多肽类药物的合成与修饰

对多肽药物的化学和生物合成和修饰可改善其药理特性。在这里，总结了多肽药物的修饰、合成和递送现状。

多肽的化学合成技术已十分成熟，特别是Merrifield于1963年开发的固相肽合成(SPPS，solid-phase peptide synthesis)技术。此后，SPPS 技术在现代肽生产中发挥着至关重要的作用。它通过在一个简单的反应器中结合氨基酸偶联和脱保护来促进肽合成，这导致了自动肽合成仪的发明。与重组技术相比，SPPS获得的粗肽较为单一，不含有酶、DNA和RNA片段、非相关肽等其他生物化合物。此外，最终SPPS产物中的杂质很容易识别，因为它们主要源自合成“过程中的不完全反应或副反应，使得随后的纯化相对简单。

SPPS 由将氨基酸的羧基偶联至固体聚合物树脂以及从保护基团中释放胺基的循环组成（图１）。各种树脂，例如 4-甲基二苯甲基胺 (HMBA) 树脂、Wang 树脂、2-氯三苯甲基氯 (CTC) 树脂和 Merrifield 树脂，用于将酰胺或游离羧基引入肽的 C 末端。现代肽工业通过将树脂与不同的连接体偶联，开发了各种功能性树脂，从而能够合成长肽并在固相中进行肽环化。在合成过程中，氨基酸的胺基和侧链通常受到不同化学基团的保护，这会导致肽聚集并降低粗肽的纯度。两种主要的 SPPS 策略：Fmoc-SPPS 和 Boc-SPPS 已开发用于去除主要的胺保护基团，分别为芴甲氧基羰基 (Fmoc) 和叔丁氧基羰基 (Boc)  。

图１.使用 Fmoc 保护的氨基酸 (Fmoc-AA-OH) 进行固相肽合成 (SPPS) 的一般流程。Fmoc-SPPS 包括将 Fmoc-AA-OH 与固体聚合物树脂偶联以及 Fmoc 脱保护以释放氨基的循环。

Boc-SPPS 使用三氟乙酸溶液去除胺保护基团，并使用氟化氢溶液裂解最终的肽，但这些过程会产生刺激性气味和毒性。Fmoc 可以在较温和的条件下去除，因此 Fmoc-SPPS 策略通常是首选。然而，Boc-SPPS 对于长肽合成具有优势，因为三氟乙酸脱保护有效地破坏了肽合成过程中的聚集。Fmoc-SPPS 研究目前集中于解决两个主要问题，包括长肽合成期间的聚集和某些序列的天冬酰亚胺的形成。

通过Fmoc-SPPS合成<50残基的肽是相对常规的，但较长肽（>50氨基酸）的化学合成仍然具有挑战性，特别是在大规模生产中。实验室规模的肽合成往往在现代自动化肽合成仪（例如 CEM Liberty PRIME 和 CSBio II）的帮助下自动进行。这些新型自动肽合成仪可以提供多达192个不同序列的顺序和多重并行肽合成，使用红外或微波加热来减少反应时间，有时使用紫外线监测来确保脱保护过程。大多数良GMP环境更喜欢温和的反应条件，以最大限度地减少副反应和相关杂质，因此长肽（> 50 个氨基酸）的大规模生产仍然具有挑战性。

作为一类特殊的治疗剂，肽的生物活性与其化学结构密切相关。肽合成后，需要使用药物化学技术对其进行修饰，以模拟、稳定或构建理想的二级结构，以提高其生物活性并实现肽药物的选择性、稳定性和溶解度 。

在修饰先导肽候选药物之前，有必要确定具有所需生物学特性的最小活性序列。经典的序列扫描，称为丙氨酸扫描，通常用于用丙氨酸替换每个残基，产生一系列先导肽类似物，以确定哪些关键残基赋予先导肽的生物活性：活性降低表明被取代的残基很重要，而活性的非显著降低表明被取代的残基是冗余的。然后对先导肽的可替换残基以及C端和N端进行进一步修饰以产生最终的肽药物。

