靶向蛋白降解（TPD）已成为药物发现中的革命性方法，利用细胞的内在机制选择性地降解与疾病相关的蛋白质。纳米荧光素酶 (nLuc) 融合蛋白和 NanoBiT 技术提供了两个强大而灵敏的筛选平台，用于监测 TPD 分子引起的蛋白质丰度的细微变化。尽管有这些优点，但由于标记系统上存在赖氨酸残基，人们对标记系统引入的潜在降解伪影产生了担忧，从而促进了替代工具的开发。
贝勒医学院的研究人员通过引入了 HiBiT-RR 和 nLuc K0 （不含赖氨酸残基的变体）来减轻此类伪影，且 HiBiT-RR 与原始 HiBiT 保持相似的灵敏度和结合亲和力。
纳米荧光素酶 (nLuc) 是一种 19 kDa、高度稳定、不依赖于 ATP 的生物发光蛋白，由原始深海虾荧光素酶（Oplophorus-荧光素 2-单加氧酶）改造而成，已用于开发强大的超高灵敏度筛选系统。作为降解剂功效高通量评估中常用的化学生物学工具，nLuc融合蛋白产生的强生物发光信号可以灵敏地反映活细胞或粗细胞裂解液中的实时融合蛋白水平，从而能够降解剂处理后蛋白质降解事件的动力学监测。为了进一步最小化标签尺寸，采用了 NanoBiT 技术，该方法涉及一个互补系统，其中将 11 个氨基酸肽 (HiBiT) 标记到目标蛋白质上，从而能够与 18 kDa 多肽 (LgBiT) 相互作用。这种相互作用导致活性荧光素酶的形成，该酶能够在与其发光底物(呋马嗪或其稳定形式恩度拉嗪)反应时产生光。
E2 酶与底物赖氨酸的有效泛素化对于促进泛素化反应至关重要。因此，赖氨酸残基的可及性和定位在确定其对泛素化的敏感性方面起着关键作用。 据报道，位于 E3 连接酶机制泛素可及带上的目标蛋白的赖氨酸残基对降解的贡献更大。因此，最近人们越来越担心标签蛋白或肽上引入的赖氨酸残基可能会导致降解伪影。一个典型的例子是 XY-4-88 成功降解了 GFP-KRAS G12C ，但不能降解内源性 KRASG12C (10.1016/j.chembiol.2019.12.006)。对于那些表面只有少量赖氨酸残基的目标蛋白，标签上人为引入的赖氨酸甚至可能会误导研究人员PROTAC分子。
在本研究中，研究人员提出了两种替代工具 HiBiT-RR 和 nLuc K0 ，其中所有赖氨酸残基均已替换为原始序列中的精氨酸残基，以避免降解伪影的潜在风险。结果表明，HiBiT-RR 对 LgBiT 的结合亲和力与原始 HiBiT 肽相当，且不牺牲发光强度。 HiBiT-RR 标签在检测和定量药物诱导的蛋白质降解方面与 HiBiT 一样灵敏。另一方面，通过比较 nLuc WT和 nLuc K0构建体，本文中测试的一些 PROTAC 分子可以比 nLuc K0对应物触发 nLuc WT融合蛋白更强的降解。这一发现表明，源自标记系统的降解伪影可能比目前所理解的更为广泛。它还强调了选择正确的标记系统的重要性，以帮助最大限度地减少研究蛋白质降解过程中的潜在干扰或伪影，从而提高实验结果的可靠性和有效性。
1. LgBiT 蛋白与 HiBiT-KK 或 HiBiT-RR 作用相似
由于赖氨酸是接受 E2 酶泛素转移的最常见残基。对Promega 公司HiBiT 标签原始版本 (VSGWRLF KK IS)（HiBiT-KK）中两个赖氨酸残基的影响目标蛋白的潜在降解问题，设计了无赖氨酸版本的HiBiT (VSGWRLF RR IS)（ HiBiT-RR）的酶学特性，用类似的精氨酸取代赖氨酸（图 1 A）。
首先表征了 LgBiT 蛋白与 HiBiT-KK 或 HiBiT-RR 之间的结合。固定 LgBiT 的量后，滴定了 KK 和 RR 变体的一系列 HiBiT 浓度。无论使用自制的 His-LgBiT 蛋白还是 Promega 公司 的 LgBiT 蛋白，HiBiT-KK 和 HiBiT-RR 均表现出较低的 nM EC 50值和相当的发光信号强度（图 1 B-C）。根据 nLuc 结构（PDB：7SNT ），KK 到 RR 突变位点远离荧光素酶催化袋，因此发光信号水平与预期相当。然而，从 LgBiT-HiBiT 相互作用中获得的 EC 50值比之前报道的 700 pM 弱约 10 倍。 因此，将不同浓度的 LgBiT 蛋白反向滴定到固定量的 HiBiT 变体中。在没有任何 HiBiT 肽的情况下减去 LgBiT 本身的信号后，HiBiT-KK 或 RR 仍然显示出与正向滴定中相似的 EC 50水平（图 1 D-E）。
图 1. HiBiT-RR 显示出与原始 HiBiT-KK 相当的 LgBiT 蛋白结合亲和力和相似的发光输出。
使用光栅耦合干涉测量法 (GCI) 在没有酶底物的情况下测定了它们的亲和力和结合动力学。与 HiBiT-KK 相比，HiBiT-RR 表现出稍微优越的性能，在高和低浓度 LgBiT 的条件下都表现出较慢的解离速率 ( koff )（图 2）。
