【JMC】剂量响应曲线、IC50 和 EC50 值的测定与注意事项

近期，《Journal of Medicinal Chemistry》杂志讨论了剂量响应曲线的测定，效力和构效关系时使用 IC50值的注意事项，并鼓励使用 pIC50 ± SEM 来报告数据。

1. 剂量反应模型：简介

早期药物发现的优化依赖于小分子苗头化合物的药物化学修饰，以提高所需反应（抑制、激活、途径/生物标志物调节）的效力和功效。这些研究旨在评估小分子的几个不同方面（即效力、功效、毒性/安全性、渗透性等）。优化方案可以依赖于热力学平衡（结构-活性关系）测量、或动力学（结构-动力学关系）测量。前者依赖于测量因变量（调节剂引起的响应/效应 ）作为在假定平衡的固定时间改变自变量浓度（调节剂的剂量/浓度）的函数，而后者利用几种不同浓度的调节剂产生进度曲线测量。

本文讨论了剂量反应曲线 (DRC) 对平衡状态下进行的参数分析。简而言之，在平衡状态下，如果化学实体（在本例中为苗头小分子或药物）的浓度变化导致效果发生可测量的变化，则这就导致了剂量－效应关系。

2. 剂量反应曲线的设计与分析

对剂量反应关系的粗略观察表明，它本质上是 S 形的，具有明确的上限和下限（平台区域）， IC50 的数学形式（方程 1）：

剂量反应曲线通常以半对数标度绘制，X 轴（代表抑制剂浓度）以摩尔浓度为底的对数， Y 轴（代表%活性）为线性标度。

有几个原因决定了X轴使用对数刻度，我们在此列举其中几个：(1) 使用线性刻度时会获得双曲线响应曲线。这使得信息内容最多的区域被压缩成图的一小部分。通过使用 log10 函数，可以生成一条 S 形曲线，该曲线在从无响应到最大响应的过渡中具有相对线性的段。(2) 对数刻度还可以轻松解释传统药理学研究中存在竞争性受体拮抗剂时的平行右移。

除了平台期（最大功效）和斜率信息外，剂量反应曲线 的分析还可以得出关于效力的重要见解（曲线沿剂量轴的位置，可以产生重要参数，例如 IC50 、 IC90和 IC99 ）。IC 50 是产生50%抑制/可测量效果所需的抑制剂浓度。IC 50是结果的综合参数，高度依赖于测定条件，不应以分子术语解释。IC90 或 IC99 是表示（接近）完全抑制的术语，通常可以通过直接拟合来估计，或者如果有 IC50 估计值，则可以使用 方程式 2 来估计，

其中X 是抑制百分比， h 是曲线线性部分的 Hill 系数（斜率），IC50 是引 50% 抑制时的抑制剂浓度。

3. 剂量反应曲线的解析作用机制

除了效力的测量（化学实体的浓度，即小分子/药物/代谢物，50% 的效果）和功效之外，还可以从剂量反应曲线 获得重要的机制信息。

在 log10 图上，对于理想的剂量反应曲线 模型，过渡阶段的斜率通常为 1 或接近 1。但是，如果不加约束，有时过渡阶段的斜率会显显著小于或大于 1如果绘制抑制（或-1，如果绘制残余活性）。这些参数可能揭示重要的作用机制：(1) 对于受体或蛋白质寡聚，小分子的结合可能会增加或减少与后续分子结合的亲和力。这通常表现为正协同性或负协同性，斜率分别大于 1 或小于 1。这通常由四参数希尔方程来描述。(2) 与 1 显著不同的 Hill 斜率也可以表明接近紧结合条件的化学计量结合。在这些条件下，受体/蛋白质/酶的抑制剂的平衡解离常数显著低于测定中可用于获得合理信噪比的最低蛋白质浓度。因此，无论小分子对蛋白质的亲和力如何，IC 50值都不会低于[ E0 ]/2，其中[ E0 ]是活性蛋白质浓度。 (3) 由于结合速率取决于小分子的浓度，因此在不同浓度的抑制剂下达到的平衡会有所不同（浓度较高时平衡较快，反之亦然）。这可能会导致异常的斜率，特别是对于具有非平衡缓释模式的抑制剂。(4) 通过非药理学机制（例如通过蛋白质变性）起作用的小分子通常具有hill 系数远大于 1 的剂量反应曲线 。(5) 斜率大幅偏离 1 可能还有其他原因，特别是对于细胞所有的剂量反应。这些可能是由吸收、隔离等方面造成的。

药物兴奋效应是指酶在较高浓度下开始抑制之前、在较低小分子浓度下的稳定和潜在激活。这可能是由于多种原因造成的，其中一个明显的原因是蛋白质三级结构在低浓度下稳定，从而导致活性增加。从不同小分子和不同目标蛋白，药物兴奋效应可能有很大差异。

4. 分析剂量反应曲线的潜在缺点和注意事项

有很多因素会影响剂量反应曲线的分析和解释。稳定性（在低浓度下）和抑制（在高浓度）相互对立的影响使得很难同时设计数百个具有不同效力的小分子的高通量剂量反应曲线实验（传统方案进行 2 倍或 3 倍稀释，以覆盖广泛的抑制剂浓度范围,约 5 或 6 的 log10单位）。这通常会考虑小分子的稳定或超出其溶解度极限的范围。后一种情况经常出现在苗头分子识别中。由于缺乏平行实验来确定小分子的溶解度，而小分子的溶解度通常可能与早期药物发现的速度和通量不相容。这导致曲线显示为部分抑制（即，即使在饱和小分子药物浓度下仍保持显着活性）。如果化合物出现部分抑制，则必须确保这不是人为的，因为与溶解度相关的方面。此外，进行定期检查以确保小分子不存在时间依赖性或储存依赖性降解应该，是准确的剂量反应曲线测定的重要组成部分。另一个突出的问题是，在极端浓度下缺乏可靠的实验数据点，这导致参数估计错误。此外，应进行适当的独立重复以确保再现性。

