沉淀物。这一过程导致细菌沉积物的亮度急剧增加，表明荧光增强可归因于细菌中积累的NIR-CPD局部浓度高而产生的聚集效应。此外，他们还分析了包括初始细菌混合物、上清液和细菌重悬液在内的各种成分的亮度。图3d表明，细菌环境中亮度增强主要是由于与细菌结合的NIR-CPDs以及未结合的自由漂浮的NIR-CPDs。一些NIR-CPDs，即使没有直接附着在细菌上，也可能与细菌环境中的分子相互作用，导致信号放大并导致整体亮度增加。根据他们对不同细菌菌株的比较，金黄色葡萄球菌对NIR-CPDs的结合亲和力明显更强，导致金黄色葡萄球菌中的NIR-CPDs浓度更高。相反，大肠杆菌表现出最小的结合亲和力，使大多数NIR-CPDs留在上清液中，这可以解释与大肠杆菌相关的NIR-CPDs的较低光稳定性。在检查细菌沉积物的再悬浮时，他们观察到较高的NIR-CPDs浓度与较强的NIR-II信号相关。这种影响可能是由于在较高浓度的NIR-CPDs存在下渗透压增加，这反过来又促进了NIR-CPDs与细菌的更广泛结合，从而放大了NIR-II区域的荧光信号。然而，当NIR-CPDs的浓度从0.3
mg mL−1增加到0.5
mg mL−1时，仅观察到亮度略有增加。因此，可以推断，NIR-CPDs在浓度为0.5 mg mL−1时已达到饱和点，而0.3
mg mL−1似乎是细菌成像的最佳浓度。受上述体外细菌成像所取得的良好结果的启发，他们研究了NIR-CPDs在体内细菌成像中的潜在用途。考虑到金黄色葡萄球菌是皮肤感染的主要原因，他们通过感染金黄色葡萄球菌成功诱导小鼠皮下感染（图3e）。在接下来的步骤中，将NIR-CPDs（0.3
mg mL-1，100
μL）分别原位注射到感染区域和健康区域，然后在1 h后收集NIR-II图像（图3f）。他们发现左侧感染区域内的NIR-II信号强度显著增加，同时观察到已渗入相邻正常组织的某些NIR-CPDs他们的亮度值较低（图3g）。同样，他们在右侧健康区域内观察到了极其微弱的NIR-II信号。根据NIR-II成像结果，NIR-CPDs在遇到细菌感染部位时亮度似乎会增加，亮度值比健康组织高2.9倍（图3h）。此外，他们对小鼠进行了连续观察，并注意到随着病情的进展，亮度水平与伤口大小相对应。这使他们能够更精确地可视化感染区域和感染程度。观察到第14天，当感染伤口愈合时，亮度已经消失。该技术能够实时监测细菌感染的发生和进展，同时获得高信噪比成像结果。根据他们的假设，成像质量的改善可能与体内感染所创造的独特微环境有关。皮肤脓肿的定义是形成一个充满脓液的囊袋，里面还有活细菌、死细菌和宿主细胞。因此，他们研究了活细菌和死细菌是否不同。首先，需要准备两个相同的细菌样本，一个含有活细菌，另一个含有灭活细菌（通过煮沸和加热处理实现）。然后将NIR-CPDs添加到两个样本中。观察到灭活细菌的荧光强度约为活细菌的两倍，灭活后不同细菌种类之间存在明显差异。与大肠杆菌相比，用NIR-CPDs处理后，金黄色葡萄球菌的荧光强度明显更高。此外，金黄色葡萄球菌在感染部位会产生多种蛋白酶。在他们之前的研究中，他们已经指出蛋白质可以增加NIR-CPDs的亮度。![]()
Figure 3. NIR-CPDs specifically label bacteria for NIR-II imaging.
