STAT6 是治疗多种免疫疾病和癌症的治疗靶点。然而，由于分子为机制复杂、且SH2结构域结合口袋的高极性等问题，导致开发强效、选择性 STAT6 药物一直存在难点。密西根大学王少萌团队使用 PROTAC 技术开发出有效且选择性 STAT6 降解剂AK-1690，本文详细阐明了基于磷酸拟肽类分子的PROTAC 构效关系。
1. STAT6 背景介绍
STAT6 (信号转导子和转录激活子 6) 是 STAT 家族蛋白的成员。STAT6 在细胞因子信号转导中发挥作用并介导 2 型辅助 T 细胞 (Th2) 分化。因此，STAT6 在 Th2 炎症如特应性皮炎或哮喘的病理生理学中具有重要作用。此外，STAT6 还能促进已知在肿瘤部位大量存在的促肿瘤巨噬细胞，因此在调节肿瘤微环境 (TME) 中发挥作用。此外，在滤泡性淋巴瘤患者样本中发现了活化的 STAT6 突变。由于这些原因，STAT6 是多种2型自免自免和肿瘤的热点治疗靶点。
STAT6 的激活主要由细胞因子 IL-4 和 IL-13 诱导。IL-4和IL-13与IL-4α受体（IL-4Rα）结合，导致IL-4Rα细胞内部分的酪氨酸残基被受体相关的Janus激酶（JAK）或其他激酶磷酸化，生成 STAT6 的结合位点。STAT6 通过其 SH2 结构域与 IL-4Rα 结合，并被 JAK 或其他激酶磷酸化。磷酸化 STAT6 蛋白通过其 SH2 结构域相互识别含磷酸酪氨酸的肽片段，形成同源二聚体。STAT6 的二聚体形式从细胞质转移到细胞核中，与目标 DNA 结合进行基因转录。由于 STAT6 的二聚化是其核易位和基因转录活性所必需的，因此设计与其 SH2 结构域结合的小分子抑制剂已被视为针对 STAT6 的治疗策略。不幸的是，尽管过去 20 年进行了广泛的研究工作，但目前公开的 STAT6 抑制剂都缺乏高亲和力/选择性。 这里作者利用PROTAC技术，成功实现了STAT6的高效和选择性降解，具有很强的体内抗肿瘤活性。
2. STAT6 SH2结构域小分子抑制剂的设计
McMurray 此前报道了一系列基于磷酸化拟肽类前药的 STAT6 抑制剂。基于这些前药型 STAT6 抑制剂，作者合成了其母体化合物1 （表 1），并测试了其与 STAT6 和 STAT5A/B 的结合亲和力。与 McMurray 小组报告的数据一致，在生化结合测定中，化合物1对 STAT6 的结合亲和力 ( K = 3.5 μM)，对 STAT5A/B 具有较弱的结合亲和力 ( K > 5 μM)。
表 1. 新型 STAT6 配体的设计及其结合亲和力
此前，该团队采用基于苯并噻吩的磷酸酪氨酸类似物来成功设计 STAT5 降解剂(NCB,2023; JMC,2023)。因此，通过用苯并噻吩基磷酸酪氨酸模拟物替换化合物1中的肉桂酸基磷酸酪氨酸模拟物，合成了化合物2 (表1 )。化合物2对 STAT6 的结合亲和力 ( Kd = 1.2 μM) 比化合物1好 3 倍，并且对 STAT5A/B 的结合亲和力较弱 ( Kd > 5 μM)。
NCB,2023,10.1038/s41589-022-01248-4
JMC,2023,10.1021/acs.jmedchem.2c01665
接下来，对与 STAT6 复合的化合物2进行了建模（图 1 A）。对接模拟预测了化合物2的两种可能的结合模型，它们主要在 1,2,3,4-四氢异喹啉部分的方向上有所不同（图 1 A）。在两种结合模型中，化合物2中的苯并噻吩基团与Pro591紧密接触，叔丁基暴露于溶剂环境但与Glu587的侧链接触。预测的结合模型为指导了进一步的优化工作提供了结构基础。
接下来，对化合物2中的 1,2,3,4-四氢异喹啉部分进行了广泛的修饰，目的是提高与 STAT6 的结合亲和力。最后，对“尾部”基团的修饰导致 AK-068 被鉴定为高亲和力和选择性 STAT6 配体(Kd= 6 nM，选择性>500倍)。此外，验证了连接脯氨酸环与 AK-068 中苯基吗啉基的酰胺键在控制苯基构象方面发挥着关键作用（图 1B）
接下来，结果表明在 AK-068 中的叔丁基具有重要重要，修改将造成活性和选择性降低（表 3）。
预测的结合模型中（图 1B ），AK-068 中的脯氨酸环在控制“尾部”苯基的构象，以与 STAT6 有效相互作用方面发挥着关键作用。对该脯氨酸环进行了修饰同样造成亲和力降低（表 4 ）。因此，最终决定采用 AK-068 来设计 STAT6 PROTAC 降解剂的配体。
2. STAT6 PROTAC 降解剂的设计
对于 STAT6 PROTAC 降解剂的设计，重要的是确定 AK-068 中的合适位点以将其与 E3 连接酶/连接酶复合物的配体连接。预测的 AK-068 结合模型表明脯氨酸环似乎是最合适的接入位点，但也表明叔丁基是另一个接入位点。然而，表 3 的 SAR 数据不优先考虑叔丁基，并导致选择脯氨酸环作为连接 E3 连接酶配体的连接位点，并使用 cereblon 配体来设计 STAT6 PROTAC 降解剂。
为了将接头连接到 AK-068 中的脯氨酸环，合成并评估了化合物49、50、51和52 ，它们在 AK-068 的脯氨酸环上具有胺、乙酰酰胺、羟基或甲基醚基团（表5 ）。所有四种配体都以相似的高亲和力与 STAT6 结合。这些结合数据表明脯氨酸环上的这些取代对 STAT6 的结合亲和力没有负面影响(～6nM)。