酶类靶标剂量反应研究的另一个主要限制是它们对底物浓度的敏感性。任何测量的 IC50 都是测定混合物中底物浓度（与K不同）和进行测定的确切条件的函数。底物浓度的变化会对测量的效力产生深远的影响，具体取决于抑制机制（即正构或变构）。对于以相互排斥的方式与底物结合的正位抑制剂（竞争性抑制），底物浓度的增加会导致抑制剂的效力降低。对于变构抑制剂，有两种可能性。对于底物结合对于抑制剂结合（反竞争性抑制，uncompetitive）增强的情况，增加底物浓度（大约其Km ）将显示出抑制剂效力的增加。另一种可能的结果是非竞争性抑制（noncompetitive），其中底物和抑制剂的结合是独立的。在这种情况下，底物浓度的任何变化都不会影响抑制剂的效力。在解释参数时需要警惕底物浓度和抑制剂效力之间的关系。

最常见的是，在苗头分子鉴定实验中，DMSO 是溶解亲脂性小分子的首选溶剂。这是因为它是非质子传递的、相对惰性、无毒且在高温下稳定。然而，使用 DMSO 作为溶剂的一个令人担忧的问题是，在剂量反应实验中，其浓度的增加有可能引入 DMSO 介导的药理学读数干扰。这意味着对于细胞研究，剂量反应曲线的 DMSO 浓度应不超过 0.1-0.5%；对于生化研究，剂量反应曲线的浓度应不超过 1-2%，并通过适当的对照来证明最高浓度不会导致干扰。

小分子结合和调节的监测取决于易于处理的报告系统。在大多数情况下，这些报告系统是荧光、发光和/或吸光度。许多小分子会干扰这些读数。小分子化合物可以通过吸收入射光或测定中发射的光来猝灭信号，从而导致信号衰减。这也称为内部过滤效应（inner filter effect），这种干扰的程度取决于消光系数和测定混合物中化合物的浓度。在典型的剂量反应曲线实验中，小分子的浓度在x轴上增加，这种效应在浓度较高时会被放大，因此应注意发现和过滤这种伪影。由于小分子固有的荧光特性，可能会出现另一种潜在的干扰。发荧光的化学骨架的突出例子是呫吨衍生物(例如罗丹明、荧光素)、香豆素衍生物和花青衍生物(例如花青、部花青)。

剂量反应曲线解释中的其他干扰因素包括：（1）随着抑制剂浓度的增加，关联率的增加使非平衡慢速或不可逆抑制剂的剂量反应曲线解释变得复杂，特别是当忽略时间效应时。(2) Hook 效应是一种常见于 PROTAC 诱导的即将发生的蛋白水解降解模式的剂量反应曲线中的现象、或在评估抗原抗体相互作用的情况下。这种效应在小分子剂量反应曲线中并不十分普遍。(3) 大多数剂量反应曲线符合经典 Hill 模型（四参数模型），但有时曲线具有多相特征，具有多个拐点（包括兴奋效应）。在解释之前需要对这些实例进行适当的建模。

5. 分析剂量反应曲线时的统计考虑因素

剂量反应曲线通常用于早期药物发现，以确定结构-活性关系并决定是否开发化合物或化学系列。因此，以统计稳健的方式确定 IC50 和 EC50 值非常重要。众所周知， X轴摩尔浓度的剂量反应曲线给出 IC50 /EC50 估计值的正偏态分布；即，分布曲线是不平衡的。这意味着获得的数据违反了参数分析的要求之一，即数据的分布应近似正态（高斯）分布。在这种情况下，必须使用非参数统计。相反，剂量反应曲线的轴是摩尔浓度的 log10 值，通常会产生近似正态分布的 log10 IC50/EC 50估计值；即，数据是参数化的（图1）。一般来说，如果可能的话，最好使用参数统计分析，特别是对于只有少量独立重复可用的数据。

剂量反应实验参数估计的方法涉及使用非线性模型（例如，对数逻辑、对数正态、Weibull关系等）以最大似然或（非线性）最小概率近似剂量反应数据，方程３。

其中, x是剂量，y是响应，假设随机误差呈正态分布，均值为零，标准差为 σ。

非参数数据的集中趋势和分布的适当度量是中位数和四分位距。通常，使用三次独立重复来确定 IC50 或 EC50 值，这意味着无法确定四分位数范围，因为至少需要五次重复。相反，使用 log10 x轴刻度获得的数据可以使用平均值±标准差 (SD) 、或更常见的平均值 ± 标准误差 (SEM) 来报告。通常以 pIC50 (−log10 IC50 ) 值报告，数值越大，效力越高。由于 pIC50值与 pH 值相似，可以直观地理解 pIC50 值。

药物发现科学家对其系列中的不同药物之间、或药物与基准化合物之间是否存在统计学上的显著差异感兴趣。如果可能的话，参数分析总是首选，因为它具有更高的统计功效，并且可以使用更多的测试，这意味着可以分析更复杂的实验方案。相比之下，使用非参数分析更难以看到统计上显着的差异，并且复杂的分析需要对数据进行区分，从而导致错误的风险增加（其中错误地认为存在差异或没有差异）。

总之，剂量反应曲线应始终使用 log10 X轴处理来确定 IC50/EC50估计值。