周宏伟教授：Nature Medicine一文揭示肝性脑病的“幕后黑手”

肝性脑病是晚期肝病患者中一种常见的严重并发症，其症状多样且复杂，通常表现为记忆力减退、思维混乱，甚至可能出现意识丧失，严重时可危及患者生命。据相关统计数据显示，我国有超过1亿人患有各种类型的肝病，其中许多患者最终会发展为肝硬化。进一步的研究发现，大约50%至70%的肝硬化患者会进一步发展为肝性脑病。

肝性脑病的发病机制极为复杂，长期以来，人们普遍认为肠道细菌产生的氨是其主要致病因素。氨作为一种有毒代谢产物，能够通过血脑屏障进入大脑，干扰神经系统的正常功能。然而，近年来的临床研究发现，氨并不能完全解释肝性脑病的发生，这意味着可能还存在其他尚未被发现的致病因素。这也促使科学家们不断深入探索，以期揭示肝性脑病更为全面的发病机制，从而为临床治疗提供更为精准的指导和更有效的治疗方案。

近日，南方医科大学深圳医院周宏伟教授、广州医科大学附属第二医院高杰教授、东南大学附属中大医院祁小龙教授和南方医院肝病中心陈金军教授团队的一项研究首次揭示肠道细菌中一种名为活泼瘤胃球菌（R.gnavus）产生的物质——苯乙胺（PEA），在肝性脑病发生中的关键作用，为我们理解肝性脑病的成因提供了全新视角。该研究发表在国际顶级医学期刊Nature Medicine（IF:58.7）。

该研究探讨了肝硬化患者肠道菌群代谢产物对大脑生理和病理生理的影响，通过构建肠道-大脑模块（GBM），以系统研究菌群与大脑的相互作用。研究人员通过文献和数据库将GBM从56个扩展到112个，并分析了1520个肠道参考细菌基因组，发现乙酸代谢模块普遍存在，而与肌醇、γ-氨基丁酸（GABA）、单胺、己糖醇和组胺代谢相关的模块则较为罕见。

研究人员假设肝硬化患者肠道菌群中神经毒素的富集是肝性脑病发生的重要风险因素和前提条件，因此将预测的GBM应用于评估四个肝硬化宏基因组数据集的肠道菌群的神经毒性潜力。四个独立队列的单变量统计分析显示，与对照组相比，肝病患者中预测的单胺合成和肌醇合成模块显著增加。进一步通过随机效应meta分析汇总不同数据集的差异预测GBM丰度，发现在超过10%的样本中检测到的70个预测模块，有13个在肝硬化中富集。这些模块包括GABA合成和降解、单胺合成以及乙酸和丙氨酸合成，其中单胺合成最为显著。

▲肝硬化患者肠道菌群代谢

单胺是一类具有神经毒性的化合物，其合成的关键步骤是芳香族L-氨基酸脱羧酶（AADC）催化的脱羧反应。研究人员通过生物信息学搜索发现AADC主要存在于R. gnavus中，推测人类肠道中可能存在未被鉴定的细菌AADC序列。为了系统筛选肠道菌群中的AADC，研究者利用IGC数据库，搜索含有AADC核心功能域的蛋白，发现了329个序列。通过序列相似性网络等方法，最终筛选出20个能将芳香族氨基酸转化为单胺的酶，其中18个为苯丙氨酸和色氨酸脱羧酶（PDC）。

基于新鉴定的AADC序列，研究者重新评估了人类肠道参考基因组中的AADC基因，发现PDC基因在32个共生基因组中被鉴定出来，包括新鉴定的Tyzzerella nexilis等。在宏基因组数据集中分析发现，与对照组相比，肝硬化患者中PDC基因一致扩增。此外，研究者还发现编码PDC的R. gnavus和T. nexilis在肝硬化样本中的丰度显著升高，尤其是R. gnavus与PDC基因丰度的相关性最强。这些结果证实了肝硬化患者单胺合成增加的现象，并进一步确定了R. gnavus中的PDC是这一过程中关键的酶。

▲肝硬化患者中R. gnavus来源的PDC基因丰度增加

研究者将R. gnavus引入无菌小鼠肠道，用R. gnavus来源的PDC编码基因插入突变体（Rg-Mu）作为对照，以确认PDC在R. gnavus诱导的单胺合成和神经毒性中的关键作用。

结果显示，与Rg-Mu小鼠相比，野生型R. gnavus（Rg-WT）单菌定植的小鼠粪便中单胺显著增加，表明R. gnavus通过其PDC活性直接诱导单胺合成。研究者进一步收集了门静脉、下腔静脉和大脑的血清标本，分析从肠道到大脑的单胺变化，发现Rg-WT显著增加了门静脉中PEA、色胺和酪胺的水平，其中PEA水平升高了约60倍，且大部分PEA在经过肝脏进入下腔静脉时被单胺氧化酶B（MAO-B）代谢。

