a ，NNC2215是一种带有葡萄糖敏感开关的胰岛素分子。当葡萄糖浓度增加时，开关平衡至开放状态，并且 NNC2215 的胰岛素受体亲和力较高，从而有助于预防高血糖。当葡萄糖水平降低时，开关平衡至关闭状态，干扰 NNC2215 与胰岛素受体结合的能力，从而有助于预防低血糖。b ，NNC2215 的开放式和封闭式 3D 模型。胰岛素骨架显示为丝带，开关元件（葡萄糖苷和大环）显示为棒状表示（基于PDB：6PXV）。
a ，NNC2215，具有 B29 处的大环和 B1 处的葡萄糖苷的双重缀合。对照化合物 NNC2215a 仅含有 B29 大环。b，ITC测量葡萄糖与游离大环化合物的亲和力， Kd=98 μM。c ，使用native MS 分析葡萄糖与 NNC2215 ( Kd = 2.1 mM) 和 NNC2215a ( K d = 0.5 mM) 的结合。
4. 葡萄糖敏感胰岛素 NNC2215 体外理化性质分析
使用等温滴定量热法 (ITC)，显示 NNC2215 的游离大环以 98 µM 的解离常数 ( K d ) 与葡萄糖结合（图2b ）。使用native MS 分析来研究 NNC2215 与葡萄糖的结合。正如预期的那样，偶联物中葡萄糖苷的存在改变了 NNC2215 相对于游离大环化合物的葡萄糖亲和力，发现 NNC2215 与葡萄糖的结合 Kd为2.1 mM，在糖尿病的情况下，为严重低血糖。通过 MS 发现对照化合物 NNC2215a 仅具有大环化合物，可与葡萄糖结合， Kd为 0.5 mM。大环化合物与胰岛素的偶联将适度改变其葡萄糖亲和力（相对于游离大环化合物）。类似地，将白蛋白结合部分附着到胰岛素或其他蛋白质上通常也会改变它们相对于游离配体的亲和力，这可能是由于偶联部分与近端蛋白质及其侧链的相互作用较弱。总体而言，通过native MS 测量，NNC2215 和对照化合物 NNC2215a 的葡萄糖亲和力比游离大环化合物弱约 20 倍和 5 倍，从而证明已经实现了合适的转换动力学（图2c）。结合曲线最陡的部分与低血糖（低于 4 mM 葡萄糖）一致。通过将 NNC2215 模型叠加在胰岛素-胰岛素受体复合物蛋白质结构 (PDB 6PXV）上，建立了胰岛素受体与 NNC2215 结合的结构模型，其中开关处于打开或关闭状态来举例说明其功能。如图1b所示，当开关闭合时，胰岛素B链的C端部分和胰岛素受体的C端结构域之间发生冲突，称为α-CT。已知 α-CT 结构域是胰岛素结合的关键部分 。这种空间位阻是在低葡萄糖浓度下观察到的 NNC2215 较低受体亲和力的驱动力，即开关主要填充闭合构象。相比之下，开放状态的模型与能够与受体结合的完全活性的胰岛素构象兼容。为了在体外研究 NNC2215 与胰岛素受体的葡萄糖敏感性相互作用，在存在、或不存在不同葡萄糖浓度的情况下进行了胰岛素受体结合研究，从而比较了人胰岛素受体 A (hIR-A) 与 NNC2215 、人胰岛素、和德谷胰岛素（一种酰化长效基础胰岛素）（图3a-c ）。NNC2215 的独特之处在于，结合曲线受到葡萄糖浓度增加的影响（图3a ）。相对于 hIR-A 对人胰岛素的亲和力，在 0、3、5、10 和 20 mM 的葡萄糖浓度范围内，对 NNC2215 的亲和力从 0.75% 增加到 2.9%、4.3%、6.5% 和 9.2%，而德谷胰岛素、人胰岛素具有恒定的亲和力（表1和图3d ）。
图 3：NNC2215 的葡萄糖依赖性 hIR-A 亲和力。
a – c ，在 0 至 20 mM D-葡萄糖存在下，NNC2215 ( a )、人胰岛素 ( b ) 和德谷胰岛素 ( c ) 的 hIR-A 125 I-胰岛素的代表性位移曲线。d，随着葡萄糖浓度的增加，NNC2215和德谷胰岛素相对于人胰岛素的hIR-A亲和力。e，NNC2215和德谷胰岛素在低(3mM)和高(20mM) 葡萄糖浓度下的剂量依赖性曲线。
