Hey guys，非手术面部年轻化治疗目前是整形、重建和美容领域中最受欢迎的方向之一。含透明质酸的填充剂是用于此目的的主要产品。透明质酸是一种属于糖胺聚糖组的多糖，由d-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺组成。透明质酸为细胞外基质的主要成分之一，在组织生长、组织发育和伤口愈合中具有重要作用。透明质酸具有很高的保水性，这是所有愈合步骤的重要标准。透明质酸与纤维蛋白一起，在伤口愈合的所有步骤中都发挥着积极作用。
然而，随着透明质酸填充剂的使用增加，有更多关于与应用相关的某些并发症和副作用的报道。常见的副作用包括局部红斑、压痛和肿胀，所有这些都与注射程序有关。也有报道称，出现了过度膨胀和放置不正确等并发症。在这种情况下，透明质酸酶的应用也大大增加了。透明质酸酶的半衰期为2分钟，但由于其高潜力，作用持续时间为24至48小时。尽管透明质酸蛋白酶的应用使组织明显恢复到注射透明质酸前的状态，但尚不清楚组织学效应是否持续存在。
图：前两天刚刚分享过，玻尿酸酶直接注射也可以改善下睑水肿
本研究旨在比较透明质酸应用于大鼠皮肤后正常组织的变化、透明质酸注射后用透明质酸酶处理的组织的变化以及仅用透明质氨酸酶处理组织的变化。文献中已有关于透明质酸和透明质酸酶对皮肤影响的先前动物研究。这是文献中首次显示同时注射透明质酸与透明质酸酶类对皮肤的影响的动物研究。
材料和方法
KatipÇelebi大学伦理委员会批准进行这项研究，该研究是根据《赫尔辛基宣言》编写的。埃格大学校长动物实验地方伦理委员会也给予了批准。该研究于2021年2月和3月进行。
该计划是使用含有透明质酸的填充剂，评估透明质酸注射到皮肤后的组织学效果。Teosyal PureSense Deep Lines（Teoxane，瑞士）含透明质酸的填充剂用于此目的。该填充剂含有交联透明质酸，密度为25mg/mL，非动物来源，无菌透明，具有粘弹性凝胶稠度。它还含有0.3%的局部麻醉剂盐酸利多卡因。
本研究使用重组技术生产的人透明质酸酶来检测透明质酸酸酶注射液的组织学效应；使用的特定透明质酸酶是X.Prof.150还原酶（Mesoestetic，巴塞罗那，西班牙）。这包含1500单位的人透明质酸酶，通过重组技术生产，作为1小瓶中的即食粉末。在注射程序之前，确定了注射区域并进行了剂量计算。然后用5mL生理盐水稀释透明质酸酶。
该研究包括15只雄性和15只雌性Wistar Albino大鼠，体重在250至350克之间。在每只大鼠的背部确定了四个不同的区域，每个区域的尺寸为1×1厘米。注射在区域的中心和一个入口点进行。第1个区域是对照区域，没有注射。对于其他区域，将0.2mL含透明质酸的填充剂皮内注射到第2个区域，将0.2 mL含透明质酸性填充剂和30单位透明质酸酶皮内注射至第3个区域，并将30单位的透明质酸蛋白酶皮内注射于第四个区域（图1）。然后随机选择大鼠放入5组中的1组，每组包括3只雄性和3只雌性。在不同时间使用高剂量麻醉杀死所有组的大鼠，以观察注射效果的时间依赖性变化（表1）。处死后立即切除大鼠背部的四个不同区域，并在10%甲醛溶液中进行组织学检查。
图1：注射前大鼠背部示意图和注射部位
从所有区域采集组织样本，并用3种不同的染料染色。在用苏木精-伊红染色的样本中，对皮肤组织的真皮厚度进行了组织学检查。Alcian Blue染色用于检查组织中细胞外基质的结构。用Masson三色染色检查组织中的胶原结构，特别是在每个真皮中。计算组织学标本中检查的参数的百分比值，并确定组平均值。
所获得的数据经过了统计分析，并使用GraphPad Prism 6程序进行了评估。描述性统计包括单位数（n）、百分比（%）和平均值±标准差（±SD）。属于定量变量的数据的正态分布通过Shapiro-Wilk正态性检验和Q-Q图进行评估。Levene检验用于评估组方差的同质性。为了连续测量皮肤厚度、胶原蛋白密度和细胞外基质密度，根据时间（3小时、1、3、7和14天）对区域（对照组、注射0.2 mL透明质酸、注射0.2 mL透明质酸和30单位透明质酸，以及注射30单位玻尿酸酶）进行了比较。采用双向重复测量方差分析对重复测量进行比较。Tukey检验被用作多重比较检验。p<0.05的值被认为具有统计学意义。
表1：各组老鼠的处死时间以及按区域和时间划分的皮肤厚度、胶原密度和细胞外基质密度百分比的分布
