当前许多共价药物发现方案，包括共价 EGFR 和 BTK 抑制剂的计划，都涉及向确定的配体添加反应性官能团。然而，新兴技术使得从亲电试剂的角度来发现共价配体成为可能，其中在基于结构的优化之前识别出针对感兴趣的蛋白质靶标的共价配体。在本文，我们将讨论共价药物发现的新兴技术的工具。

许多新兴的共价配体筛选平台涉及基于质谱的检测，通过化合物和蛋白质之间的共价键形成来实现。还使用了其他表型筛选、DNA 编码库或计算方法，然后将其与基于 MS 的验证、基于 ABPP 的实验相结合，为选择性和结构生物学提供信息，从而实现共价药物苗头。表1 总结了最重要的共价筛选方法。商业化的亲电子片段类化合物库的增长是促成这些亲电子优先发现策略兴起的关键因素。

最初，基于 MS 的化合物筛选源于“束缚(tetehering)”，这是一种自 2000 年以来采用的技术，它使用与二硫化物连接的化合物库来识别与半胱氨酸相邻口袋结合的片段。结合的分子（可以是内源的、或工程化的）与半胱氨酸进行二硫键交换，与蛋白质形成加合物，并通过 MS 检测进行混合(pooled)筛选可以识别结合的化合物。结合片段可以以基于片段的方法，以鉴定高亲和力配体。该策略最初旨在识别具有挑战性的靶标的可逆配体，可以通过用丙烯酰胺等亲电子试剂替换二硫键来维持共价结合，就像最初的共价 KRAS(G12C) 抑制剂^{(10.1038/nature12796)}的情况一样。这种方法还用于发现调节蛋白质-蛋白质相互作用的化合物，最近的一项研究采用了类似的束缚策略，即使用醛与赖氨酸残基形成亚胺^{(10.1002/anie.202008585)} 。

最近，使用完整 MS 筛选了 993 种丙烯酰胺和氯乙酰胺的商业化文库，以鉴定去泛素酶 OTUB2 和焦磷酸酶NUDT7 的共价配体 ^{10.1021/jacs.9b02822}。作者使用 OTUB2 和 NUDT7 与命中化合物的共晶结构来片段延伸片段以增加效力。

使用完整 MS 筛选方法结合结构引导设计来识别针对蛋白质靶标的共价片段配体。

相同的化合物库还用于筛选肽基脯氨酸顺反异构酶-Pin1，该酶在多种肿瘤类型中过表达或激活，但选择性靶向具有挑战性 ^{10.1038/s41589-021-00786-7} 。在共价抑制剂靶点识别 (CITe-Id) 化学蛋白质组学实验中，所得共价抑制剂对 Pin1 具有选择性，并且可有效抑制小鼠神经母细胞瘤的生长。

Sulfopin 是 Pin1 的共价抑制剂。

共价配体筛选的另一个例子是筛选了一系列共价化合物，导致了第一个批准的 KRAS(G12C) 抑制剂 sotorasib。通过三种测定法筛选了 3,300 种丙烯酰胺化合物文库：硫醇反应性测定法、RAF 偶联核苷酸交换测定法和完整 MS 测定法 ^{10.1021/acsmedchemlett.9b00258} 。结合共结晶结构显示配体结合如何KRAS口袋，这项工作为快速发现 KRAS(G12C) 抑制剂提供了基础。

KRASG12C 共价抑制剂

DNA 编码文库(DEL, DNA-encoded libraries) 提供了一种替代方法，可以筛选大型小分子文库。与 MS 或 ABPP 方法不同，共价在 DEL 筛选方面没有特殊优势，但 DEL 允许通过固定、富集、扩增和测序的工作流程筛选更大的共价文库。在过去的 5 年中，半胱氨酸靶向 DNA 编码或蛋白-核酸编码文库已被用于识别溴结构域分子（PCAF 和 BRD4），以及 JNK1、MEK2 和 HER2。进一步的工作探索了共价 DEL 筛选工作流程的富集步骤的改进，其不同之处在于共价接合阻止了 DNA 标记分子的洗脱。通过针对 DNA 编码蛋白库筛选，还鉴定出了 MAP2K6 的共价配体^{10.1021/jacs.7b04880}。随着共价 DEL 文库规模的扩大和 DEL 商业可用性的增加，包含亲电分子的 DEL 将在共价配体发现中变得更加广泛，尽管必须牢记富集工作流程和化合物稳定性方面的独特考虑。