接下来，设计并合成了化合物53 – 56，使用酰胺连接到 AK-068 中的脯氨酸环，并使用包含 3、4、5 或 6 个亚甲基单元的接头通过炔基连接到来那度胺的 4 位（表 6 ）。化合物53 – 56在 12 小时的处理时间内有效降低了 STAT6 蛋白水平，并分别实现了 260、120、60 和 250 nM 的 DC 50值， Dmax> 95%。
通过将化合物53-56连接子中的酰胺基团转化为醚基团，合成了一系列降解剂，分别得到化合物58 、AK- 1690、59和60 。化合物58 、AK- 1690、59和60分别显示出50、1、20和60nM的DC 50，其中Dmax>95%。因此，对酰胺基团的修饰已鉴定出几种有效的 STAT6 降解剂，其中 AK-1690 是最有效的降解剂。因此， AK-1690 作为一种高效的 STAT6 降解剂（专利: US20230295197A1）
另外通过在 cereblon 配体的氮上接入甲基以阻止其与 cereblon 的结合的阴性参照化合物 AK-1690Me（图 2 ）。
图 2. AK-1690Me 作为无活性对照化合物的设计。
为了了解 AK-1690 与 STAT6 高结合亲和力的结构基础，作者以 3.3 Å 分辨率解析了 STAT6 与 AK-1690 复合物的共晶结构（PDB ID：9BIG ，图 3 ）。
图 3. STAT6 与 AK-1690 结合的共晶结构（PDB ID：9BIG ）。
共晶结构显示 AK-1690 位于 STAT6 的 SH2 磷酸酪氨酸结合位点。抑制剂的磷酸盐通过与 Arg562 的胍基和 Lys544 的侧链胺的离子相互作用，以及侧链羟基和 Ser566 的主链酰胺氮的额外氢键来稳定。每个氟原子与 STAT6 形成氢键：一个与 Ser564 的羟基形成氢键，一个与 Arg562 的胍基形成氢键。
将 STAT6 与 AK-1690 复合物的共晶结构与预测的 AK-068 结合模型叠加显示，AK-068 的结合模型 2 与 AK-1690 的共晶结构匹配良好，偏差为 0.7 Å。
3. AK-1690 的效力和选择性评估
STAT家族蛋白由7个成员组成，即STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6，并且具有结构相似的SH2结构域。首先在 MV411 、PBMC 和 L1236 细胞中评估 AK-1690降解能力，处理时间为 12-24 小时(图 4A) 。可见，AK-068 选择性降解STAT6。
图 4. 用 AK-1690 或对照化合物处理的 MV4;11、PBMC 和 L1236 细胞中 STAT 蛋白的蛋白质印迹分析。
在 MV411 细胞系中，AK-1690 有效降解 STAT6 蛋白，DC50 = 1 nM， D max > 95%（图 4A 和4D）。在PBMC 细胞中，AK-1690的DC50 = 80 nM， Dmax为>90%（图 4 B 和4 D）。
通过蛋白质组学在全蛋白质组水平上评估了 AK-1690 的降解选择性 图 5 。在 5 μM 浓度处理 18 小时后，AK-1690 在检测到的 6,000 种蛋白质中，仅四种蛋白质的水平降低了 ≥50%。STAT6 蛋白水平降低了 79%，而 EPB41L1（红细胞膜蛋白条带 4.1）、KRT1（角蛋白 1）和 AKR7A3（醛酮还原酶家族 7 成员 A3）的水平分别降低了 60%，59 % 和 51%。值得注意的是，STAT 家族蛋白其他成员（STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5）的水平没有显着降低，这与蛋白质印迹数据一致。
图 5. PBMC 中的蛋白质组学评估 AK-1690 的降解选择性。
最后，在 Jurkat 细胞系中进行了 STAT6 HiBiT 测定，并利用该 STAT6 HiBiT 测定来研究 AK-1690 的降解机制(图 6)。结果显示 2 μM (20小时，50%?) 的 AK-1690 能够以时间依赖性方式减少生物发光信号，表明 Jurkat 细胞系中 STAT6 蛋白水平的有效降低。
4. AK-1690 体内药效评价
为了进行体内药效学评估，测试了 AK-1690 的微粒体和血浆稳定性（表 7 ）。AK-1690 在小鼠、大鼠、狗、猴子和人微粒体中具有出色的稳定性。此外，AK-1690 在小鼠、大鼠、狗、猴和人血浆中具有优异的稳定性。
基于出色的微粒体和血浆稳定性数据，继续评估 AK-1690体内减少 STAT6 蛋白的能力图 8。
图 8. AK-1690 在肺和肝中的药效 (PD) 研究。通过腹膜内注射单剂量 200 mg/kg 的 AK-1690 处理雌性 Balb/c 小鼠。
通过腹膜内 (IP) 途径向 Balb/c 小鼠注射 200 mg/kg AK-1690，并在 2、6 和 24 小时时间点收集肝脏和肺组织进行免疫印迹分析。肝组织中 STAT6 在 2、4 和 24 小时时间点降解了 >90%。在肺组织中，AK-1690 还在 2、6 和 24 小时时间点分别将 STAT6 蛋白降解了 >70%、>90% 和 >70%，表明 AK-1690 可有效降解体内STAT6 蛋白。
总体来说，文章详细公布了靶向STAT6降解剂的构效关系以及小分子共结晶（似乎以前未有类似报道），对未来的分子开发有很好的参考。但是分子的体内外活性、以及分子的类药性需要进一步优化。
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参考：
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.4c01009