结果
表1显示了从同一时间组受试者的同一治疗区域采集的样本中皮肤厚度、胶原蛋白密度和细胞外基质密度的平均百分比。图2显示了一些显示真皮厚度的组织学样本，图3显示了胶原蛋白密度的样本，图4显示了细胞外基质密度的样本。
图2：显示皮肤厚度百分比的样本
真皮厚度
与对照组的百分比相比，注射0.2 mL透明质酸的第2区域的皮肤厚度较低，在第3小时（60%对75%，p<0.05）和第14天（51%对59.1%，p<0.05）具有统计学意义。在第3天（86%对76.6%，p<0.05）和第7天（81%对69.1%，p<0.05）有统计学意义的增加。与对照组相比，施用30单位透明质酸酶的第四区域的皮肤厚度百分比在第3小时（65.83%对75%，p<0.05）、第1天（60%对69.17%，p<.05）、第3天（69.17%对76.67%，p>0.05）、第7天（55.83%对69.17%）和第14天（52.5%对59.17%，p<0.05）的下降具有统计学意义。与对照组百分比相比，施用0.2 mL透明质酸和30单位透明质酸酶的第3区域的皮肤厚度在第3天和第7天统计上有所下降（表2）。
表2：同一时间组不同区域皮肤厚度、胶原密度和细胞外基质密度百分比的比较
与第2区域相比，第3区域的真皮厚度百分比在第3小时统计上有所增加；然而，在第3天和第7天，出现了统计学上的显著下降。与第2区域相比，第四区域的皮肤厚度百分比在第1、第3和第7天统计上有所下降（表2）。
与第3个区域相比，第四个区域的皮肤厚度百分比在第1天统计上有所下降（表2）。
胶原蛋白密度
与对照组的百分比相比，第2区域的胶原蛋白密度在第3小时统计上有所下降（60%对75%，p<0.05），而在第3天和第7天统计上有所上升（85%对69.1%，p<0.05）。与对照组相比，第四区域的胶原密度百分比在第3小时和第1、第3、第7和第14天在统计学上有所下降（50%对59.1%，p<0.05）。与对照组的百分比相比，第3区域的胶原蛋白密度在第3、第7和第14天在统计学上有所下降（表2）。
与第2区域相比，虽然第3区域的胶原蛋白密度百分比在第3小时和第1天统计上有所增加，但在第3、第7和第14天统计上显著降低。与第2区域相比，第四区域的胶原蛋白密度百分比在第3天和第7天统计上有所下降（表2）。
此外，与第3个区域相比，第1天第四个区域的胶原蛋白密度百分比在统计学上显著降低（表2）。
图3：显示胶原蛋白密度的样本
细胞外基质密度
与对照组相比，第2区域细胞外基质密度的百分比在第3小时降低，但在第3天和第7天统计增加（81%对69.1%，p<0.05）。此外，与对照组的百分比相比，第四区域的细胞外基质密度在第3天和第7天在统计学上有所下降（55.83%对69.17%，p<0.05）。与对照组相比，在第3、第7和第14天，第3区域的细胞外基质密度百分比在统计学上有所下降（表2）。
然而，与第2区域相比，尽管第3区域细胞外基质密度的百分比在第3小时增加，但在第3、第7和第14天统计上有所下降。第2区域的比较表明，虽然第四区域的细胞外基质密度百分比在第3小时增加，但在第3天和第7天统计上有所下降（表2）。
与第3区域相比，第14天第四区域的细胞外基质密度百分比在统计学上显著增加（表2）。
图4：显示细胞外基质密度的样本
讨论
随着含透明质酸填充剂的使用增加，这些应用引起的并发症的报告频率也在增加。透明质酸酶是一种能迅速减少透明质酸物质影响的酶，通常用于这些手术。透明质酸酶注射液可拮抗组织中透明质酸填充剂的作用。然而，缺乏研究来检查注射透明质酸和透明质酸酶后发生的组织学变化会持续多久。
Kim和同事在一项对大鼠进行的研究中，在每个治疗区域施用0.2毫升透明质酸，以检查施用透明质酸酶的效果。本研究还将透明质酸酶应用后的取样时间设定为第1、第3、第7和第14天。
Huang和他的同事们对大鼠进行了一项研究，以确定通过透明质酸酶溶解透明质酸的最适量的透明质酸。本研究将0.5 mL透明质酸皮内注射到大鼠背部的某些区域。研究结束时还注意到皮内注射0.5 mL透明体酸的困难。研究发现，使用30单位的透明质酸酶显著减少了之前使用的透明质酸量。此外，Huang及其同事将处理区域的采样时间确定为第7天和第2天。
Fisher及其同事的一项研究表明，透明质酸真皮填充剂会引起真皮的体积效应拉伸，由于这种拉伸，胶原蛋白合成增加，基质金属蛋白酶合成减少。
