蛋白激酶及其抑制剂特性

癌症在内的许多疾病中发现蛋白激酶活性的失调，该家族酶已成为21世纪最重要的药物靶点之一。FDA 批准了 80 种针对大约20多个不同蛋白激酶的治疗药物，其中 7 种药物于 2023 年获得批准。本文总结了蛋白激酶的作用机制和 FDA 已批准的蛋白激酶抑制剂的分类和空间特性。

1. 治疗性蛋白激酶抑制剂的概述

蛋白激酶是21世纪最重要的药物靶点之一。全世界四分之一到三分之一的药物开发都以这些酶为目标。2001年伊马替尼(imatinib)治疗费城染色体阳性 CML（慢性粒细胞性白血病）的临床疗效促使人们寻找口服有效的治疗性蛋白激酶阻滞剂。这药的成功源于伊马替尼对活性嵌合 BCR-Abl 蛋白酪氨酸激酶的抑制，而活性嵌合 BCR-Abl 蛋白酪氨酸激酶是产生这些白血病的致病原因。

公共数据库中数千个蛋白激酶X 射线晶体结构的库存加速了基于结构的药物开发。此外，商业企业解析的其他专有结构在药物开发过程中得到广泛使用。全球约有 180 种高效可口服的蛋白激酶抑制剂正在进行临床试验(www.icoa.fr/pkidb/)。FDA批准的药物有80种。尽管如此，这些蛋白激酶仅代表 518 个蛋白激酶超家族的一小部分。

在 FDA 批准的 80 种蛋白激酶抑制剂中，有 27 种用于治疗不止一种疾病。例如，imatinib 被批准用于治疗八种不同的疾病。该药抑制BCR-Abl 融合蛋白(驱动慢性粒细胞性白血病的发病机制）、Abl2、PDGFRα/β、Kit、DDR1 和DDR2。因此，imatinib是一种广谱抑制剂。

2. 蛋白激酶结构与机制

2.1. 蛋白激酶的一级、二级和三级结构

蛋白激酶具氨基N末端小叶和羧基C末端大叶（图 1A）。小叶由五条反平行 β 折叠 (β1–β5) 和以活性和非活性方向出现的 αC 螺旋组成（图 1C）。小叶含有富含甘氨酸的环 (GRL)，有时称为 P 环（ATP 磷酸盐结构域），它连接 N 末端叶的 β1 和 β2 链；该环由 GxGxΦG 组成，其中 Φ 表示疏水残基。富含 G 环之后的两个残基的缬氨酸残基与 ATP 的腺嘌呤碱基、以及许多小分子蛋白激酶拮抗剂进行疏水接触。蛋白激酶在小叶 β3 链内含有 AxK 序列，在 αC 螺旋中部附近含有保守的谷氨酸。盐桥连接活性蛋白激酶中带正电荷的 β3 链赖氨酸 (K) 和带负电荷的 αC-谷氨酸 (E)，这种结构对应于“αCin ”构象（图 1A和C）。 αCin 结构对于表现完整的酶活性是必要的，但还不够。此外，盐桥的缺失表明该酶没有催化活性，相应的结构对应于“αCout”构象（图1E）。注意图中的赖氨酸和谷氨酸结构相距太远，无法形成盐桥，但大多数 αCout 结构中赖氨酸和谷氨酸之间的距离约为此处所示的两倍。αCout 向 αCin 构象的转化是催化活性所必需的。

图 1.A, C, E： C端大叶主要是α螺旋（图1C），有八个保守螺旋（αD-αI、αEF1、αEF2，但二维渲染中并未显示所有螺旋。催化活性蛋白激酶的羧基末端叶还包含四个短 β 链 (β6-β9)（图 1A 仅显示 β7 和 β8 链）。β7 链的第二个残基是腺嘌呤结合袋的底部，该残基与所有已知的 ATP 竞争性蛋白激酶抑制剂发生疏水性相互作用。羧基末端叶包含催化环 (CL)，介导 γ-磷酰基从 ATP 转移到蛋白质底物。C 末端叶还将蛋白质底物定位到活性位点以实现催化作用。

Hanks 和 Hunter 描述了构成蛋白激酶功能的 12 个子结构域（I–VIa、VIb–XI）。K/E/D/D (Lys/Glu/Asp/Asp) 四联残基在所有蛋白激酶的酶活性中发挥重要作用。四联残基的 K 是 β3 链赖氨酸，它与 (i) αC-谷氨酸盐形成盐桥，形成 αCin 结构以及 (ii) α-磷酸盐和 (iii) β-磷酸盐ATP（未显示）。激酶激活片段内的残基将可磷酸化底物定位到活性位点。此外，催化环的 HRD-D（K/E/D/D 四联残基的第一个 D）充当 Lowry-Brönsted 碱基（质子受体）。

