不同粒径PLLA微球在体内诱导胶原蛋白的再生对比

皮肤老化是一个不可避免的生理过程，它会导致皮肤的外观和结构发生根本性变化。真皮填充剂专门用于修复软组织体积的流失和深层静态皱纹或褶皱，与传统的仅具有替代或填充功能的真皮填充剂相比，新一代真皮填充剂(如Sculptra)，其主要成分是聚左旋乳酸)(PLLA)微球，具有生物刺激效应，能在注射后刺激内源性胶原和真皮成纤维细胞的再生。

PLLA微球对深层皱纹或褶皱如鱼尾纹、鼻唇沟和木偶线的效果显著，并且可以维持18至25个月，在前臂区域甚至可以超过28个月。一瓶标准制剂的Sculptra含有150mgPLLA微球冻干粉、90mg羧甲基纤维素钠（CMC）和127.5mg甘露醇。CMC被用作增稠剂，以增加系统的粘度，防止微球快速沉积，这将影响注射或导致体内分布不均。甘露醇是一种冻干保护剂，具有抗氧化活性，能够清除体内的自由基，抑制填充材料的快速降解，并减少注射后水肿的风险。

可生物降解的聚合物微球被认为能够积极刺激胶原再生。注射后，微球首先被巨噬细胞和巨大细胞等淋巴细胞覆盖，引起数月的轻微炎症反应。然后，微球逐渐降解成二氧化碳和水，同时形成新的胶原和其他结缔组织胶原。Lemperle等人评估了通过皮下注射Sculptra进入人体前臂掌侧皮肤引起的异物反应。结果显示，注射后2周可以在软组织中观察到PLLA微球；3个月后，PLLA微球保持球形，周围被巨噬细胞和一些淋巴细胞包围；6个月后，微球表面出现多孔结构或不规则形状，周围有巨噬细胞和巨大细胞；9个月后PLLA微球“消失”。

此外，其他研究者关注PLLA微球刺激的胶原类型。I型胶原主要存在于成人皮肤、肌腱和骨骼中，是一种相对较硬的胶原。III型胶原主要存在于婴儿皮肤或血管内膜和肠道中，是一种弹性胶原。随着年龄的增长，I型胶原增加，而III型胶原减少。最终，III型胶原的合成速率无法跟上其流失速率，导致皱纹和松弛，因此刺激III型胶原的再生可以有效缓解皮肤老化。Goldberg等人评估了Sculptra注射后3和6个月的组织反应，发现I型和III型胶原被观察到并显著增加；12个月后显示正常胶原增加。

基于PLLA基医疗和美容产品的现状，本研究开发了具有不同分子量、化学结构和聚合物架构的可生物降解聚合物，制备了大小为5-100μm的聚合物微球，并将其注入兔子背部进行了为期13个月的体内降解、炎症反应和胶原再生的观察，以评估它们的生物相容性、生物可降解性和作为真皮填充物材料的潜力。

PLLA是通过使用DL-乳酸(同时具备左旋L和右旋D的外消旋体)作为引发剂和Sn(Oct)2(辛酸亚锡)作为催化剂，对L-乳酸(左旋乳酸)进行环开环聚合反应合成的。PLLA的分子量可以通过改变单体/引发剂的摩尔比来调整。

PLLGA 75/25和PLLGA 85/15的合成过程与PLLA的合成过程相似，不同之处在于引入了乙交酯（GA）到系统中，并且L-乳酸（L-LA）与GA的摩尔比分别为75/25和85/15。

PLLA-PEG-PLLA的合成过程与PLLA的合成过程相似，不同之处在于使用了PEG(聚乙二醇)作为大分子引发剂。

(表)用于合成不同分子量PLLA的引发剂和单体的详细数据

根据Sculptra配方，将微球（200mg）分散到含有122mgCMC和165.8mg甘露醇的一定体积的水溶液中，通过加入生理盐水最终制成30mg/mL微球浓度的产品，经24小时使CMC充分水合后备用。

每个雌性兔子(重约2kg)背部的不同位置永久标记了5个1.5cm²的网格，选定5种不同类型皮肤填充剂分别皮下注射到不同的标记网格中（每个网格0.2mL填充剂），并且每个时间点设置3个兔子作为3个重复样本（每种皮肤填充剂在每个时间点都注射在3个兔子的背部）。在另一只兔子的背部皮下注射了0.2mL的生理盐水作为对照。

注射后，定期观察兔子的生长状况，并检查背部皮肤是否出现红斑或水肿。在注射后0.5、1.5、2.5、4、6、9和13个月，获取注射区域周围的组织样本进行组织学检查。样本立即固定，进行苏木精-伊红（H&E）、Masson染色以及CD68、I型和III型胶原的免疫荧光染色。

