WXRedian | TSS转化医学谱 | GPCR受体的正构和变构配体调节动力学模型

GPCR活性可由正构和变构配体调节的。本文总结了GPCRs受体的正构和变构配体调节动力学模型。特别强调了几类独特的负向变构调节剂（NAM, negative allosteric modulator）、正向变构调节剂（PAM, positive allosteric modulator）正向变构调节型拮抗剂（PAM-Antagonists，它增加了受体对激动剂的亲和力，但同时在共同结合时降低了激动剂的药效）。与标准的正构和变构拮抗剂相比，PAM拮抗剂非常适合逆转持续激动作用，并在体内提供良好的靶点覆盖。PAM拮抗剂在逆转病理过度激活（例如，内皮素血管收缩）方面的治疗具有较好的应用前景。

GPCRs是治疗药理学中最普遍的药物靶点之一，它们几乎控制着人体中每一个重要的生理功能，它们通过改变构象响应共结合调节剂，如细胞外分子（神经递质和激素）和细胞内信号蛋白（G蛋白和β-arrestin）。通过对GPCRs功能的激活（激动作用）或阻断（拮抗作用），可以获得大量的药理治疗优势。

体内激动作用的逆转的有效性受到激动剂和拮抗剂的相对结合位置、它们的相对浓度和动力学的控制。从根本上说，拮抗分子可以与受体相互作用来阻断激动剂反应：通过正构机制（Orthosteri）或变构机制（Allosteric）。当拮抗剂在物理上与激动剂结合位点结合并阻止激动剂结合（即空间位阻）时，就会发生正构阻断（Orthosteric blockade）。变构分子与受体上正构不同的位点结合，导致蛋白质构象的改变，从而改变激动剂对受体的影响。

变构配体以更微妙和选择性水平对GPCRs控制。这种配体是“自由多样的”，因为它们与天然内源性激动剂所利用的正构位点不同的变构位点结合，从而允许在结合正构调节剂存在的情况下保留但改变的信号传导。因此，变构效应可以促进和增强内源性信号（PAMs），拮抗内源性信号（NAMs），和/或偏置内源性信号。PAMs和NAMs的作用是通过分子构象的变化来介导的受体蛋白对内源性激动剂的亲和力以及内源性激动剂的药效。

药物特性是靶向对正构激动剂结合袋导致药效效非常小到接近无穷小的分子（图1A），从而阻断对强大的神经递质和/或激素的生理反应；这种机制将被称为标准的正构拮抗。由于结合到内源性激动剂相同的结合口袋，正构拮抗影响因素: 拮抗剂结合的动力学（即竞争性和非竞争性），激动剂的药效（实际上是系统的有效受体储备），激动剂和拮抗剂各自的亲和力，和在受体室的相对浓度。

在测量竞争性拮抗剂存在下的激动剂反应时，相对的结合速率和解离速率必须足够快，以便根据质量作用定律受体与激动剂和拮抗剂达到重新平衡。当动力学足够快，增加拮抗剂浓度会降低激动剂的效力，而不改变激动剂的最大反应（图1B，D）。如果拮抗剂的解离速率相对于激动剂的解离速率较低，则观察到非竞争性拮抗剂；其特征是对激动剂的最大反应降低（图1C）。靶器官的敏感性（即受体储备的大小）决定了拮抗剂在系统中产生的最大反应的抑制程度（图1C，E）。

就体内系统而言，系统中存在的基础激动剂水平会影响所观察到的拮抗剂的效力（图1F）。对于竞争性拮抗剂，根据Cheng和Prusoff线性关系，激动剂的存在大大降低了效力，拮抗剂的有效效力是半抑制浓度：

激动剂的浓度由[A]，τ_A是激动剂的效力或系统响应，K_A和K_B是激动剂和拮抗剂受体复合物各自平衡解离常数。

值得注意的是，受体储备的增加放大了拮抗剂效力的影响（图1），但未能改变初始拮抗剂活性（图1B和D）。

与竞争性拮抗剂有效性的大幅线性下降相比，非竞争性拮抗剂中，激动剂对拮抗剂效力的最大作用已经饱和（图1C，E）：

如图1F所示，非竞争性拮抗剂的活性明显受不到受体储备变化的影响。这尤其是在低受体储备(τ-> 0)，其中观察到的拮抗剂效价（半抑制浓度）接近K_B的极限值（图1E）。

