心力衰竭是导致并发症和死亡的主要原因。心力衰竭时心内压升高和肌细胞拉伸会触发反调节利钠肽的释放,这些肽通过其受体 (NPR1) 发挥作用,影响血管舒张、利尿和利钠,降低静脉压并缓解静脉充血。重组利钠肽输注用于治疗心力衰竭,但受到效果持续时间短的限制。
本文报告了再生元对靶向膜结合鸟苷酸环化酶受体 NPR1 的单克隆激动剂抗体(REGN5381) 的开发。REGN5381 是 NPR1 的变构激动剂,可诱导受体活性构象,优先对静脉血管产生血流动力学影响,包括降低收缩压和静脉血压。在临床1期试验的健康的人类志愿者中,REGN5381产生了预期的血流动力学效应-降低静脉血压,而利尿和利钠作用没有明显变化。
1. 背景介绍
心力衰竭 (HF) 仍然是一种进行性致命疾病,影响着全球超过 6400 万人,5年生存率为 50%。HF 的几种体征和症状(肺水肿、胸腔积液和腹水)是静脉充血的表现。对于持久降低静脉压,从而减少 HF 住院和死亡的疗法,存在大量未满足的需求。
利钠肽 (NPs,Natriuretic peptides) 是一个具有不同生理功能的激素原家族,包括心房利钠肽 (ANP)、脑利钠肽 (BNP) 和 c 型 NPs。ANP 和 BNP 从心肌细胞中释放后,ANP 和 BNP 被蛋白酶 corin 和 furin 酶促裂解成活性肽。这些活性肽会迅速降解,循环半衰期分别为 30 秒和 6.4 分钟左右。活性肽与膜结合的鸟苷酸环化酶、利钠肽受体 1/A(NPR1,natriuretic peptide receptor 1/A,也称为 NPRA)结合并通过其发出信号。NPR1 优先结合 ANP 和 BNP,激动作用后,将细胞内三磷酸鸟苷转化为环磷酸鸟苷 (cGMP)。NP 被认为是血管体积和静脉张力的重要调节因子,在抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统方面起关键作用。
NPR1 中的人类遗传变异与血压 (BP) 表型有关。这些数据确立了 NPR1 作为高血压、HF 和其他血压相关疾病患者血流动力学调节治疗靶点的优先权。尽管如此,NPR1 和 HF 的遗传变异之间的关联仍有待证实。
目前有调节 NP 途径的治疗方法。几种重组 NP 已被批准用于 HF 患者,包括重组 ANP和重组 BNP。双重血管紧张素受体阻滞剂和脑啡肽酶抑制剂沙库巴曲/缬沙坦是 NP 通路的间接激活剂,于 2015 年被批准用于射血分数降低的 HF 患者,并于 2021 年被批准用于射血分数保留的 HF 患者。
研究人员使用 VelocImmune 技术进行了高通量筛选,以鉴定 REGN5381,这是一种基于人免疫球蛋白 G4 的研究性单克隆抗体,在存在或不存在内源性配体的情况下,可结合并直接激活 NPR1。使用激动剂抗体直接通过 NPR1 进行信号传导可能实现其他 NP 通路疗法中常见的许多有益生理反应,包括优先降低静脉压,但具有更高的选择性、效力和增强的持久性。
2. NPR1 的人类遗传学证据
使用 Regeneron 遗传学中心提供的测序数据进行了遗传分析,以确认并扩展了对 NPR1 功能的终身遗传调节的见解。在来自6个队列和5个群体的718,386个具有外显子组测序数据的个体中,首先证实了两个先前报道和功能验证的功能丧失(LOF)变异(NPR1:p.E967K和NPR1:p.L1034F)与较高的血压相关,而相反,先前报道和功能验证的功能获得性(GOF)变异(NPR1:p.G541S) 与较低的血压相关。这些观察结果,表明先前报道的两种 LOF 变体也与 HF 生物标志物(N 末端前 B 型利钠肽 (NT-proBNP)的较高水平相关,而 GOF 变体与该生物标志物的数值水平不显著相关(图 1A-D)。这些数据支持 NPR1 长期激动作用在 HF 患者中的有益作用。
3. NPR1 激活抗体的发现
具体人员进行了大规模的体外筛选,并使用 VelocImmune 技术确定了最佳的 NPR1 激活抗体 REGN5381(全人源化小鼠生成抗体)。REGN5381 在不存在配体的情况下与表达人 NPR1 (hNPR1) 和猴 NPR1 (mfNPR1) 的细胞结合,并且在 ANP 和 BNP 存在下结合增强(补充1a-c)。Biacore 数据证实,在存在或不存在 ANP 或 BNP 的情况下,REGN5381 与 hNPR1 和 mfNPR1 的胞外结构域蛋白结合,但不与小鼠 NPR1 蛋白结合。REGN5381结合是 NPR1 特异性的,与 NPR2 和 NPR3 没有结合。此外,REGN5381 不会与 ANP 相互作用或阻断 ANP 与 NPR1 的结合。