a) NIR-II fluorescence imaging of NIR-CPDs with S. aureus (left) and E. coli
(right) (1010 CFU mL−1) over time (0–12 h). b) FL intensity of
corresponding groups imaging in (a). c) NIR-II fluorescence imaging of mixed
systems, bacterial sediment, supernatant, and bacterial sediment suspensions
after co-cultivation of different concentrations of NIR-CPDs (0, 0.1, 0.3, 0.5
mg mL−1) with S. aureus and E. coli. d) FL intensity of different
components in S. aureus (left) and E. coli (right). Imaging condition of (a)
and (c): 808 nm laser excitation with 65 mW cm−2 power density, 900
+ 1000 nm long-pass filters, 30 ms exposure time. e) Subcutaneous infection
model of S. aureus infection (infection on the left). f) Schematic diagram of
local injection of NIR-CPDs for imaging infected wounds. This schematic diagram
was created utilizing the BioRender graphical tool. g) Bright field and NIR-II
fluorescence imaging of in situ injection of NIR-CPDs (0.3 mg mL−1,
100 μL) at the infected (left) and healthy sites (right). Imaging condition:
808 nm laser excitation with 65 mW cm−2 power density, 900 + 1000 nm
long-pass filters, 5 ms exposure time. (h) Comparison of FL intensity between
infected and healthy sites on day 1. n = 3; means ± SD; **P < 0.01.
图3. NIR-CPDs专门标记细菌以进行NIR-II成像。a) NIR-CPDs与金黄色葡萄球菌（左）和大肠杆菌（右）（1010 CFU mL−1）随时间（0-12 h）的NIR-II荧光成像。b)
(a)中相应组的FL强度。c)混合系统、细菌的NIR-II荧光成像不同浓度的NIR-CPDs（0、0.1、0.3、0.5 mg mL−1）与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌共培养后的沉淀物、上清液和细菌沉积物悬浮液。d)金黄色葡萄球菌（左）和大肠杆菌（右）中不同成分的FL强度。(a)和(c)的成像条件：808 nm激光激发，功率密度为65 mW cm−2，900+1000 nm长通滤光片，曝光时间30 ms。e)金黄色葡萄球菌感染的皮下感染模型（左侧为感染）。f)局部注射NIR-CPDs用于对感染伤口进行成像的示意图。该示意图是利用BioRender图形工具创建的。g)在感染部位（左）和健康部位（右）原位注射NIR-CPDs（0.3 mg mL−1，100 μL）的明场和NIR-II荧光成像。成像条件：808
nm激光激发，功率密度为65 mW cm−2，900+1000 nm长通滤光片，曝光时间为5 ms。（h）第1天感染部位和健康部位之间的FL强度比较。n=3；平均值±SD；**P<0.01。
2.3
NIR-CPDs特异性标记细菌的机理