2.1.　肽的骨架修饰

主链骨架修饰的主要原因之一是提高肽的蛋白水解稳定性。肽中的蛋白水解位点可以通过稳定性研究和代谢物测定来鉴定。主链修饰包括L-氨基酸被D-氨基酸取代、甲基氨基酸的插入以及β-氨基酸和类肽的掺入。将这些非天然氨基酸引入肽序列中，特别是在蛋白水解位点，是延长肽药物血浆半衰期的有效策略。一个成功的例子是selepressin，它源自天然加压素(vasopressin)，具有相似的靶点选择性，但血浆半衰期更长。

然而，一些修饰不能同时提高蛋白水解稳定性和活性。例如，D-氨基酸的插入通常有助于延长肽的血浆半衰期，但具有D-氨基酸修饰的肽很少表现出有效的生物活性。

2.2.　肽的侧链修饰

肽的侧链修饰是通过在肽合成过程中用其类似物替换天然氨基酸来实现的，以提高其结合亲和力和靶标选择性。天然氨基酸类似物的变体，例如高精氨酸、苯甲氧基酪氨酸和β-苯丙氨酸，可以在肽合成过程中方便地用于化学修饰肽侧链。一些 GLP-1 类似物药物如利拉鲁肽和索马鲁肽已修饰侧链。

2.3.　通过主链和侧链修饰模拟和稳定二级结构

肽中的弱作用力，例如氢键、范德华力和分子内疏水相互作用不足以形成稳定的二级结构构象。因此，需要对主链、N 端或 C 端或侧链进行额外修饰以模拟天然产物的结构或 PPI 中的热点并稳定二级结构，以产生有前途的候选多肽药物。

肽环化。环化是一种常见的肽修饰技术，可以包括各种策略，例如头到尾、主链到侧链和侧链到侧链环化（图２ ） 。肽环化可以增加蛋白水解稳定性和细胞渗透性，并且允许模拟和稳定肽二级结构。肽环化也常用于稳定其他二级结构，例如α-螺旋和β-折叠。

• α-螺旋的肽模拟和稳定性。螺旋是最常见的蛋白质二级结构类型之一，约占所有蛋白质结构的 30%-40% 。α-螺旋由分子内氢键形成并占螺旋结构的90％。模仿肽中的 α 螺旋可以鉴定 PPI 调节剂。α-螺旋可以通过侧链建立交联或用共价键取代氢键（称为氢键替代物，HBS）来稳定。在α-螺旋结构中，第i、i+4和i+7位点的氨基酸侧链位于同一侧，通过i和i+4或i和i+7建立交联有效地接近主链原子并有助于在螺旋结构中形成氢键（图２ ）。

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• β-链和β-折叠的肽模拟。β-折叠和β-链代表另一类基于转角模拟的蛋白质二级结构。对肽进行修饰以稳定β-折叠通常是通过引入D-氨基酸（例如D-Pro）以在序列中形成转角结构来实现的。D-Pro-L-Pro 模板是众所周知的支架，用于稳定几种成功的 PPI 抑制剂中的反向平行 β-发夹。大环化或β-折叠模拟物也已被应用于创建β-折叠和β-链结构。

化学合成是工业制备肽的首选方法，因为它可以引入除天然蛋白氨基酸之外的通用合成结构单元，例如非天然氨基酸以及生化或生物物理探针，从而允许进一步修饰或缀合。此外，化学合成过程可以完全自动化并易于扩大规模。它为生产短肽和中长肽提供了一种方便有效的方法，但长肽的化学合成仍然具有挑战性，因此需要替代策略。