一般来说，内源性激动剂降低了正构性拮抗剂阻断激动剂反应的效力，尽管非竞争性正构拮抗剂在阻断体内系统中高水平基础激动剂反应方面明显比竞争性拮抗剂更有效。然而，更重要的是，一旦信号被建立（例如，在病理过度激活期间），这种作用对逆转信号的作用程度也在很大程度上取决于激动剂的解离速率。

与正构拮抗剂相比，NAMs与受体上的变构位点结合，导致受体的构象状态，从而降低激动剂活性（图2A）。如上所述，受体功能的阻断可以通过两种机制发生：(i) 激动剂对受体的亲和力降低（由协同项α量化）；和/或（ii）激动剂-受体复合物产生细胞反应的能力降低（协同项β降低激动剂的药效）。一个模型可以用来描述激动剂和调节剂对受体的伴随作用，激动剂反应：

其中，Em为系统的最大响应能力，n为浓度-响应曲线的斜率。对于激动剂浓度-反应曲线斜率为单位（n = 1）的功能系统，变构调节剂的效力由以下给出：

公式4 有助于预测不同的条件如何影响NAM的效力，如下所示：

首先要考虑的是NAMs的影响，它会降低正构激动剂的亲和力，从而降低激动剂的效力（图2B，E）。这可能被认为，由于变构拮抗剂结合到受体上的一个单独的位点，在受体上的激动剂的存在将对拮抗剂的亲和力没有影响。这是不正确的，因为结合的激动剂对变构调节剂的亲和力有一个强制性的和相互作用的长距离效应。具体来说，尽管针对受体上的非重叠位点，但一种配体（如正构激动剂）的结合会影响另一种配体（如变构调节剂）的结合，反之亦然。在负协同作用的条件下，激动剂在远处发挥作用，以稳定对调节剂具有低亲和力的变构位点。换句话说，结合激动剂将以一种方式降低变构分子的有效性，类似于正构配体竞争相同结合位点。这已经通过正构和变构放射性配体实验所证实。重要的是，对于一个对激动剂亲和力产生巨大负面影响的NAM来说（α<<1），NAM本身对激动剂结合受体的亲和力也会同样大程度的降低。　

激动剂的存在和受体储备对α-NAM效力的影响可以用公式4来预测，在有限的情况下NAM的α->0（即，调节剂能显著降低受体对激动剂的亲和力，因此如果NAM结合，激动剂根本不能结合），方程4简化为方程1，描述正构竞争拮抗剂效力的Cheng－Prusoff方程。在α<1的更现实的条件下，Cheng－Prusoff关系变成大曲线（高储备；图2H)或小曲线（低储备；图2I)。反过来，这意味着，当变构部位达到饱和时，拮抗作用接近最大效应。因此，激动剂的作用因拮抗剂的变构性质而略有减轻（将竞争性拮抗剂的直线关系与图2H，I中α-NAMs的曲线结果进行比较）。然而，总的来说，可以看到，激动剂的存在仍然降低了受体对β-NAM的亲和力，并以类似于正构竞争拮抗剂的方式限制了其效力。

在实验中观察到的NAMs的另一个特性是能够阻止激动剂结合的受体产生细胞信号（β << 1，β-NAM）。例如，这在CXCR2受体NAM SB265610的实验中被观察到，它选择性地降低了CXCR2受体对天然激动剂IL-8的反应能力。这有效地产生了非竞争性的拮抗作用（图2C，F）。此外，与非竞争性正构拮抗剂一样，β-NAM阻断的效率与系统的受体储备有关。对于强激动剂或具有高受体储备的组织（即大τ值），β-NAM的效果较差（图2C），直到受体储备耗尽，β-NAM才能显著降低最大激动剂信号（图2F）。

根据公式4，受体上存在激动剂将影响受体对β-NAM的亲和力，其方式类似于α-NAM观察到的（图2H，I）。更具体地说，对于像β-NAM这样的变构拮抗剂（以及在较小程度上的α-NAMs），线性的Cheng–Prusoff方程被修改，以减轻激动剂介导的拮抗作用的减少。在某些情况下，β-NAM对激动剂亲和力没有影响（α=1），当共结合时完全阻断激动剂信号（β= 0），半抑制浓度方程与非竞争性正构拮抗的表达相同（即，方程4成为方程2, α= 1，β = 0）。