NIR-CPDs与细菌结合后荧光增强，并在各种细菌菌株中表现出选择性标记。为了进一步阐明这种选择性背后的机制，他们采用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）在微观水平上识别NIR-CPDs与细菌之间的相互作用位点。为了验证他们的发现，使用SYTO
9进行了复染实验，SYTO 9是一种能够渗透细胞膜并染色细胞内核酸的染料。在图4a中，用SYTO 9标记的细菌显示出细胞内绿色荧光，细胞外红色荧光，表明NIR-CPDs成功标记了外膜。此外，他们观察到金黄色葡萄球菌在相同成像条件下比大肠杆菌表现出更高的亮度，这与从NIR-II成像获得的结果一致。进一步的观察表明，在同一环境中共培养的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌表现出特异性标记，而大肠杆菌只能在明场条件下观察到。为了消除商业SYTO
9对NIR-CPDs成像结果的潜在影响，他们使用NIR-CPDs进行了独立的细菌染色，结果与上述实验报告的结果一致。此外，Zeta电位分析表明，NIR-CPDs具有与金黄色葡萄球菌表面电位相似的负电荷，而大肠杆菌表面带有更多的负电荷。当NIR-CPDs与金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合时，金黄色葡萄球菌表面电位的变化没有统计学差异，而大肠杆菌的表面电位会增加。通常，NIR-CPDs会插入金黄色葡萄球菌的表面而不会对表面电位产生不利影响。然而，大肠杆菌仅将一小部分NIR-CPDs掺入其细胞膜，大部分处于游离状态。这很可能对它们的表面电位产生一些影响，尤其是考虑到大肠杆菌表面的显著差异。他们的实验是在没有清洗细菌的情况下进行的，以确定NIR-CPDs是否可用于在不清洗细菌的情况下获得高信噪比。通过将细菌与NIR-CPDs共培养，他们成功获得了没有背景干扰的清晰详细的细菌图像。与通常需要多次清洗以消除多余染料或造影剂的传统技术不同，他们的方法省去了清洗步骤，简化了成像过程并节省了时间。传统的清洗步骤通常会导致细菌样本的丢失或损坏。然而，通过使用NIR-CPDs（当其整合到细菌膜中时会增强亮度），他们可以免去这个额外的步骤并仍然获得高分辨率图像。上述实验证明了NIR-CPDs可以有效标记细菌外膜。因此，他们假设NIR-CPDs亮度的变化和不同细菌属之间的差异可能归因于细菌外膜的结构差异。革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的外膜具有明显的结构和成分差异。革兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的区别在于包围细胞质膜的肽聚糖（PGN）层的结构和成分。革兰氏阳性菌的肽聚糖层厚度可达30-100
nm甚至更厚，而革兰氏阴性菌的肽聚糖层要薄得多。因此，他们假设观察到的现象可能归因于细菌肽聚糖成分的变化。随后将NIR-CPDs与从金黄色葡萄球菌和大肠杆菌中提取的肽聚糖进行共培养，然后采集相应的NIR-II图像（图4b）。NIR-CPDs的亮度值随着金黄色葡萄球菌衍生的PGN浓度的增加而增加。然而，在大肠杆菌衍生的PGN中，NIR-CPDs的亮度并没有随着浓度的增加而呈现明显的上升趋势，与NIR-CPDs亮度相比没有明显变化（图4c）。经过30 min的孵育，他们观察到金黄色葡萄球菌衍生的PGN沉淀在试管底部，NIR-II信号强度显著增加。相反，大肠杆菌衍生的PGN没有表现出这种现象。根据这些结果，NIR-CPDs对金黄色葡萄球菌衍生的PGN表现出很强的亲和力，从而导致亮度增强。此外，不同来源的PGN可能具有不同的结构变化，导致与NIR-CPDs混合时亮度水平存在差异。为了阐明NIR-CPDs与革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌相互作用时不同荧光特性的机制，他们进行了计算机模拟研究。图4d中所示的示意图说明了NIR-CPDs与肽聚糖的结合，可以观察到与金黄色葡萄球菌结合比与大肠杆菌结合更多。利用AutoDock
Vina，他们模拟了NIR-CPDs核心和荧光基团与两个不同肽聚糖表面的独立附着。对于荧光基团，他们选择了两个能量上最有利的对接位点（如图4e、f所示）。对于革兰氏阳性菌，测得的两个位点和NIR-CPDs核心处的荧光基团的结合自由能分别为-7.3、-7.6和-19.8 kcal mol-1。相反，对于革兰氏阴性菌，相应的结合自由能分别为-4.3、-5.6和-14.5