除了化学合成之外，治疗性肽还可以通过各种生物学方法来制备，例如通过提取 、酶促合成、发酵、重组DNA技术和半合成从天然来源分离生物活性肽。

从天然来源分离肽药物的实践可以追溯到上世纪 20 年代，当时胰岛素首次从牲畜胰腺中分离出来并用于治疗糖尿病，挽救了数十万人的生命。胰岛素的开创性成功导致公众对肽疗法的热情日益高涨，其他几种动物源性肽药物随后成功进入临床应用，例如促肾上腺皮质激素和降钙素。非核糖体合成的肽代表了另一个重要的天然来源家族，用于鉴定和生产具有治疗潜力的肽，例如万古霉素和环孢菌素。与核糖体合成的肽或蛋白质不同，非核糖体合成的肽的合成是由编码非核糖体肽合成酶的基因簇而不是内源翻译机制控制的，从而导致结构和功能多样化的肽的产生，并允许这些分子克服了普通多肽药物的固有局限性。毒液和毒素被认为是有价值的天然来源，作为鉴定生物活性肽的起点，并且其他天然来源，例如环肽(cyclotides)和羊毛硫肽化合物(Lanthipeptide) 也已被研究和利用。酶法合成适用于二肽、三肽等短肽的合成，酶法合成的肽已成功应用于食品添加剂、药品、农用化学品的生产。发酵已被充分证明是一种生产生物活性肽的环保方法，例如在环孢菌素的生产中。重组 DNA 技术能够生产具有确定序列和同质性的肽和蛋白质。这种方法对于制造具有多个二硫键的长或复杂的肽特别有用，否则这些肽很难化学合成。人胰岛素和生长激素是使用重组 DNA 技术制造的许多可用肽药物的代表性例子。此外，重组DNA技术可以与遗传密码扩展和其他新技术相结合，通过掺入非天然氨基酸将所需的官能团引入分子中。半合成法提供了一种通过连接合成肽和重组DNA表达肽来生产大的生物活性多肽的灵活方法，并且当需要多种人工修饰时是特别有用的方法。

天然蛋白质是由 20 种经典氨基酸合成的，这种有限且保守的氨基酸库极大地限制了蛋白质结构和功能的多样性和复杂性。遗传密码扩展是二十年前开发的一种技术，旨在克服这一限制（图３ ） 。遗传密码扩展允许在蛋白质翻译过程中将具有新颖化学和物理特性的非经典氨基酸（ncAA）定点掺入生长的多肽中。要实现这一目标，需要四个组件：1) 具有所需化学和物理特性的 ncAA；2)指定ncAA的独特密码子，例如琥珀终止密码子(UAG)或四联体密码子；3) 正交 tRNA，抑制独特密码子并且不与其内源对应物串扰；4)正交氨酰tRNA合成酶，其可以将ncAA特异性地带至正交tRNA上并且不与内源氨酰tRNA合成酶/tRNA对串扰。

迄今为止，超过 200 种具有不同功能的 ncAA 已被基因编码到不同的生物体中，例如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞、病毒甚至动物，为蛋白质研究和工程提供了宝贵的工具箱。

由遗传密码扩展产生的短蛋白质和肽疗法也具有较短的半衰期，因为它们的药代动力学较差，包括快速血清降解和快速消除。连接聚合物是延长蛋白质疗法半衰期的一种方法。PEG由环氧乙烷重复单元形成，是一种不可生物降解、无毒、低免疫原性的聚合物。聚乙二醇化可以增加蛋白质的有效分子量，以减少其通过肾脏过滤的肾清除率。PEG 部分还可以通过增加空间位阻来保护蛋白质免受蛋白水解酶的消化，并通过增加目标蛋白质的水溶性来帮助增加吸收。这些优点使聚乙二醇化成为修饰治疗性蛋白质的普遍策略，自 20 世纪 70 年代以来，聚乙二醇化已被应用于优化蛋白质治疗，并取得了巨大成功。目前市场上有超过 10 种聚乙二醇化蛋白疗法，还有更多潜在候选药物正在进行临床试验。

常规的聚乙二醇化通常发生在Lys或Cys残基处。然而，如果靶蛋白包含多个反应性 Lys 或 Cys 残基，则由于缺乏选择性，偶联可能在这些残基中的任何一个上随机发生，导致生成难以分离的异质缀合产物。因此需要允许位点特异性聚乙二醇化的技术，其中PEG部分可以选择性和位置控制地附着到蛋白质上（图４）。

遗传密码扩展为蛋白质聚乙二醇化提供了有用的工具。一种方法涉及将在所需位置含有生物正交化学柄的ncAA（图５）基因编码到靶蛋白中，然后通过生物正交反应与PEG缀合。2004 年，报道了第一个 ncAA 介导的单聚乙二醇化方法，该方法基于酵母中对叠氮基苯丙氨酸 (pAzF) 的遗传掺入。通过铜 (I) 催化的炔叠氮环加成 (CuAAC) 与 pAzF 的点击反应，将炔衍生的 PEG 链位点特异性连接到超氧化物歧化酶 (SOD)，所得 SOD 显示出与野生型相似的酶活性蛋白质。