许多NAMs有效地降低了激动剂（即αβ-NAMs）的亲和力和效力。对于这些分子，激动剂浓度和受体储备都将降低拮抗剂的效力，这与正构竞争拮抗剂几乎相同（图2D，G）。这是因为α和β（都<1）的较低值将降低了分母对激动剂浓度的缓解作用（方程4显示，α和β的低值结合起来基本上抵消了分母项，从而近似于竞争正构拮抗剂的Cheng-Prusoff方程）。但是，在不同敏感性的存在激动剂的受体区室中，αβ-NAMs与竞争性拮抗剂的敏感相当（图2H，I）。

一般来说，变构拮抗剂，虽然比标准的正构拮抗剂受激动剂浓度和系统反应性变化的影响较小（图1和图2），但仍然受到受体区室中存在激动剂的负面影响。然而，一种对激动剂亲和力和效力的不同变构效应的独特组合，以PAM-拮抗剂的形式，提供了一种独特的和基本上更有效的阻断，甚至优于的传统最好变构拮抗剂。

一种特殊类型的NAM对激动剂的亲和力和效力具有完全相反的变构效应，可以被归类为PAM拮抗剂。PAM-拮抗剂代表了一类独特的变构GPCR配体，它们增强了内源性激动剂的结合（PAM效应，α > 1），同时降低了激动剂-受体复合物的信号传导能力（拮抗剂效应，β< 1）。PAM拮抗剂可以更恰当地称为α-PAMs/β-NAMs。将其“PAM拮抗剂（PAM-Antagonists）”更完整，因为它可能包括α-PAMs，也在物理上阻断G蛋白结合，如纳米体结合到活化的GPCRs的细胞内表面，并阻断信号。

一般来说，变构调节剂的整体活性由αβ结果决定；因此，对于PAM拮抗剂产生整体拮抗剂，αβ结果必须是<1。这样看，PAM拮抗剂在功能上基本上是NAMs，但具有一些特殊的特性。例如，如图3的模拟所示，α= 300和β=104的PAM拮抗剂产生激动剂浓度-反应曲线的左（左）位移特征模式，最大反应减小。从公式4可以看出，α的高值和β的低值会将激动剂的存在对拮抗剂效力的负面影响降低到不显著的水平，因为公式4的分母值会随着激动剂浓度的增加而增加。在实际情况下，激动剂增强了拮抗剂的效力。然而，需要注意的是，激动剂EC₅₀值的特征性左移，仅在没有受体储备的系统中看到。这是因为对放大的信号转导通路的拮抗导致EC₅₀值广泛右移（如图1C和2C所示），从而抵消了PAM效应。

图3.正变构调节剂（PAM）-拮抗剂（α > 1，β < 1）对激动剂浓度-反应曲线的影响。

在热力学方面，增强激动剂亲和力和抑制信号通路的结合对病理受体信号通路的治疗性阻断极为有利。具体来说，激动剂和调节剂的亲和力相互增强；因此，由于调节剂的亲和力在激动剂的存在下增加，随着激动剂的增加，拮抗作用增加。这一特性赋予了PAM拮抗剂独特的行为；即激动剂的浓度和拮抗剂半抑制浓度的浓度呈反比关系。与正构竞争拮抗剂和传统的NAM不同，它们的效力随着激动剂浓度的增加而降低（图4A），PAM拮抗剂的效力随着激动剂浓度的增加而增加（图4B）。