kcal mol-1。PGN是由聚糖链组成的大分子，由N-乙酰葡萄糖胺（NAG）和N-乙酰胞壁酸（NAM）残基交替的线性共聚物组成。聚糖链还包含由多种氨基酸组成的肽链结构，促进它们紧密结合。通过比较对结合能的贡献，很明显NAM和NAG为两种细菌类型中荧光基团的结合贡献能量。革兰氏阴性菌特有成分二氨基庚二酸（DAP）与革兰氏阴性菌中的荧光基团形成氢键，而革兰氏阳性菌中的肽桥提供π堆积和氢键。此外，致密的肽聚糖产生更强的范德华力。对于NIR-CPDs核心的结合，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌中的Pi-烷基相互作用都有贡献。此外，革兰氏阳性菌中肽桥还存在π-阳离子相互作用。同样，革兰氏阳性菌的致密PGN可以提供更多的范德华力。分子对接结果表明碳点对革兰氏阳性菌具有更强的亲和力。结合力的差异源于革兰氏阳性菌的肽桥提供额外的相互作用力，而更致密的肽聚糖产生更大的范德华力。由于结合亲和力增强，荧光基团可能耗散更少的动能，这解释了与肽聚糖结合后荧光强度增强的原因。实验结果表明，当NIR-CPDs成功嵌入细菌细胞膜后，其荧光强度显著增加，尤其是在金黄色葡萄球菌中。由于NIR-CPDs嵌入致密的PGN中，分子内部旋转运动受到限制，细菌大量聚集，导致荧光强度急剧增加。然而，在大肠杆菌环境中，NIR-CPDs与大肠杆菌的PGN结合能力较低，导致荧光强度较低。更糟糕的是，磷脂膜作为大肠杆菌外膜的有效屏障，阻止了NIR-CPDs直接进入互层肽聚糖网络。因此，在大肠杆菌环境中，NIR-CPD的荧光强度较低。![]()
Figure 4. Mechanism of NIR-CPDs Specifically Labeling Bacteria. a)
CLSM images of E. coli and S. aureus treated with NIR-CPDs (0.1 mg mL−1)
and SYTO 9. b) NIR-II fluorescence imaging of NIR-CPDs co-incubated with
different concentrations of PGN (0, 2.5, 5.0, 10.0 mg mL−1) derived
from S.aureus and E. coli, respectively. c) Fluorescence intensity of different
samples in (b). d) The schematic diagram of the binding between NIR-CPDs and
PGN derived from S. aureus (up) and E. coli (down). Schematic of a layer of
NIR-CPDs core and its fluorescent group being bound to the surfaces of two PGN
derived from S. aureus (e) and E. coli (f) via AutoDock Vina.
图4. NIR-CPDs特异性标记细菌的机理。a)用NIR-CPDs（0.1 mg mL−1）和SYTO 9处理的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的CLSM图像。b) NIR-CPDs与不同浓度的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌来源的PGN（0、2.5、5.0、10.0 mg mL−1）共孵育的NIR-II荧光成像。(c)(b)中不同样品的荧光强度。(d)NIR-CPDs与金黄色葡萄球菌（上）和大肠杆菌（下）来源的PGN结合的示意图。通过AutoDock Vina，一层NIR-CPDs核心及其荧光基团与金黄色葡萄球菌（e）和大肠杆菌（f）来源的两个PGN表面结合的示意图。
2.4.
NIR-CPDs的体外抗菌性能
由于细菌感染的潜在风险，找到有效的杀菌方法势在必行。这促使他们利用NIR-CPDs显著的光动力效应，对NIR-CPDs的杀菌性能进行进一步研究。他们选择了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌作为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的代表菌株。NIR-CPDs对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度（MIC）分别确定为0.15和0.3 mg