从 DNA 编码的小分子文库 × 蛋白质文库 筛选发现共价激酶抑制剂

大多数共价对接计算程序依赖于在小分子配体和相应氨基酸位点之间的预定义键的约束下进行对接。共价对接平台 GOLD 使用的一个例子是虚拟筛选 NEDD8 激活酶 (NAE) 的共价抑制剂，其中三个命中化合物被确认为新型 NAE 抑制剂^{10.1021/ci5002058}。

针对共价配体的有效虚拟筛选策略：新型 NEDD8 激活酶抑制剂的鉴定

用于虚拟筛选的 DOCKovalent 方法的开发促进了硼酸 AmpC β-内酰胺酶抑制剂以及 JAK3 的氰基丙烯酰胺抑制剂的发现¹⁶⁹。

DOCKovalent 使用非共价对接方法预先生成亲电虚拟库的构象和状态，然后针对目标亲核试剂对每个状态进行采样。相同的方法已用于鉴定激酶 MKK7 的新共价抑制剂，以及结合 KRAS（G12C）以破坏蛋白质稳定性并加速核酸交换的化合物。

除了筛选之外，共价对接也是研究已知共价配体的结合模式的有用工具。例如，GOLD 已用于模拟含醛蛋白酶体抑制剂 MG132 的结合。AutoDock 使用灵活的侧链方法，将共价配体视为氨基酸侧链，并使用基于物理的评分函数对这种灵活的“侧链”的姿势进行评分，该评分函数评估配体-蛋白质相互作用的能量学，如蛋白质的其余部分保持刚性。另一种方法称为 CovDock，基于薛定谔GLIDE对接算法和 Prime 结构细化方法。CovDock 使用传统的非共价对接方法将配体与蛋白质靶标对接，然后对共价键连接进行建模并完善复合物。这种方法没有考虑亲电子试剂的反应性，这可能限制虚拟研究具有不同亲电官能团的对接配体差异的能力。

总的来说，当亲电子试剂的反应性和修饰位点已知时，共价对接软件可以提供有关配体-蛋白质相互作用的有用信息。

化学蛋白质组学平台能够直接在复杂的生物系统中鉴定共价化合物及其靶蛋白上相应的配位位点。化学蛋白质组学的进步促进了针对不可成药靶标的共价配体的药物发现，并能够对整个蛋白质组中的共价配体进行选择性分析，以识别这些配体的靶标和脱靶。接下来将讨论反应性配体热点的化学蛋白质组学分析、ABPP 筛选平台和靶点识别。

ABPP 有助于发现复杂生物样品中的共价配位位点和相应的配体。ABPP 是由 Cravatt 和 Bogyo 发明，使用活性位点定向化学探针，共价靶向各种酶类的催化残基，包括水解酶、蛋白酶和激酶。该技术通常使用基于凝胶的测定，用于获得生物环境中活性酶的功能读数。ABPP探针包含与亲核氨基酸（例如半胱氨酸）共价反应的弹头和用于监测探针结合的报告基团，例如用于后续点击化学应用的荧光团、生物素或炔部分（下图a ）。

最近的 ABPP 方法不再关注活性位点，而是使用 MS 和广泛反应的化学探针来绘制变构位点。在 isoTOP-ABPP（同位素串联正交蛋白水解 - 基于活性的蛋白质分析）方法中，使用带有炔烃的碘乙酰胺探针来识别蛋白质组中的高反应性半胱氨酸（图b） 。炔烃基团可用于将探针修饰的蛋白质连接到TEV 蛋白酶可切割标签，该标签包含由同位素轻或重缬氨酸分隔的叠氮基团和生物素部分。这些功能能够富集探针修饰的肽，并使用 MS 对轻质和重质样品进行串联分析，在控制运行间变异性后，可以在样品之间进行定量比较，包括共价化合物的竞争分析。使用这种方法，发现半胱氨酸的高反应性预测了它们在催化和翻译后修饰位点的功能。

总体而言，反应性分析生成了数千种蛋白质的大量信息，最终提供了亲核（通常是半胱氨酸）氨基酸反应性的图像。该信息可用于在药物发现计划中选择适当的蛋白质靶标，或识别先前可能被认为不可配体或不可成药的感兴趣蛋白质上的变构位点。

IsoTOP-ABPP 还可用于识别已知亲电子药物的蛋白质靶标。例如，这种方法应用于富马酸二甲酯，用于治疗自身免疫性疾病。尽管富马酸二甲酯用于治疗牛皮癣已有三十年的历史，并于 2013 年被 FDA 批准用于治疗多发性硬化症，但富马酸二甲酯的直接共价靶点直到最近仍不清楚。在一项研究中，化学蛋白质组学方法用于鉴定蛋白激酶 Cθ (PKCθ) 和 IRAK4 作为富马酸二甲酯的靶标。在这两种情况下，半胱氨酸残基的共价结合破坏了蛋白质-蛋白质相互作用以调节免疫细胞功能。破坏 PKCθ 与共刺激受体 CD28 的相互作用会减少 T 细胞活化，破坏 IRAK4-MYD88 相互作用会抑制浆细胞样树突状细胞中干扰素-α 的产生。