此外，记录了不同时间点微球的(Duranti)炎症反应等级分类。

0级：无炎症反应；

I级：轻微反应，有少量炎症细胞；

II级：明显的炎症反应，伴有一个或两个巨细胞；

III级：纤维组织中有炎症细胞、淋巴细胞和巨细胞；

IV级：有被包裹植入物的肉芽肿和明显的异物反应。

PLLA、PLLGA75/25、PLLGA85/15和PLLA-PEG-PLLA的1H NMR谱图显示在补充图S1中。这些聚合物的分子量通过GPC测量，并通过Ubbelohde粘度计测量的内在粘度[η]来计算Mv，使用的是Purac有限公司提供的Mark-Houwink经验公式（PLLA：[η] = 4.7 × 10-4 Mv0.67；PLLGA：[η] = 3.3 × 10-4 Mv0.69），这些数据列在表1中。

由于聚合物微球的大小是保证使用安全最重要的指标之一，经过多次实验后，准备了每种合适大小范围的微球。如表1所示，除了PLLA-6.89之外的所有微球大小都在20到100μm范围内，并都显示出球形和光滑表面，PLLA-6.89微球有不规则的片状或平板状颗粒、表面粗糙，其大小分布比其他微球更宽，这归因于PLLA在制备过程中超高分子量引起的油相粘度高。

(图1)不同聚合物微球的扫描电镜图像和扫描电镜尺寸分布，比例尺为100 μm。

在体内注射后，聚合物微球会因为酯键的水解和/或酶解而逐渐降解和被吸收。为了模拟这些聚合物微球的体内降解行为，研究了在PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)（pH 7.4）中37°C下微球的降解。图3A显示了不同聚合物的分子量（Mp）变化，图3B描述了分子量百分比变化，以排除分子量对降解的影响。降解速率顺序为PLLA-0.62 > PLLA-PEG-PLLA > PLLGA75/25 > PLLA-1.18 > PLLGA85/15 > PLLA-1.39 > PLLA-3.80 > PLLA-6.89。除了对水的敏感性，聚酯在体内可以被酯酶降解。一些研究者还研究了PLLA和PLLGA在酯酶作用下的体外降解行为。结果表明，酯酶组的重量损失速率大约是PBS组的7倍。

(图3)聚合物在37℃下的PBS缓冲溶液（pH 7.4）中随时间变化的分子量(A)和分子量百分比(B)。

为了进一步研究这些聚合物微球的体外降解行为，通过SEM(扫描电子显微镜，图4)观察了这些微球的大小和形态变化。根据微球在不同时间点的形态变化，可以确定降解速率的顺序如下：PLLA-0.62 > PLLA-PEG-PLLA > PLLGA75/25 > PLLA-1.18 > PLLGA85/15 > PLLA-1.39, PLLA-3.80和PLLA-6.89，这与分子量变化的结果一致。

(图4)PBS缓冲溶液（pH 7.4）中聚合物微球在不同时间点的形貌变化。白色的箭头指向微球表面的一个深洞。比例尺为50μm。

研究选择了5种皮肤填充剂（PLLA-PEG-PLLA、PLLA-1.39、PLLGA85/15、PLLA-3.80和PLLA-6.89）进行动物实验，为了评估皮肤填充剂的生物可降解性和炎症反应，将不同时间点（0.5、1.5、2.5、4、6、9和13个月）对应兔子的皮肤组织固定，并用H&E染色进行组织学检查。同时，为了探索促进胶原再生的能力，进行了Masson三色、CD68、Col. I和Col. III免疫荧光染色，以分别可视化胶原、巨噬细胞、I型和III型胶原。

(图)来自对照组（生理盐水组）兔子的真皮（A）、皮下（B）和肌肉（C）组织的H&E(苏木精-伊红)染色图像。比例尺为50μm。

图5显示了注射后0.5个月背部组织的染色图像。在H&E染色图像中，PLLA-1.39、PLLGA85/15和PLLA-3.80保持了球形形态；一些PLLA-PEG-PLLA微球呈椭圆形或新月形，被最多浸润的细胞包围，暗示了相对较快的降解。CD68的免疫荧光染色进一步证实了巨噬细胞包围了微球，由于快速释放酸性降解产物导致周围pH值变化较大，因此PLLA-PEG-PLLA和PLLGA85/15组的CD68荧光信号最强，从而导致最强的炎症反应。