REGN5381 在存在或不存在利钠肽配体的情况下结合并激活 NPR1
在 Ca2+ 通量生物测定中证明了 REGN5381 对 NPR1 信号的激活,其中通过 NPR1 激动作用产生 cGMP 与环核苷酸门控钙通道 CNGA2的开放相结合。REGN5381 在不存在或存在 ANP 或 BNP 的情况下激动 hNPR1 和 mfNPR1,最大激活效率与配体所达到的水平相当(扩展数据图1e,f)。此外,REGN5381与犬 NPR1 结合并激活,EC50 为 >100 nM。为了确认细胞产生的 cGMP 直接测量中的活化水平,进行了HTRF的cGMP 测定。观察到 REGN5381 cGMP 的剂量依赖性积累,其最大激活水平低于单独使用 ANP 或 BNP 所达到的最大水平。HTRF 测定还显示,在 ANP 或 BNP 存在下激活增强。综上所述,这些结果表明,REGN5381可以在没有配体的情况下直接与 NPR1 结合并激活,在配体存在下可以增强结合激活,并且实现的最大激活与配体实现的最大激活相当或略低于,具体取决于激活测定方法。
REGN5381 激活人类 NPR1 介导的 cGMP 产生
4. NPR1激动抗体的作用机制
先前已证明NPR1形成二聚体,该二聚体在ANP结合后经历构象变化(图2a )。研究人员使用冷冻电子显微镜 (cryo-EM) 来检查在 ANP 存在和不存在的情况下与 REGN5381 结合的 NPR1 胞外域复合物,以确定是否发生类似的结构变化。与 ANP 结合的 NPR1 胞外域以及 REGN5381 的 Fab 的冷冻电镜结构表明,EGN5381 与 NPR1 N 端结构域的顶部结合,距离 ANP 超过 25 Å,位于 NPR1 的二聚体中心(图2b)。该复合物中结合了两个 REGN5381 Fab,每个 NPR1 单体结合一个抗体。
接下来,产生了没有 ANP 结合的 NPR1 与 REGN5381 复合物的冷冻电镜结构,(图2c)。该结构的 EM 密度要低得多,这可能是由于 NPR1 二聚体在没有 ANP 稳定的情况下具有更大的灵活性。
5. REGN5381 抗体在NPR1hu/hu小鼠模型中的降压作用
接下来需要确认 REGN5381 在动物研究中是否具有预期的降压作用。全人抗体 REGN5381 对 hNPR1(以及 mfNPR1 和犬)具有选择性,但不与小鼠 NPR1 蛋白结合,因此,对小鼠经过基因工程改造,表达 hNPR1 胞外结构域,并保留小鼠跨膜和胞内结构(NPR1 人源化小鼠,NPR1 hu/hu小鼠”)。接受单次皮下注射 1、5、25 或 50 mg/kg REGN5381 的遥测血压正常NPR1 hu/hu小鼠表现出收缩压降低 10-15 mm Hg,并在整个 28 天的研究期间保持不变(图3a)。效果的持续时间是剂量依赖性的,1 mg/kg 剂量组在 10 天后血压效果消失,约 3 周后 5 和 25 mg/kg 剂量组具有中度效果,单次 50 mg 剂量具有持续效果每公斤高剂量直至观察期结束。5 mg/kg 剂量组和 25 mg/kg 剂量组之间血压降低幅度没有明显差异,表明 5 mg/kg 是饱和剂量。与 REGN5381 介导的鸟苷酸环化酶受体 NPR1 激活导致收缩压大幅降低一致,观察到尿 cGMP 显着增加(图3b );尽管已发表的观察结果表明 NP 可以引起利尿,但 ANP 或 REGN5381 给药后的尿量给药后评估无法证明对尿量的影响(图3b)。
为了确认 REGN5381 与内源性 NP 配体一样发挥作用,并诱导所报道的优先静脉舒张效应,在离体血管环测定中评估了 REGN5381,以评估对动脉或静脉张力是否存在差异效应。在从NPR1 hu/hu小鼠中分离并用去氧肾上腺素预收缩的血管(主动脉、肠系膜动脉、肠系膜静脉、肺动脉、肺静脉)中评估 REGN5381 的血管功能影响。REGN5381 诱导动脉和静脉血管舒张(图3c),其效力优于对照剂乙酰胆碱,且REGN5381 对静脉血管的影响最大。与REGN5381的血管舒张作用一致,基因表达分析显示NPR1在静脉中的表达水平比在动脉中高得多(图3d )。