图4：正变构调节剂（PAM）-拮抗剂表现为拮抗剂IC50与激动剂浓度之间的特征性反向关系。

目前文献中报道的PAM-拮抗剂数量有限，第一个是ifenprodil，一种响应NMDA的拮抗剂（10.1113/jphysiol.1996.sp021807）。该拮抗剂表现出PAM拮抗作用的特征（即随着PAM拮抗剂的增加，激动剂的EC₅₀逐渐降低）。图4C显示了EC₅₀和PAM拮抗剂存在之间的独特关系。如公式4对α= 100的预测，拮抗剂IC₅₀增加，在低受体储备的情况下，激动剂需近十倍的增加。这种效果在图4D中实验显示，当ifenprodil阻断更高的NMDA浓度时，IC₅₀降低（注意用红色填充圆表示的曲线中点的相对位置）。同样，方程4预测，在高受体储备的系统中，由于τA的增加，随着激动剂浓度的增加，IC₅₀值的降低将被最小化。尽管如此，在实验上，这是检测PAM拮抗的一种方便方法，因为与传统的正构和变构拮抗剂不同，在实验中IC₅₀和激动剂浓度之间呈反比关系。文献中描述的其他PAM拮抗剂包括FFA-3受体[10.1124/mol.114.093294]和大麻素CB1受体[10.1124/mol.105.016162]的变构调节剂。而ifenprodil在历史上是第一个PAM拮抗剂、CB1PAM拮抗剂Org27569和PSNCBAM在探针依赖性和诱导偏倚的变构特性方面得到了更广泛的研究。　　

受体储备（Receptor reserve）：药物只占领小部分受体即可产生最大效应，未经占领的受体称为储备受体（spare receptor）。因此，当不可逆性结合或其他原因丧失一部分受体时，并不会立即影响最大效应。高受体储备反映了系统对激动剂的高敏感性，因此部分激动剂可以看起来“充分”。

偏置信号传导（Biased signaling:）：GPCRs的一个基本特性，其中激动剂可以不成比例地激活下游GPCR信号通路。偏置激动作用是配体从不同的受体构象集合中选择的结果，与经典的双态模型相反，即受体要么“开启”，要么“关闭”，这表明所有受体特异性通路的相同激活（即完全激动剂最大限度地激活所有通路）。偏置信号传导可以被解释为探针依赖，即激动结合受体遇到不同的变构状态的受体稳定的不同的细胞内调节剂（如信号转导分子，如G蛋白和抑制素）。

共结合配体（Cobinding ligand）：在变构系统中，受体同时在单独的、不重叠的位点上结合激动剂和调节剂，这被称为“共结合配体”。

竞争拮抗作用（Competitive antagonism）：激动剂和拮抗剂的结合是相互排斥的，因为它们竞争相同的结合位点。激动剂和拮抗剂的受体占据迅速平衡，每个配体的相对占据取决于其浓度和平衡解离常数。

半平衡（Hemi-equilibrium）：一种不完全的动力学状态，即激动剂、拮抗剂和受体不处于质量作用平衡，最常见的原因是由于拮抗剂在短时间试验中持续结合（如钙释放）。在这种情况下，激动剂不能达到完全的受体占用来产生最大的反应，而激动剂的浓度-反应曲线人为地抑制了最大值。

诱导偏倚（Induced bias）：变构调节剂可能改变受体，导致内源性激动剂在信号传导方面比信号传导产生偏倚在变构调节前的激动剂。

非竞争性拮抗剂（Noncompetitive antagonism）：由于拮抗剂的偏移速度相对较慢（与激动剂相比），激动剂和拮抗剂的受体占据率不能根据竞争性拮抗剂方程进行平衡。在这种情况下，配体不能有效地竞争，但观察到的反应只来自非拮抗剂结合的受体；也被称为“不可逾越的拮抗作用”。

解离速率（Offset rate）：结合分子离开受体（分离）的速度，记为k₂，单位为S^-1。

结合速率（Offset rate）：特定分子与受体结合的速度。由起始速率常数决定，记为k1，单位为M^-1s^-1。

探针依赖性（Probe dependence）：一个受体功能的探针是任何配体表示受体的功能或结合状态。变构变化对两个探针的影响可能非常不同；也就是说，一种探针（如合成激动剂）的亲和力可能会降低，而另一种探针（如内源性激动剂）的亲和力可能会增加或不受影响。在变构变化后，不同的配体与受体的相互作用没有正式的影响顺序；因此，变构效应在所有结合的正构配体中并不保守。这是关于将变构效应转化为治疗环境的一个主要问题。

伪不可逆（Pseudo-irreversible）：配体脱离受体（如激动剂）的速度很慢，足以阻断竞争配体（如拮抗剂）的结合。

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