AHA科学声明：心血管疾病基因疗法新进展和发展方向
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2024-12-19 18:06
北京
编者按：心血管疾病（CVD）是全球死亡率的首要原因，给患者带来了巨大的健康和经济负担。CVD通常需要终身管理，现有的治疗和干预措施一般只能减轻疾病症状而不能彻底治愈，因此为患者带来了长期且巨大的健康和经济负担。基因疗法的出现使一些明确了发病机制的CVD管理看到了新的可能。目前，遗传学研究已经阐明了遗传在心血管疾病发病机制中的重要作用，包括单基因和多基因机制，并确定了基因治疗的具体靶点。然而，如何有效地将基因治疗传递到特定的细胞中仍是一个巨大的挑战。美国心脏协会（AHA）回顾了基因治疗的核心概念、关键障碍、患者风险和正在进行的研究，以使临床医生能够了解这种新兴疗法的复杂性和治疗潜力。本文对该科学声明的内容进行整理，以飨读者。
单基因疾病往往起源于罕见的致病性变异（PVs），它会改变基因编码蛋白的结构、功能或正常表达水平，从而引起相应的临床表现，并增加发病率和死亡率。目前已阐明发病机制的显性单基因CVD包括扩张型、肥厚型和心律失常型心肌病、心脏离子通道病和主动脉病变；隐性单基因CVD则包括纯合子家族性高胆固醇血症。临床基因检测可用于评估致病单基因变异的存在，并实现早期准确诊断和干预。多基因疾病起源于发生在健康人群中的多种遗传变异，它们单独变异的影响很小，但共同变异时可以增加疾病的易感性。大多数多基因变异改变非蛋白编码，影响基因表达的调控序列，包括高血压、糖尿病、高胆固醇血症和动脉粥样硬化等。基因组分析已经确定了特定的多基因变异，使一些CVD的多基因风险评分的发展成为可能。然而，支持使用多基因风险评分来指导临床管理的证据仍然有限。对单基因CVD的研究推动了对通路、机制和治疗靶点的深入了解。例如，编码前蛋白转化酶枯草溶菌素9（PCSK9）基因的功能获得显性单基因变异首次在一个早发、快速进展的动脉粥样硬化家族中被发现。实验表明，PCSK9可以降解低密度脂蛋白（LDL）受体，该受体将携带胆固醇的脂蛋白颗粒转运到细胞中。因此，PCSK9的功能获得变异减少了LDL受体的数量，随后提高了循环系统中的LDL水平，类似于编码LDL受体基因的功能缺失变异所引起的影响，这是家族性高胆固醇血症的原因。相反，其他导致PCSK9功能丧失的变异会降低LDL水平和CVD事件的终身风险，而不会产生有害影响。总之，这些研究发现共同推动了PCSK9抑制剂的开发。PCSK9抑制剂可以降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平，减少CVD事件。尽管PCSK9抑制剂的治疗有效，但其疗效并不持久，需要定期给药。目前，以人类基因功能丧失变异的有益影响为模型，正在努力研究一种对高危动脉粥样硬化疾病患者永久沉默PCSK9基因的单一治疗方法。基因治疗利用负责CVD发病机制的基因，旨在编辑、取代或调节致病基因的活性，通过预防或治愈疾病来改变疾病的病程。基因治疗因其病因性基因变异的机制和功能后果可分为多种机制，主要可概括为促进正常基因表达和抑制致病性基因表达两大类。对于单基因遗传病，PVs使1个等位基因失活，可导致正常功能的蛋白质表达不足或缺失，称为单倍剂量不足，从而影响正常功能。对于这些疾病，基因治疗的目的是通过传递外源性蛋白质编码序列来增加内源性DNA序列的表达，或纠正/修饰突变的DNA序列以使其表达正常或接近正常的蛋白质来提高蛋白质水平。能够产生足够数量的蛋白质但具有有害功能的PVs会引起显性负面影响。对于此类疾病，基因治疗的目的是纠正PVs、灭活突变的DNA等位基因或使用小干扰RNA或反义寡核苷酸沉默异常转录物。修改DNA序列的疗法具有永久性的影响，而基于RNA的策略和外源性蛋白质编码序列递送的持久性是可变的。然而，基因治疗需要修改足够比例的靶向细胞，以对组织产生有益的影响，并降低未经处理的细胞进行细胞分裂的可能性以减少疾病复发。![]()