K/E/D/D 四联氨基酸残基的第二个 D 是蛋白质-底物结合激活片段的第一个残基。所有蛋白激酶的这一组成部分均以 DFG 开头，以 APE 或类似的三联残基（例如 PPE）结尾。激活片段长约 35-40 个残基，是所有蛋白激酶的重要调节和结构组成部分。HRD(x) 4 N 特征构成了功能性蛋白激酶的催化环。活化片段出现在催化环的羧基末端。大多数（但不是全部）蛋白激酶的活性需要两个 Mg2+ 离子 - Mg2+ (1) 和 Mg2+ (2)。Mg2+ (1) 与活化片段 DFG-D 结合，Mg2+ (2) 与末端催化环天冬酰胺结合（未显示）。

蛋白激酶超家族中激活片段中间部分的氨基酸序列和长度差异很大。几乎所有蛋白激酶的激活片段都含有一个或多个可磷酸化残基。此外，在几乎所有蛋白激酶中，激活片段磷酸化对于表达最大酶活性是必需的。蛋白激酶激活片段 DFG 在空间上出现在保守催化环 HRD 序列和 αC 螺旋附近。然而，调节性 αC 螺旋出现在小叶内，但在两个叶之间占据着重要的位置。蛋白激酶激活片段在所有蛋白激酶的功能形式中都具有开放且延伸的结构（图1A），而在大多数非活性激酶中具有封闭的结构（图1C/E）。前两个激活片段残基以不同的构象出现。活性蛋白激酶的 DFG-D 侧链向内指向 ATP 结合位点并结合 Mg2+ (1)。这种结构被称为“DFG-Din”构象（图1A/E）。许多无活性蛋白激酶中的 DFG-D 侧链远离 ATP 结合位点。这种结构被称为“DFG-Dout”构象（图1C）。

Modi 和 Dunbrack 根据激活片段的结构研究了配体和药物与蛋白激酶活性和非活性构象的相互作用，该结构以典型的 DFG 序列开始。如前所述，该三聚体有两种主要构象：DFG-Din和 DFG-Dout。第一种情况，苯丙氨酸残基与小叶的αC-螺旋相互作用；第二种情况，苯丙氨酸存在于生理ATP位点的一部分中，从而形成αC-螺旋袋。作者发现了一组依赖于苯丙氨酸侧链位置的蛋白激酶结构（DFG-Din 、DFG-Dout 和 DFG-Dintermediate )，包括对应于活性结构的 BLAminus 和两种常见的非活性形式 ABAminus 和 BLBplus。DFG-Dout 结构主要出现在 BBAminus 构象中。非活性结构具有阻止其与 Mg2+ 、ATP 和/或其蛋白质底物相互作用的特征。Modi 和 Dunbrack 建立了非商业网站 (http://dunbrack3.fccc.edu/kincore/)，可以让人们确定蛋白激酶构象是否对应于活性酶或非活性酶。使用这个网站来确定各种药物-酶复合物的结构是否对应于活性酶（DFG-Din，BLAminus）或非活性（其他）酶。

2.2.蛋白激酶疏水骨架和壳残基

C-脊定位 ATP，R-脊定位用于催化的蛋白质底物。R-脊包含来自 αC-螺旋和激活片段的成分，其结构对于确定活性和非活性酶状态很重要。两个脊的精确定位和对齐对于形成具有催化能力的蛋白激酶是必要的，但还不够。

R 脊包含 β4 链的第一个残基和保守的 αC 螺旋谷氨酸 C 端四个残基的氨基酸，这两个残基都位于小叶内。R-脊还包含激活片段的 DFG-Phe 和催化环的 HRD-His，两者都位于大叶内。HRD-His N-H 主链与疏水性 αF-螺旋内保守天冬氨酸的侧链形成氢键。活性蛋白激酶的 R 和 C 脊是线性的（图 1B）。在具有 DFG-Dout 结构的激酶中，DFG-D 残基 (RS2) 向左移位且 R 脊断裂（图 1D）。RS3 在具有 αCout 结构的蛋白激酶中向右移位（图 1F）

图 1. B,D,F 

基于定点诱变实验，Meharena 等在鼠蛋白激酶 A 中发现了三个增强和稳定调节脊的残基，他们将其标记为 Sh1、Sh2 和 Sh3，其中 Sh 指的是壳 [shell]。他们的 Sh1 突变体 (V104G) 具有野生型酶活性的 5%，而他们的 Sh2/Sh3 双突变体 (M120G/M118G) 缺乏所有催化活性。这些发现表明表面壳残基支持 PKA 活性。我们假设相应的壳残基对所有蛋白激酶都发挥相关的稳定功能。Sh1 残基出现在连接 αC 螺旋与 β4 链的片段内，即所谓的后环。Sh2 残基（看门人，gatekeeper）出现在靠近铰链段的 β5 链末端，Sh3 残基位于 β5 链内 Sh2 残基上游的两个残基处。

术语“看门人”是指该残基在控制进入与腺嘌呤结合袋相邻的疏水袋中发挥的功能，该残基始终与许多小分子蛋白激酶拮抗剂相互作用。大量数据表明，许多小分子治疗性稳态 ATP 竞争性蛋白激酶抑制剂与 R 脊 (RS2/3)、C 脊 (CS6/7/8) 和外壳 (Sh1 和 Sh2)残基 相互作用。据报道，约四分之三的蛋白激酶具有相对较大的看门残基（例如 Met、Leu、Phe），而约四分之一的蛋白激酶具有较小的看门残基（例如 Thr、Val）。靶向蛋白激酶的看门人残基对于长期药物有效性也很重要，它是更常见的耐药突变位点之一。