共价配体不仅可用作功能抑制剂，而且在新兴的邻近诱导中也具有重要作用。共价药物发现平台通过发现针对 E3 泛素连接酶的共价招募剂，促进了靶向蛋白质降解方法的扩展。尽管大多数双功能降解分子（蛋白水解靶向嵌合体 (PROTAC)）会招募 E3 连接酶 cereblon (CRBN) 或 von Hippel–Lindau (VHL) 蛋白来降解靶蛋白，但仍有超过 600 种具有不同底物范围的 E3 连接酶。自 2019 年以来，共价招募已被用于验证大部分用于靶向蛋白质降解的 E3 连接酶，包括 RNF114、RNF4、DDB1 和 DCAF16、DCAF11、 KEAP1 以FEM1B。在一项研究中，使用双功能 FKBP12 和 BRD4 降解剂，作者将 DCAF16 确定为负责降解的目标 E3 连接酶 。这些发现导致了现在可用的各种共价 E3 募集分子。

除了降解之外，非抑制性共价配体的鉴定还有可能有助于发现新的接近诱导分子。例如，使用共价去泛素酶招募剂开发了一种称为去泛素酶靶向嵌合体（DUBTAC）的靶向蛋白质稳定平台。一般来说，通过共价配体筛选鉴定非抑制性变构配体有可能促进其他酶（例如激酶和脱乙酰酶）的招募以靶向蛋白质并将蛋白质功能引导至新底物以获得治疗益处。

大多数蛋白质反应性共价药物往往是亲电子的，以便能够与亲核氨基酸发生反应。相比之下，亲核药物可以与亲电辅因子和翻译后修饰发生反应。几种含肼化合物充当单胺氧化酶 (MAO) A 和 B 的基于机制的抑制剂，通过 MAO 的激活能够使黄素辅助因子烷基化，从而抑制该酶。ABPP 原理和“反极性”探针已用于研究亲电翻译后修饰，例如可与含肼化合物发生反应的 N 末端丙酮酰基和乙醛酰基修饰。基于肼的探针也被用来帮助鉴定和表征具有亲电辅因子或翻译后修饰的蛋白质的配体。

半胱氨酸的低丰度可以实现选择性，但限制了共价靶向特定目标蛋白质的机会。这个问题促使科学家们研究其他亲核氨基酸的靶向，特别是赖氨酸。由于赖氨酸的ε-氨基在生理条件下亲核性较低，发现有效的赖氨酸靶向共价配体需要鉴定异常反应性的赖氨酸。使用多种赖氨酸导向探针的 IsoTOP-ABPP 实验已证明在分析整个蛋白质组的赖氨酸反应性方面非常有效。通过 isoTOP-ABPP 实验，鉴定出超过 9,000 个可配位的赖氨酸，并且更精细的含五氟苯酚或含N-羟基琥珀酰亚胺酯的化合物可以选择性地标记感兴趣的特定蛋白质。在这些实验的基础上，合成了大约 180 个亲电子试剂的文库，然后进行 isoTOP-ABPP 实验以评估不同化学型的选择性并鉴定可与小分子配位的赖氨酸。这项研究产生了更广泛的反应性亲电子试剂，例如二醛，可用于进一步的赖氨酸分析实验，但也鉴定了反应性较低的亲电子试剂，包括N-酰基-N-烷基磺酰胺，其以前曾被用作生物共轭的工具。

人类蛋白质组中亲氨基化合物-赖氨酸相互作用的全局图。

大多数赖氨酸靶向配体都是使用基于结构的方法从现有配体设计的，通常是通过将亲电子磺酰氟、氟硫酸盐或乙烯基砜合理地放置在适当的方向与邻近已建立的结合位点的赖氨酸的ε-氨基反应。此类配体包括动力学运甲状腺素蛋白稳定剂 、异构体选择性PI3Kδ抑制剂以及细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2) 和Hsp90的抑制剂。结合全面的亲电子分析、赖氨酸导向的化学蛋白质组学和结构引导的方法将使科学家能够利用配体结合位点附近丰富的赖氨酸残基来增强共价药物的发现。

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参考: doi.org/10.1038/s41573-022-00542-z