(图5)注射后0.5个月，皮肤或皮下组织的H&E (A)和免疫荧光染色(B)图像。比例尺为50 μm。*表示微球（空孔），黑色箭头指向浸润的免疫细胞。

图6显示了注射后1.5个月组织切片的染色图像。H&E染色图像显示，只有PLLA-PEG-PLLA微球被吸收。在其他组中观察到被免疫细胞浸润的微球。PLLGA85/15微球周围的细胞核被苏木精染成蓝色，数量最多，表明细胞密度最高。一些PLLGA85/15微球变成了不规则条纹，表明降解程度更深。同样，CD68和DAPI的荧光信号也围绕在微球周围，PLLGA85/15组的荧光强度很强。

(图6)注射后1.5个月，皮肤或皮下组织的H&E (A)和免疫荧光染色(B)图像。比例尺为50 μm。*表示微球（空孔），黑色箭头指向浸润的免疫细胞。

图7显示了注射后2.5个月背部组织的染色图像。与之前时间点的结果相比，PLLA-PEG-PLLA组的纤维囊明显变大，纤维囊的数量显著增加。在PLLGA85/15、PLLA-3.80和PLLA-6.89组的胶原纤维和脂肪小叶中发现了少量成纤维细胞，这可能是由于每个样本中微球的小颗粒尺寸降解以及成纤维细胞的包含所引起的，这一在注射后大约3个月的观察结果与文献中报告的相符。在Masson三色染色图像中，可以看到单个微球（黄色箭头所示）“嵌入”在胶原纤维中。

(图7)注射后2.5个月，皮下组织的H&E和Masson三色染色图像。比例尺为50μm。

图8展示了注射后4个月皮下组织的染色图像。H&E染色结果显示，仅在皮下组织中观察到PLLA-3.80和PLLA-6.89微球，一些微球表面观察到孔洞。CD68免疫荧光染色图像（图S4）显示，巨噬细胞和巨大细胞仍然渗透在这两种微球周围。在PLLA-PEG-PLLA、PLLA-1.39和PLLGA85/15组中，观察到多个纤维囊的存在。

此外，在Masson三色染色图像中，PLLA-PEG-PLLA样本的纤维囊被更厚的胶原纤维所包围，PLLA-3.80和PLLA-6.89微球周围的蓝色部分颜色更深，表明有新的胶原纤维形成。在免疫荧光双重染色图像中，I型胶原主要包含在PLLA-PEG-PLLA、PLLA-1.39和PLLGA85/15样本的纤维囊中，而III型胶原主要包含在外层。PLLA-3.80和PLLA-6.89微球被I型胶原所包围。

(图S4)注射PLLA-3.80和PLLA-6.89样本后4个月的皮下组织H&E染色和CD68免疫荧光染色图像。比例尺为50μm。星号(*)代表微球体(空白孔)，黑色箭头指向浸润的免疫细胞。

(图8)注射后4个月，皮下组织的H&E (A)、Masson三色(B)及免疫荧光染色图像。比例尺为50μm。*表示微球（空孔），黑色箭头指向浸润的免疫细胞。

在图9中，展示了注射后6个月皮下组织的染色图像。在PLLA-PEG-PLLA、PLLA-1.39和PLLGA85/15组中观察到多个纤维囊和血管结构。在Masson三色染色图像中，这些纤维囊周围有新胶原形成。H&E和Masson三色染色结果显示，PLLA-3.80微球的炎症反应更强，微球周围有更多的巨噬细胞、巨大细胞和新胶原。CD68的免疫荧光染色（图S5）显示PLLA-3.80微球周围增强的红色信号，以及DAPI标记的细胞核聚集形成的几个亮蓝色团。

此外，在H&E和Masson染色图像中，一些PLLA-3.80微球的降解加剧，表面显示出半圆形或大孔。PLLA-6.89微球保持球形，并被巨噬细胞和新胶原包围，但PLLA-6.89微球引起的炎症反应比PLLA-3.80弱。在胶原的免疫荧光双重染色图像中，I型胶原主要位于PLLA-PEG-PLLA、PLLA-1.39和PLLGA85/15组的纤维囊内部，而大部分III型胶原位于囊外。与注射后4个月的结果类似，PLLA-3.80和PLLA-6.89微球被I型胶原包围，它们附近的III型胶原增加。

(图S5)注射PLLA-3.80和PLLA-6.89样本后6个月的皮下组织H&E染色和CD68免疫荧光染色图像。比例尺为50μm。星号(*)代表微球体(空白孔)，黑色箭头指向浸润的免疫细胞。