与单聚乙二醇化 hGH 相比，所得多聚乙二醇化 hGH 变体显示出降低的免疫原性和改善的药代动力学特性，且不损失生物活性，并且在啮齿动物模型中比单聚乙二醇化 hGH 具有更高的稳定性。这些例子说明了遗传密码扩展对于优化治疗性蛋白质和肽的有用性。

另一种位点特异性聚乙二醇化方法涉及通过遗传密码扩展将含 PEG 的 ncAA 直接引入靶蛋白中。通过使用无细胞翻译系统抑制四联体密码子，位点特异性地掺入含有 PEG4、PEG8 和 PEG12 链的 ncAA 。使用类似的策略，通过抑制琥珀终止密码子，将从 PEG4 到 PEG24 的较长 PEG 链引入多肽中。最近将eN-庚酰基-L-赖氨酸(HepoK)引入GLP-1中(图５ )，所得GLP-1(HepoK)表现出比野生型GLP-1更强的对人血清白蛋白(HSA)的结合亲和力以及降低血糖水平方面的更持久的效果，从而为研究蛋白质脂化提供了强大的工具。

6.　共价肽/蛋白质药物

与非共价药物相比，小分子共价药物具有许多优点，例如提高生化效率和效力、改善药代动力学、延长作用持续时间、减少剂量和给药频率以及有效抑制难成药靶点。对其低选择性和共价药物-蛋白质加合物的潜在免疫原性的安全性担忧意味着小分子共价药物的开发已被有意避免。然而，基于活性的蛋白质分析和其他最新技术的发展使小分子共价药物重新受到关注，并且几种通过共价结合机制起作用的小分子药物已被批准上市。

理论上，共价蛋白药物应该具有与小分子药物相似的优势。然而，由于它们固有地无法形成天然蛋白质的共价键，共价蛋白质药物的治疗潜力尚未得到充分开发。最近报道了一种用于开发共价蛋白药物的邻近反应疗法 (PERx) 策略。通过基因技术将潜在的生物活性 ncAA、氟硫酸盐-L-酪氨酸 (FSY) 整合到PD-1 的 129 位上，并表明所得的 PD-1(FSY) 选择性与其形成共价键。引人注目的是，与野生型 PD-1 相比，PD-1 (FSY) 显着增强了人类初始 T 细胞和工程嵌合抗原受体 T 细胞的生物活性。

脂质和较大的蛋白质经常偶联以改善共价肽药物的药代动力学。批准的肽药物，如利拉鲁肽、索马鲁肽和德谷胰岛素，与 C 14/16/18脂肪酸缀合，这增加了它们的血浆循环时间并减少了它们在肾脏消除过程中的降解。血清白蛋白和免疫球蛋白这两种血浆蛋白也可通过增加其分子量来延长肽循环时间，从而超过肾小球滤过的分子量截止值。例如，该策略用于延长度拉鲁肽和阿必鲁肽的半衰期，每周注射一次。

7.　肽药物递送的进展

肽修饰可以使肽获得更好的活性和血浆稳定性，并变得更像药物。然而，肽的固有特性意味着它们很容易被胃和肠中的消化酶水解，因此大多数肽药物都是通过注射给药的。最近的研究已经研究了肽药物递送途径以克服这些缺点。

与渗透促进剂共同配制是实现肽类药物口服给药的有前途的策略。与 C 18脂肪酸缀合的索马鲁肽被批准通过每周一次皮下注射给药，与其他 GLP-1 类似物相比，具有更高的血浆稳定性。更令人鼓舞的是，索马鲁肽与 N-[8-(2-羟基苯甲酰氨基]辛酸钠 (SNAC) 的复合制剂被批准用于口服治疗 T2DM。与 SNAC 的复合制剂可防止索马鲁肽在胃中的破坏疏水性 SNAC 分子还增加了索马鲁肽的亲脂性，从而改善了其通过胃膜的跨细胞吸收及其与其他渗透促进剂、酶抑制剂的转运至体循环。水凝胶还被用于口服其他肽药物，例如奥曲肽和胰岛素，目前正在进行临床试验。目前还有更多策略，包括肺部给药、透皮给药和使用植入泵。正在研究特定肽药物的输送，包括开发可吸入胰岛素和用于胰岛素输送的微型植入泵。预计这些技术将在未来几年应用于更多的肽药物。

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