6. REGN5381 在犬类和猴中的作用
由于测量小鼠中心静脉压(CVP)存在困难,研究人员使用标准化犬模型来确认 REGN5381 会像天然 NP 一样降低 CVP。首先,与人源化小鼠一样,单次静脉注射 25 mg/kg 剂量的 REGN5381 可降低比格犬的收缩压并增加 cGMP 水平(图4a、b )。然后,急性血流动力学研究,显示 REGN5381 降低了 CVP 和肺动脉压,并导致植入中心静脉 Swan-Ganz 导管的麻醉、仰卧位小猎犬的代偿性心率升高(图4c、d)。
接下来,通过检查血压正常的雄性食蟹猴,扩展了上述观察结果,即 REGN5381 可以模仿灵长类动物的天然 NP 样血流动力学行为(图4e-g)。
7. REGN5381 在健康成人中的作用
上述在小鼠、犬科动物和猴子中的数据表明 REGN5381 的作用类似于 NP 的持久模拟物。为了将这些观察扩展到人类,总共 48 名健康成年人被随机接受单次静脉注射 REGN5381(0.3、1、3、10、30 或 100 mg)或安慰剂:每个活性剂量组有 6 名成人,12 名成人接受单次静脉注射。用安慰剂治疗。在整个 72 小时的观察期内,最高 REGN5381 剂量(100 mg)与收缩压降低 6-9 mm Hg 相关(图5a)。正如预期的那样,并且正如在临床前物种中所看到的那样,收缩压的降低与心率的适度增加相关(图5b)。也与之前的临床前物种 REGN5381 数据一致,并且正如健康成人中天然 NP 所见,REGN5381 还导致脉压变窄和每搏输出量减少(图5c,d )。这些血流动力学变化与尿液cGMP的持续增加有关(图5e )。值得注意的是,正如在临床前物种中所见,所有剂量组的尿量没有变化(图5f )。REGN5381 还在健康志愿者中诱导血浆 cGMP 产生。
单次静脉注射 REGN5381 的耐受性通常良好。此外,在整个研究期间,没有报告严重的治疗相关不良事件 (TEAE)、严重 TEAE 或死亡。接受 REGN5381 或安慰剂的参与者中,只有不到 10% 的人出现心律失常,并且不需要干预。直到研究结束访视为止,所有队列中均未观察到其他临床重要异常或生命体征或任何心电图 (ECG) 参数相对于基线的剂量依赖性变化。所有参与者在 72 小时时均符合住院出院标准。
8. 讨论与总结
本文描述了一种研究中的激动剂单克隆抗体 REGN5381,它靶向并激活 NPR1。证明了这种激动剂抗体反映了天然 NP 的血液动力学和药效学效应(在小鼠、犬科动物、猴子和人类中),有可能提供一种方便且长效的治疗方法,可以实现并延长持续 NP 输注对患有以下疾病的患者的益处:高频。到目前为止,输液方法在医院环境中的应用有限。
沙库巴曲/缬沙坦被批准用于心力衰竭患者,是脑啡肽酶抑制剂和血管紧张素受体阻滞剂的组合。沙库巴曲/缬沙坦的沙库巴曲成分可抑制脑啡肽酶介导的 ANP 或 BNP 降解,从而增加 NP 水平。然而,由于脑啡肽酶降解多种底物,包括缓激肽和血管紧张素 II,抑制脑啡肽酶会增加血管紧张素 II 水平,从而增加肾素-血管紧张素-醛固酮系统的激活并升高收缩压。服用脑啡肽酶抑制剂与血管性水肿发生率增加有关,这可能是由于缓激肽的积累所致。与血管紧张素受体阻滞剂同时给药可以消除肾素-血管紧张素-醛固酮系统相关的不良反应,同时还能降低收缩压。REGN5381 提供了一种激动 NPR1 的特定方法,可以实现更大的 NPR1 激活,从而更大程度地减少前负荷,同时消除与脑啡肽酶非特异性抑制相关的不良问题。此外,REGN5381 的作用持续时间长,提供了一种比脑啡肽酶抑制更持久的 NPR1 激动方法。
然而,这些发现与之前发表的重组 BNP 输注后对尿量没有影响的说法一致。此外,NPR1 激动后发生的多因素变化表明,也许多个下游信号通路参与了整体血流动力学的调节,并且这些通路依赖于当前的血流动力学环境。当前工作的一个限制是缺乏在存在体积膨胀或拥塞的情况下对 REGN5381 的评估。假设 NPR1 介导的利尿可能仅在液体负荷状态下发生,但尚未评估该状态的临床前模型。
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