图 2. HiBiT-KK 和 RR 的光栅耦合干涉测量显示了可比较的 LgBiT 蛋白结合动力学。
2. HiBiT-RR 系统验证PROTAC分子
进一步，表征了不同机制的四种 BTK PROTAC（RC-1、NX-2127、 NRX-0492、和 DD-03-171 ）的降解效率（ RC-1 表示可逆共价 PROTAC，其他表示可逆 PROTAC），使用用 HiBiT-KK 或 RR 标记的 BTK 激酶结构域（残基 382-659，BTK KD ）（图 3 ）。结果表明，HiBiT-RR 构建体（图 3 B、D）能够重现传统 HiBiT-KK 构建体（图 3 A、C）中观察到的 PROTAC 特征参数，例如 DC 50 、 D max和强在高剂量的 RC-1 中观察到钩状效应。
图 3. HEK293T 细胞系中 HiBiT-KK 或 HiBiT-RR 标记的 BTK 激酶结构域的 PROTAC 降解效力比较。
进一步将 HiBiT 敲入细胞系中测试了这两个系统。通过 CRISPR 敲入 HEK293 细胞中 BRD4 N 末端的 HiBiT-KK 或 -RR，MZ1 和 dBET6（两种 BRD4 PROTAC）进一步用于表征 HiBiT-KK 中降解效力的差异或-RR 敲入细胞。同样，MZ1 降解 HiBiT-BRD4 时没有观察到显着的 DC 50或D max差异（图 4 A-D）。对于 dBET6，观察到一个边际差异，即 HiBiT-RR BRD4 在高浓度 dBET6 处理中比 HiBiT-KK 经历更慢的降解动力学，尽管观察到类似的D max ，并且达到平台时的降解效力显示小于 2 - 倍差异（图 4 E-H）。总而言之，表明 HiBiT-RR 在基因组敲入系统中也与原始 HiBiT-KK 一样有效。
图 4. 将 HEK293 细胞系中的 HiBiT-KK CRISPR 敲入 BRD4 与使用 dBET6 (A–D) 和 MZ1 (EH) 的 HiBiT-RR 敲入进行比较。
3. nLuc (nLuc K0) 优化
综上，已经验证 HiBiT-RR 作为蛋白质丰度监测的可行工具，其灵敏度与 HiBiT-KK 相当，但消除了降解伪影的潜在缺陷。然而，单独使用 HiBiT 标签蛋白并不能在时间过程研究中连续监测蛋白水平的变化，除非 LgBiT 也被同步优化。然而，潜在的泛素化仍然可能发生在野生型 LgBiT 的赖氨酸残基上。因此，验证了无赖氨酸版本的 nLuc (nLuc K0 ) ，其中原始 nLuc 序列中的所有赖氨酸都突变为精氨酸（图 5 A）。
通过将 nLuc WT 或 K0 融合到 RIPK1 激酶结构域 (RIPK1 KD ) 的 N 末端并在 HEK293T 细胞中表达，将测试一系列 RIPK1 降解剂（表 S1 ）的降解能力，并与这些构建体进行了头对头比较（图 5B 、C）。对于大多数化合物，nLuc WT 和 K0 构建体均显示相似的最大降解 ( D max ) 和 DC 50值，而阴性对照化合物 4172NC 在两种构建体中均未显示降解。但对于化合物 5037，当使用 nLuc K0构建体时，观察到 DC 50降低了 3 倍（nLuc WT 47 nM 对比 nLuc K0 147 nM）。在化合物 5077（一种基于 CRBN 的 RIPK1 PROTAC）中也观察到类似的效力降低（nLuc WT = 10 nM 对比 nLuc K0 = 39 nM）。 这种效力降低可能是由于 nLuc 表面上可泛素化的赖氨酸残基被去除，突出了 nLuc 蛋白上发生泛素化时潜在的降解假象。过渡到 K0 构建体可以避免 nLuc 部分的此类降解伪影。此外，免疫印迹证实了两种 nLuc-RIPK1 KD融合蛋白的降解（图 5D ）。
图 5. 转染的 HEK293T 细胞系中 nLuc WT和 nLuc K0标记的 RIPK1 激酶结构域降解效力的比较。
总体而言，该研究强调了选择适当的标记系统（例如 HiBiT-RR 和 nLuc K0）的重要性，以尽量减少研究蛋白质降解过程中的潜在干扰和伪影。通过提高实验结果的可靠性和有效性，这些工具有助于推进利用 TPD 分子的药物发现工作，最终实现更有效的治疗干预。
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References:
https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acsmedchemlett.4c00271