修改DNA序列的工具正在迅速发展。目前可用的基因编辑工具主要包括成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9核酸酶系统、碱基编辑器和引物编辑器等。尽管这些基因编辑工具的组成部分不同，但每种工具都包括一个引导分子（RNA），它可以靶向特定的要被修饰的序列，切割DNA并替换、插入或删除多个核苷酸序列。CRISPR/Cas9核酸酶系统会使DNA双链断裂，并通过非同源性末端接合进行修复，在此过程中，随机的DNA序列可以被删除或插入，并因引入终止密码子导致提前终止基因转录。因此，CRISPR/Cas9核酸酶系统具有适当的靶向性，可以灭活异常的基因拷贝。但是由于靶标的特异性可能会受到多个因素影响，如果导致两个基因拷贝的失活，可能会产生不可预知的严重后果。碱基编辑器是一种替代性方法，它可以将一种核苷酸转化为另一种，特别是胞嘧啶转化为胸腺嘧啶或腺嘌呤转化为鸟嘌呤。引物编辑器包含由Cas9切割酶和修饰的逆转录酶组成的融合蛋白，这些融合蛋白可以引入、删除或替代多个核苷酸，从而提供更广泛的治疗选择。与CRISPR/Cas9核酸酶系统相比，碱基编辑器和引物编辑器不引入双链断裂，因此更具可预测性和精确性。总体而言，这些基因编辑器可以用来引入终止密码子来降解包含显性负面变异的异常拷贝，精确地恢复正常DNA序列，或引入激活序列来增加基因表达。![]()
图2. 基因组编辑工具：CRISPR/Cas9核酸酶系统、碱基编辑器和引物编辑器如何将基因治疗药物有效递送到靶向细胞仍然是基因治疗的一个挑战。目前，使用两种类型的运载工具，包括病毒和非病毒载体，这两种递送工具具有不同的特征。病毒载体由有缺陷和非致病性的病毒包膜组成，在递送过程中可防止免疫介导的降解。腺相关病毒（AAV）是一种常用的载体，因为它具有多种血清型和组织特异性，可以优先递送到特定的组织中，而且它很少整合到细胞的基因组中。AAV可以持续存在于具有非分裂心肌细胞或缓慢分裂的肝细胞的器官中而且无不良反应，但这些优势被有限的AAV载体和现有或新开发的AAV中和抗体所抵消。非病毒载体以脂质纳米颗粒（LNPs）为主，可以克服病毒载体的局限性。LNPs通常由可电离的脂质、两亲性磷脂、胆固醇和聚乙二醇脂质组成，这些脂质颗粒包裹了编码基因编辑器或补充基因的核酸，并将它们递送到细胞内。LNPs具有易于制造和免疫反应低的优点。目前已经证实其可以作为治疗药物的载体，如用于治疗心脏淀粉样变性的小干扰RNA和COVID-19 mRNA疫苗。然而，LNPs及其相关载体的组织特异性较低，而且具有固有的肝向性，会在肝脏中积累，这限制了其向心肌细胞的有效递送。![]()
CVD基因治疗的开发和临床应用取得了一些显著进展，包括小干扰RNA治疗高脂血症和降低心脏淀粉样变性中的损伤蛋白水平。在动物模型和人类CVD患者中，通过CRISPR/Cas9核酸酶系统永久灭活突变基因等位基因，同时保留其他具有正常DNA序列的等位基因的替代治疗方法正在进行研究。由单倍剂量不足引起的CVD基因治疗的研究也在积极进行中。例如，美国食品和药物管理局（FDA）最近批准了编码微肌营养不良蛋白序列的AAV递送系统，以解决肌营养不良的单倍剂量不足，这是杜氏肌营养不良症的原因之一。一项评估微肌营养不良蛋白序列AAV递送系统的安全性和有效性的随机、双盲、安慰剂对照的3期临床试验的完整结果尚未公布。与此同时，使用基因组编辑器纠正潜在PVs的临床前和临床研究都正在进行中。研究表明，在肥厚型心肌病和扩张型心肌病的动物模型中，通过AAV9递送碱基编辑器可以永久纠正PVs。值得注意的是，这些临床前研究中基因治疗预防了疾病发生，但迄今为止，没有任何研究逆转了已确定的疾病。LNP递送使PCSK9基因在非人灵长类动物中失活的碱基编辑器可以有效降低LDL-C，对人类杂合子家族性高胆固醇血症或为控制高胆固醇血症患者的PCSK9基因具有持久的作用。多项早期临床试验正在进行中，旨在研究基因替代和基因组编辑作为各种类型CVD的新治疗选择的安全性和有效性。![]()