Shumate及其同事对大鼠进行的另一项研究旨在确定溶解透明质酸的最合适的透明质酸酶剂量。这项研究包括3种不同的含透明质酸的填充产品，并报告了完全溶解所有填充产品的透明质酸酶剂量为30单位。
Hirsch及其同事的一份病例报告还报告了在皮肤坏死出现之前，使用30单位的透明质酸酶成功治疗了在鼻唇沟区域应用含透明质酸的填充剂后出现的缺血性症状。
此外，在仅注射透明质酸酶的区域，真皮厚度、胶原蛋白密度和细胞外基质密度的降低表明，透明质酸酸酶不仅减少了填充剂中的透明质酸，还减少了大鼠正常组织中存在的透明质质酸。这种效应应在未来的临床研究中得到证实，并应调查这种效应在临床实践中的重要性。
皮肤厚度变化
根据皮肤厚度进行检查后，这项研究表明，第3小时厚度的减少可能是由于早期透明质酸对周围组织的压力造成的。然而，第14天皮肤厚度减少的原因需要通过进一步的研究来澄清。第3天和第7天的增加被认为是由于真皮中透明质酸胶原蛋白和细胞外基质蛋白的合成增加。
与对照组相比，透明质酸酶的应用显著降低了所有时间组的真皮厚度。这可能是由于透明质酸酶分解真皮细胞外基质中的透明质酸造成的。在他们的细胞培养研究中，Cavallini和同事研究了使用透明质酸酶治疗透明质酸应用后并发症的安全性，并指出透明质酸酶类可能通过消化细胞外基质导致组织变薄。这项研究也有类似的发现，表明透明质酸蛋白酶通过将真皮中细胞外基质的密度降低高达55%来减少真皮的厚度。
与对照组相比，应用30单位的透明质酸酶和0.2毫升透明质酸在第3天和第7天减少了真皮厚度。同样，所应用的透明质酸酶是导致这种减少的原因，这可能是由于透明质酸在真皮细胞外基质中的破坏以及透明质酸的应用造成的。
胶原蛋白密度的变化
基于胶原蛋白密度的检查表明，与皮肤厚度的发现一样，3小时后胶原蛋白密度降低的原因可能是透明质酸施加到周围组织的压力。第3天和第7天的增加可能是由于透明质酸引起的真皮中胶原蛋白合成的增加。
与对照组相比，透明质酸酶的应用显著降低了所有时间组的胶原蛋白密度。原因可能是透明质酸酶破坏了真皮细胞外基质中的结构蛋白。
细胞外基质密度的变化
根据细胞外基质密度进行检查后，本研究表明，与皮肤厚度和胶原蛋白密度的发现一样，3小时后胶原蛋白密度的降低可能是由于透明质酸施加到周围组织的压力造成的。关于第3天和第7天的增加，透明质酸可能会刺激真皮细胞外基质中结构蛋白的合成。
与对照组相比，透明质酸酶在第3天和第7天显著降低了细胞外基质密度。这种减少可能是因为透明质酸酶分解了真皮细胞外基质中的结构蛋白。
本研究中获得的组织学发现基于截至第14天的评估。缺乏进一步的评估是这项研究的局限性之一。需要更长随访期的进一步研究来改进所获得的信息。组织学标本储存期间使用甲醛以及载玻片制备和加工技术是本研究的进一步局限性。最好使用冷冻切片技术，以避免影响结果。在这项研究中，使用光学显微镜进行评估，在未来的研究中可以考虑通过电子显微镜检查样品来获得更详细的信息。此外，尽管透明质酸酶的半衰期很短，但作者认为，在第3和第24小时取样还为时过早，无法显示酶的作用，因为这些作用持续24至48小时。
结论
对所得结果的检查表明，应用透明质酸会增加真皮厚度、胶原蛋白密度和细胞外基质密度，并且这些组织学效应的持续时间至少延长了7至14天。此外，透明质酸酶的应用从第1刻起就降低了真皮厚度、胶原蛋白密度和细胞外基质密度，这些组织学效应的持续时间至少延长了14天。同时应用透明质酸和透明质酸酶后，皮肤厚度、胶原蛋白密度和细胞外基质密度直接降低。
透明质酸酶是填充剂并发症的首选治疗方法之一，但它有许多副作用。需要进行人体研究来评估这项研究的结果，并探索透明质酸酶注射可能产生的副作用。
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参考文献
1. Köken S, Akşam E, Marşil R, Şimşek F, Başol TB. The Histological Effects of Hyaluronic Acid and Hyaluronidase Injections on Skin: An Experimental Study. Dermatol Surg. 2024 Dec 3. doi: 10.1097/DSS.0000000000004512. Epub ahead of print. PMID: 39625178.