3. 蛋白激酶抑制剂复合物的分类和抑制剂结合袋的描述

根据早期报道，将小分子蛋白激酶抑制剂分为七个类，包括可逆型（I、I½、II、III、IV、和V型）和靶向共价不可逆抑制剂（VI）。将I½型和II型拮抗剂分为A和B亚型。A 亚型药物延伸穿过看门人残留物进入后方裂缝。相反，B 亚型药物不会延伸至后方裂缝。基于不完整的数据，这种差异的可能意义在于，与 B 亚型阻滞剂相比，A 亚型拮抗剂与其酶靶标的结合停留时间更长。例如，索拉非尼是IIA型VEGFR抑制剂，舒尼替尼是IIB型VEGFR拮抗剂，两者均已获得FDA批准用于治疗肾细胞癌。IIA 型阻滞剂的停留时间大于 64 分钟，而 IIB 型抑制剂的停留时间小于 2.9 分钟。

图 2 描述了结合口袋和亚结合口袋位置的简要信息。N 端和 C 端蛋白激酶叶(lobes)之间的拓扑结构分为前裂缝(cleft)或结合口袋(pocket)、门区(gate area)和后裂缝(back cleft)。背部结合口袋（back pocket，疏水袋 II 或 HPII）包括门区(gate area)和浇口区域和濒临的后裂口袋(back cleft)。前裂缝口包含铰链残基hinge residues、将铰链残基连接到大叶中的 αD 螺旋的接头残基linker residues、富含甘氨酸的环loop、腺嘌呤结合袋 (AP) 和催化环loop (HRD(x)4N）。

图 2. (A) DFG-D in 酶形式中蛋白激酶结构域药物结合袋的位置。 (B) DFG-D out 酶形式中药物结合袋的位置。 (C) 蛋白激酶前裂、门区和后裂的位置。AP，腺嘌呤袋；BP，后袋；FP，前袋；Hn，铰链；HPII，疏水口袋II；GK，守门员。

I 型抑制剂结合在前裂缝内。看门区域包括来自两个叶的残基。看门区域包含 β3 链的最后三个残基和后续 β3-αC 环的前两个残基。它还包括激活片段之前的残基（xDFG 的 x）以及激活片段的前五个残基。后裂缝包括αC-螺旋的中间残基、整个β4-链和整个β5-链。后裂缝还包含整个 αE 螺旋和催化环 HRD 之前的三个残基。在前裂缝和部分后裂缝中都发现了几种 I½ 型抑制剂。小分子蛋白激酶阻断剂设计的总体目标之一是最大限度地提高选择性并最大限度地减少脱靶副作用；通过比较药物与靶标和非靶标激酶的相互作用可以促进这种方法。产生与各个口袋边界的残基结合的配体片段在蛋白激酶拮抗剂开发中发挥着战略作用，其目的是最大化药物亲和力。

通过描述了配体和药物与超过 5200 种人类和小鼠蛋白激酶的结合。他们的 KLIFS（激酶-配体相互作用指纹和结构）集合包括两个叶中出现的 85 个配体结合位点残基的比对；这些总结有助于根据配体和药物的结合特性对其进行评估。这些数据有助于识别常见和独特的药物-酶相互作用。这些作者制定了一个标准的氨基酸残基编号系统，有助于比较不同的蛋白激酶及其配体。

图 3 描述了 KLIFS 残基在蛋白激酶结构域内的位置。此外，这些作者还制作了一个有价值的可搜索和非商业网站，该网站定期更新，提供有关蛋白激酶与药物和配体相互作用的全面信息（klifs.net）。

图 3. KLIFS 残基在通用蛋白激酶结构域内的位置。Act Seg，激活段。在前裂处发现灰色圆圈中的残留物；蓝色圆圈，看门区；黄色圆圈，背部裂缝。

此外，有公开正在进行临床试验或已获得各个监管机构批准的蛋白激酶拮抗剂的完整列表。这是一个可搜索的非商业网站，该网站定期更新，描述了各种药物的结构和物理特性、其蛋白激酶靶点、治疗适应症和商品名称，以及监管机构首次批准的年份（www.icoa.fr/pkidb/）。

同样，蓝岭医学研究所 (BRIMR) 维护着一个网站，其中列出了 FDA 批准的蛋白激酶拮抗剂并提供其 (i) 分子结构，(ii) 氢键供体/受体的数量，(iii)计算分配和分配系数的对数，(iv) 环和可旋转键的数量，(v) 最初批准的年份，(vi) 其主要蛋白激酶靶标，(vii) 及其治疗适应症。该网站还提供了相应 FDA 标签的链接: www.brimr.org/PKI/PKIs.htm。

参考文献:

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1043661824000033