成功的CVD基因治疗具有美好的前景，包括可永久地防止疾病出现或进展；可以消除终身使用药物和相关副作用；预防严重的疾病后遗症；减轻患者、卫生保健系统和社会的总体疾病负担。但想实现这些获益，目前仍需要解决伦理问题、监管问题、长期监测等各方面的问题。第一，基因治疗的靶向特异性对治疗的成功至关重要。细胞特异性可以限制CRISPR/Cas9、碱基编辑器和引物编辑器在选定的细胞中的表达，但意外的DNA变化仍然以可变的频率发生，需要进行研究来预测和评估其潜在的突变，特别是晚发性的不良反应，如恶性肿瘤。与其他器官系统不同，CVD基因治疗无意中激活恶性转化的潜力受到心肌细胞低致癌潜能的限制。AAV的组织向性最高，但多个器官都会吸收这些载体，降低了目标细胞的递送效率。静脉注射的LNPs在肝脏中积累，为肝脏适应症提供了一个有效的载体，但潜在的肝毒性仍然存在。第二，基因治疗的载体和非人类的基因序列可能会引起免疫反应。约25%的个体预先存在中和AAV抗体，这限制了初始治疗的有效性并阻止了重复给药。这些问题可能限制未来基因治疗的选择性和早期治疗策略。第三，如何尽量减少急性不良反应，同时最大限度地提高疗效是CVD基因治疗中最重要的问题。在使用AAV载体的临床试验中，超过30%的患者报告了严重的不良事件，包括肝毒性、血栓性微血管病（全身递送）、神经毒性（中枢神经系统递送）、急性呼吸窘迫综合征和死亡，接受高剂量AAV治疗的患者出现的不良反应最大。非病毒载体也带有潜在的副作用，静脉注射LNPs可引起肝毒性和输注相关的超敏反应。第四，尽管临床前研究和早期临床试验证明了基因治疗用于CVD的潜力，但在更大的患者群体中仍缺乏长期疗效和安全性的有力证据。识别不良结局风险最大的患者群体，结合基因治疗稳定或逆转疾病的有效性证据仍是非常需要的，这对于确定对选定患者进行基因治疗的最佳时机至关重要。
对基因治疗的认识和创新正在推动CVD治疗领域的巨大变化。基础的遗传学见解、创造性的分子工程策略和新出现的成功案例证明了基因干预减轻疾病负担和改善患者预后的潜力。基因治疗作为CVD管理的一种范式转变方法具有巨大的前景，为疾病预防、长期治疗和减轻终身药物治疗提供了前景，但将这些前景进行临床转化需要克服重大挑战，包括将基因治疗精确靶向到特定的心血管组织，最大限度地减少对递送载体的免疫反应，减轻基因组编辑工具的脱靶效应，识别具有最大治疗潜力的患者群体，以及建立长期疗效和安全性，这些都是必须克服的关键障碍之一。参考文献：Kim Y, Landstrom AP, Shah SH, Wu JC, Seidman CE; American Heart Association. Gene Therapy in Cardiovascular Disease: Recent Advances and Future Directions in Science: A Science Advisory From the American Heart Association. Circulation. 2024 Dec 3;150(23):e471-e480. doi: 10.1161/CIR.0000000000001296. Epub 2024 Nov 11. PMID: 39523949.
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