mL−1。他们还测量了不同浓度的NIR-CPDs暴露在光下的杀菌效果。在0.1 mg mL-1 NIR-CPDs下，金黄色葡萄球菌的菌落形成单位减少了约2个对数，而大肠杆菌的菌落形成单位在用近红外（1 W cm-2）照射10 min后减少了约3个对数，表明具有广谱抗菌作用。根据上述细菌成像结果，选择浓度为0.3 mg
mL-1的NIR-CPDs进行抗菌实验。为了更深入地了解抗菌机制，利用扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）观察不同处理后的细菌形态和结构完整性。如图5a所示，与对照组光滑完整的表面相比，NIR-CPDs+NIR处理组中的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出明显的细胞收缩、压痕，甚至完全细胞裂解。TEM分析显示，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的细胞膜严重破裂，导致细菌内容物大量释放。此外，在两种细菌中都观察到大量具有高电子密度的深色聚集体（图5b）。这些发现表明，NIR-CPDs在暴露于近红外激光照射时会产生ROS，对细菌结构造成不可逆的损害。NIR-CPDs在暴露于近红外激光时表现出显着的光谱抗菌活性。微生物生物膜引起的慢性感染在临床上面临着巨大的挑战。根据实验结果，进一步研究了NIR-CPDs抑制生物膜形成的能力。使用稀释平板法评估了生物膜中细菌的活力，结果显示细菌数量显著减少（图5c, 5d）。为了验证NIR产生的ROS的抗菌作用，他们使用DCFH-DA作为探针检测生物膜内的ROS。对照组和NIR组几乎没有观察到荧光信号。在NIR-CPDs组仅观察到散射的荧光信号。然而，在NIR-CPDs+NIR组中检测到了更强的荧光信号。因此，NIR-CPDs可以有效产生ROS并在激光照射下发挥抗菌作用。使用CLSM检查了生物膜及其内部剩余细菌的3D结构（图5e）。对照组和NIR组的金黄色葡萄球菌生物膜结构相对完整且致密。相比之下，NIR-CPDs组绿色荧光相对分散，说明形成的生物膜比较不完整，形成了岛状斑块。然而，当使用NIR-CPDs和NIR处理时，几乎没有生物膜形成。与单独使用NIR-CPDs处理金黄色葡萄球菌生物膜相比，对抑制大肠杆菌生物膜的检查揭示了截然不同的结果。根据这一观察结果，NIR-CPDs单独对大肠杆菌生物膜没有抑制作用；它们只有与NIR和NIR-CPDs协同作用才有效。对整个区域中绿色荧光所占面积进行了半定量分析。与对照组相比，NIR-CPDs+NIR组中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的荧光区域分别仅为13.2%和34.4%。根据SEM，对照组和NIR组均形成了成熟的生物膜群落，其特点是细菌连接紧密，这使它们能够逃避免疫系统的渗透和清除。NIR-CPDs处理的结果是，金黄色葡萄球菌形成生物膜受到部分抑制，这表现为生物膜之间有相对间隙，细菌连接较松散。相反，在NIR-CPDs+NIR处理中，没有检测到成熟的生物膜；只发现少量细菌。虽然NIR-CPDs对大肠杆菌生物膜形成的影响有限，但在NIR-CPDs+NIR组中观察到了显著的抑制作用，这与之前的实验结果一致。通过用结晶紫染色，得到了与上述实验一致的结果。上述NIR-CPDs在无光照条件下处理金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的实验结果中，出现了多种不一致的结果，这种不一致可能是由于NIR-CPDs能够大量整合到金黄色葡萄球菌中，影响其群体感应能力，抑制生物膜形成所致。而NIR-CPDs在大肠杆菌中的整合程度较低，在无光照条件下几乎没有作用，因此单独使用NIR-CPDs的抗菌性能存在一定的局限性，但与近红外光结合时，可表现出明显的广谱抗菌活性。近年来，大量学者对CDs的抗菌效果进行了研究，但大多数CDs只有在波长为600 nm的光源激发下才表现出有效的光动力抗菌性能。然而，短波长光源的穿透深度有限，限制了其在体内的抗菌应用。因此，他们使用808
nm波长的光源来激发NIR-CPDs，从而获得卓越的抗菌功效，使其更适合临床应用。![]()