(图9)注射后6个月，皮下组织的H&E (A)、Masson三色(B)及免疫荧光染色图像。比例尺为50 μm。*表示微球（空孔），黑色箭头指向浸润的免疫细胞。

图10显示了皮下注射后9个月的染色结果。仅在皮下组织中观察到PLLA-6.89微球，CD68免疫荧光染色（图S6）显示微球周围被少量巨噬细胞和巨大细胞包围。PLLA-3.80微球在注射后9个月“消失”的结果与文献中的一致。免疫荧光染色图像显示它们被I型胶原包围。其他四组的H&E染色图像显示有多个纤维囊、周围新胶原以及附近的血管结构。与之前的时间点相比，PLLA-PEG-PLLA和PLLA-1.39组纤维囊周围的I型胶原增加。在PLLGA85/15和PLLA-3.80组中，纤维囊内部的I型胶原增加，而III型胶原主要在外部占主导地位。

(图S6)注射PLLA-3.80和PLLA-6.89样本后9个月的皮下组织H&E染色和CD68免疫荧光染色图像。比例尺为50μm。星号(*)代表微球体(空白孔)，黑色箭头指向浸润的免疫细胞。

(图10)注射后9个月，皮下组织的H&E (A)、Masson三色(B)及免疫荧光染色图像。比例尺为50μm。*表示微球（空孔），黑色箭头指向浸润的免疫细胞。

图11显示了注射后13个月的染色结果。所有组中均未观察到微球，表明所有聚合物微球在13个月内都能被降解。免疫荧光染色图像显示，与之前的时间点相比，除了PLLA-6.89组之外的所有样本中，纤维囊内外的III型胶原含量都有所增加。然而，PLLA-6.89组中I型和III型胶原的荧光强度低于其他组。PLLA-6.89组诱导胶原再生能力较弱是由于其较慢的降解速率所致。

(图11)注射后13个月，皮下组织的H&E (A)、Masson三色(B)和免疫荧光双染色图像。比例尺为50μm。

根据每个样本在每个时间点的H&E染色图像，使用Duranti等人建立的异物反应分类标准来评估异物反应；结果如图12A所示。PLLA-PEG-PLLA和PLLGA85/15皮肤填充剂显示出最快诱导异物反应的速度，分别在注射后0.5个月和1.5个月达到III级。PLLA-3.80皮肤填充剂诱导的炎症反应相对较弱。PLLA-3.80的平均等级在0-2.5个月时高于PLLA-1.39。然而，由于降解速度较慢，PLLA-3.80组的皮肤填充剂在注射后9个月“消失”，而PLLA-1.39皮肤填充剂早在注射后4个月就“消失”了。PLLA-6.89皮肤填充剂的等级最晚在注射后9个月达到III级。

进一步通过ImageJ对胶原蛋白免疫荧光染色图像进行半定量分析，结果如图12B和C所示。PLLA-3.80和PLLGA85/15引发了更多I型和III型胶原蛋白的生成。PLLA-3.80在第9个月观察到I型胶原蛋白的最大生成量，而PLLGA85/15在整个观察期间（4-13个月）都能维持高水平的胶原蛋白I诱导。PLLA-PEG-PLLA和PLLA-1.39组显示出较少的I型胶原蛋白生成。尽管PLLA-6.89组具有更高的聚合物分子量，但其胶原蛋白再生较少，且从注射后6个月到13个月的水平显著下降。

综合这些结果表明，具有快速降解特性的皮肤填充剂，如PLLA-PEG-PLLA和PLLA85/15，能够维持相对较长时间的再生胶原蛋白，但会引发急性炎症反应；尽管PLLA-6.89的降解较慢，其诱导的炎症反应弱且晚，但并未达到预期的新生胶原蛋白效果。因此，只有具有适度降解特性的皮肤填充剂，如PLLA-3.80，才能平衡胶原蛋白生成和炎症反应。

(图12)5种皮肤填充物在每个时间点诱导的I型(B)型胶原、III型(C)型胶原再生的异物反应平均分级(A)和半定量分析。

本颜究制备了8种具有不同的分子量、化学结构和构型的微球，尺寸范围在20-100μm之间。动物实验显示新生成的胶原蛋白，尤其是I型胶原蛋白主要存在于微球周围和纤维囊内，而III型胶原蛋白主要分布在纤维囊外。

微球的降解速率与微球引起的异物反应有很强的相关性：微球的降解速率越快，它们越早引起明显的炎症反应，纤维囊形成得越快，因此维持软组织体积的效果就越弱。降解速率最慢的PLLA-6.89微球引起的异物反应和刺激胶原蛋白再生也相对较弱。但是，具有适度降解速率的PLLA-3.80微球(在注射后9个月消失)显示出较晚的异物反应和明显的胶原蛋白再生，其缓慢的降解速率也使得软组织体积增加，从而维持了长期的医疗美容效果。

全文参考文献：

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