Figure 5. Antibacterial Properties of NIR-CPDs in Vitro. a) SEM
images and b) TEM images of planktonic E. coli and S. aureus, the red arrow
indicates the damage and degeneration of the cell membrane. c) The pictures of
S. aureus and E. coli colonies of biofilm on agar plates after different
treatments. d) Corresponding statistical data of CFU colonies of S. aureus and
E. coli biofilm. e) 3D reconstructions of the fluorescence-labeled S. aureus
and E. coli biofilms stained with SYTO 9. n = 3; means ± SD; **P < 0.01 and
***P < 0.001.
图5. NIR-CPDs的体外抗菌性能。a)大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的SEM图像和b) TEM图像，红色箭头表示细胞膜的损伤和变性。c)不同处理后琼脂平板上金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜菌落的图片。d)金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜CFU菌落的相应统计数据。e)用SYTO 9染色的荧光标记的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生物膜的3D重建。n=3；平均值±SD；**P<0.01和***P<0.001。
2.5. 体内感染NIR-II成像和NIR-CPDs的抗菌功效
在上述实验中，他们通过原位注射NIR-CPDs成功实现了细菌感染的体内成像。虽然这种技术能够精确识别和了解感染部位，为医疗专业人员提供更明智的治疗决策的机会，但其适用性仅限于他们对感染部位有大致了解的情况。如果感染部位不明，必须立即自主定位感染区域进行早期干预，以避免延迟诊断造成严重后果。为了证明NIR-CPDs“定位”感染部位的能力，他们建立了一个皮下感染模型作为深度约为1 mm的浅表细菌感染模型。实验过程和时间表可以在图6a中观察到。注射给药后，感染部位的NIR-II信号随时间显著增加（图6b）。对特定感兴趣区域的NIR-II信号（>1000
nm）的分析证实，NIR-CPDs的最大积累发生在注射后6 h。随着疾病的愈合，健康皮肤的信号值逐渐降低，而感染部位的信号则越来越集中在伤口周围。随着疾病的愈合，感染部位的信号逐渐消失。他们得出结论，感染部位信号值的特异性增强是NIR-CPDs与局部细菌相互作用的结果。当身体遇到细菌感染时，周围组织会发生炎症反应，从而导致增强的渗透性和保留性（EPR）效应。此外，由于EPR效应，大量NIR-CPDs积聚在细菌也大量繁殖的感染部位。因此，这两个因素的综合作用使NIR-CPDs能够准确检测感染性病变并识别感染部位，从而为临床诊断传染病提供了新的视角。使用深度约为3 mm的肌肉细菌感染模型来评估该方法对深层感染灶的有效性。与皮下感染模型相比，深部感染部位的亮度不那么鲜艳，而且更分散（图6b）。这可能是因为肌肉感染比皮下感染渗透得更深，导致亮度值降低，因为它们被周围组织和肌肉阻挡。同时，随着感染细菌在筋膜内繁殖，感染变得更加弥散，并超出了其最初的局部区域。与皮下感染模型类似，肌肉感染模型中NIR-CPDs的最大积累也发生在注射后6 h。并且随着时间的推移，感染部位的信号值逐渐降低。偶然发现，实验过程中小鼠右腿关节的亮度值显著增加（图6b，白色箭头）。后续检查发现，同一关节处有感染伤口，可能是小鼠之间发生意外造成的。在这个偶然的发现中，他们证明了NIR-CPD能够主动靶向，从而提高定位感染部位的准确性，并防止漏诊或误诊。由于NIR-CPDs与激光治疗相结合表现出令人印象深刻的杀菌功效，他们进行了一项研究，以确定它们在促进伤口愈合和对抗细菌感染方面的有效性。图6c描述了实验过程和时间表。背部皮肤经过剃毛和消毒，然后造成直径为8 nm的缺损。之后，在伤口上接种50 μL金黄色葡萄球菌。将小鼠随机分为4组（n=3）：对照组、NIR组、NIR-CPDs组和NIRCPDs+NIR组，每组接受相应的治疗。每天检查各组小鼠的感染伤口，直到第14天，然后将小鼠安乐死以评估结果。图6d、e显示了不同治疗组的感染伤口的代表性图像。PBS治疗（对照组）的结果是，伤口周围出现明显的炎症和水肿，以及大量渗出物和黄色结痂。即使在14天后，也没有明显的伤口愈合迹象，可以目视检测到黄色化脓性物质的存在。NIR-CPDs+NIR组伤口愈合加快，伤口周围红肿和渗出物减少。到第14天，伤口几乎完全愈合，切口周围重新长出毛发。统计分析结果（图6g）表明，NIR-CPDs+NIR组伤口愈合情况随时间推移改善最为显著。第5天，使用无菌拭子收集伤口周围的细菌，计数LB琼脂平板上的细菌数量，以此测量伤口的细菌负担。正如预期的那样，NIR-CPDs+NIR组的细菌菌落数明显低于其他三组，这与体外实验的结果一致（图6f、h）。通过NIR暴露下的体内ROS成像证实，NIR-CPDs能够产生足够的ROS来对抗小鼠的细菌感染，这进一步验证了它们的能力。从本研究结果可以看出，NIR-CPDs与NIR疗法相结合具有有效治疗慢性伤口的巨大潜力。为了评估伤口组织内组织结构、细胞形态和胶原纤维的任何变化，还采集了伤口周围组织进行组织学分析。使用甲苯胺蓝和伊红（H&E）染色和Masson三色染色技术，评估了伤口组织中炎症和胶原沉积的程度。第14天，对照组和NIR组均观察到炎症细胞明显浸润和强烈的炎症反应，还观察到上皮组织内的不连续性（图6i）。与对照组相比，用NIR-CPDs和NIR-CPDs+NIR治疗的组炎症细胞明显减少。此外，在两组中都可以观察到上皮组织内的不连续性。除了减少炎症外，胶原纤维的沉积和重组也被发现对促进伤口愈合至关重要。进行Masson三色染色以确定伤口中胶原纤维是否再生。如图6j所示，NIR-CPDs和NIR-CPDs+NIR组的新合成胶原纤维丰度明显高于其他两组。此外，观察到NIR-CPDs+NIR组中新生毛囊的生长。免疫荧光染色结果显示，经NIR-CPDs和NIR协同治疗后，不仅组织中促炎细胞因子IL1𝛽的表达水平有效降低，而且还通过上调血管内皮标志物CD31促进血管形成，从而加速伤口愈合（图6k，l）。促进伤口愈合有几个关键原因。根据体外抗菌研究的结果，NIR-CPDs即使在没有光照的情况下也能有效对抗金黄色葡萄球菌。此外，他们的细胞毒性实验表明，在NIR-CPDs的作用下，巨噬细胞增殖增加，这表明在体内给药NIR-CPDs可以刺激巨噬细胞增殖并增强人体抵抗细菌感染的能力。此外，它通过与NIR的协同作用产生大量ROS，从而增强了NIR-CPDs的抗菌功效。因此，这种创新方法为患有此类伤口的患者提供了一种有希望的治疗解决方案，并具有良好的治疗效果。2.6. NIR-CPDs的生物安全性评价
所开发药物的良好生物安全性是其临床应用和商业化的主要先决条件。首先，将不同浓度的NIR-CPDs与两种不同的正常细胞系（L929和RAW
264.7）一起孵育24 h，并通过CCK-8检测评估其潜在的细胞毒性。用NIR-CPDs处理时，两种细胞系均无细胞毒性；然而，两种细胞系的增殖均得到增强，尤其是RAW
264.7。他们进一步通过NIR激光照射（808 nm, 1 W cm−2）评估了NIR-CPDs的细胞光毒性。研究结果表明，在浓度低于0.5 mg mL−1时，细胞存活率超过80%，表明生物相容性良好。通过小鼠尾静脉注射NIR-CPDs（3 mg mL−1，200
μL），观察其代谢途径和循环。确定在体内，肝脏主要处理NIR-CPDs，在7天内完成一个完整的代谢循环。通过使用H&E染色的组织学检查，评估了小鼠两种给药途径（局部注射和静脉注射）NIR-CPDs的安全性。14天后对主要器官（如心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）进行显微镜检查，未发现病理损伤或异常。此外，观察14天后，他们发现，尽管在建立疾病模型后小鼠的体重最初显著下降，但其体重逐渐恢复到基线水平。基于这些发现，NIR-CPDs在体内给药时可被视为具有生物相容性。3. 结论
他们的研究表明，NIR-CPDs的荧光信号显著增强，并且在细菌环境中保持出色的光稳定性。这种增强是NIR-CPDs与细菌细胞相互作用的直接结果。因此，卓越的光学特性提供了可用于有效体内细菌感染成像的见解，为临床感染诊断和治疗提供了一种精确且非侵入性的新方法。此外，证实了NIR-CPDs卓越的光动力效应和有效的抗菌特性，表明它们具有伤口感染治疗的潜力。值得注意的是，他们的研究揭示了NIR-CPDs与各种细菌菌株结合的特异性，为未来的细菌鉴定技术提供了新的见解。总的来说，NIR-CPDs在诊断和治疗细菌感染方面具有广泛的潜力，这使它们成为常规临床环境中必不可少的工具，值得进一步研究和推广其在临床环境中的使用。廖成霜
xhu.lcs2xl@foxmail.com
学习经历：
2018年09月-2022年06月 西华大学理学院化学专业本科学习
2022年09月-至今 西华大学理学院生物与医药专业