尽管肝脏代谢了大部分PEA，但Rg-WT小鼠下腔静脉中的PEA水平仍高于对照小鼠，而在大脑中这种差异消失，表明除了肝脏的强代谢能力外，其他因素可能在肝脏后静脉和大脑之间消除PEA。

与健康小鼠相比，肝硬化小鼠的肝脏和外周血清中MAO-B活性显著降低，只有定植了R. gnavus的肝硬化小鼠大脑中出现PEA积累。此外，通过对三个公共肝脏转录数据集的分析发现，肝脏疾病中肝脏MAO-B转录水平显著降低，且在研究者自己的队列中也观察到肝硬化患者外周血清中MAO-B活性下降。这些发现表明，在肝硬化期间，R. gnavus的增加会导致大脑中PEA的病理性积累，形成肠-肝硬化-脑轴。

▲当MAO-B活性由于肝硬化而降低时，gnavus导致PEA在脑中的病理性积聚

该研究进一步探索了R. gnavus是否会通过肠-肝硬化-脑轴诱导神经毒性和与肝性脑病。研究人员建立了小鼠肝硬化模型，通过旷场实验和Morris水迷宫测试评估小鼠神经认知和行为变化。结果显示，定植R. gnavus的小鼠大脑中PEA水平升高，表现出焦虑样行为和记忆保留缺陷，这些行为变化与肝性脑病的早期表现相似。在模拟肝功能恶化条件下，只有R. gnavus定植的小鼠出现类似肝性脑病患者的症状，如对称性关节震颤和昏迷。

此外，研究人员还评估了R. gnavus定植后六个脑区的神经病理表型，发现皮层和海马区星形胶质细胞密度增加，皮层星形胶质细胞肿胀和激活，微胶质细胞在大脑皮层激活，表现为形态学变化。这些发现表明R. gnavus诱导明显的星形胶质细胞增生和神经炎症，是肝性脑病患者大脑病理变化的标志。

▲R.gnavus通过PDC诱导肝硬化小鼠出现肝性脑病样综合征

为了确定PDC在R.gnavus诱导的神经毒性中的关键作用，研究人员用突变株Rg-Mu单定殖肝硬化小鼠，发现其虽与Rg-WT有相似的定植能力，但失去了诱导大脑PEA积累、焦虑样行为、记忆障碍、昏迷或神经病理变化的能力，表明PDC酶活性对R. gnavus诱导神经毒性的必要性。

▲PDC在介导R.gnavus对肝硬化小鼠的神经毒性作用中起着关键作用

为了探索抑制细菌PDC活性的治疗方法，研究者从TargetMol筛选了22240种分子，识别出77种潜在的R. gnavus来源PDC抑制剂，其中(S)-α-FMT（PDCI）抑制效率最高。动物模型中，PDCI显著减少了由R. gnavus引起的脑PEA积累、行为和神经病理异常，证实了PDC作为治疗靶点的潜力。

▲PDCI的高通量筛选和体外评价

通过鉴定R. gnavus神经毒性的代谢产物，发现R. gnavus增加了肝硬化小鼠大脑中的PEA水平，而未改变酪胺或色胺水平。通过使用PEA单克隆抗体特异性阻断PEA的作用，不仅有效降低了大脑中的PEA水平，还减轻了R. gnavus诱导的神经毒性效应，表明PEA是PDC的主要产物，具有显著的血脑屏障通透性。

▲PEA是R.gnavus神经毒性作用关键

为了探索肝性脑病患者复杂粪便微生物群的神经毒性潜力，研究人员将三名健康对照者和三名肝性脑病患者的粪便微生物群转移到肝硬化无菌小鼠的肠道中，结果显示，移植了肝性脑病患者粪便菌群的小鼠（miceHE）重现了高PDC编码基因水平的特征，导致大脑中PEA积累，并表现出焦虑样行为和记忆保留障碍，而定植了健康者分辨菌群的小鼠与对照小鼠相比行为变化不显著。神经病理学检查发现miceHE出现星形胶质细胞肿胀和微胶质细胞激活。

▲患者粪便微生物群诱导肝硬化小鼠神经行为和神经病理学变化

这些结果表明，肝性脑病患者复杂粪便菌群在肝性脑病发病机制中具有直接作用。为了进一步确认PDC-PEA通路在肝性脑病菌群诱导的神经病理过程中的关键作用，研究者对miceHE进行了PDCI或PEA抗体治疗，这些治疗显著减轻了肝性脑病菌群的有害影响。综上所述，肝性脑病患者的复杂粪便菌群可在肝硬化背景下诱导神经毒性，PDC和PEA是有效的治疗靶点。

▲靶向PDC减轻肝性脑病患者粪便微生物群引起的神经毒性

通过mRNA测序分析肝硬化小鼠接受健康对照（miceHC）、肝性脑病患者（miceHE）以及经PDCI处理的肝性脑病患者（miceHE+PDCI）粪便菌群后，大脑皮层、海马和纹状体的分子效应，发现肝性脑病患者的粪便菌群主要影响大脑皮层的全局基因表达，这可能与神经元投射发育和管状形态发生途径相关，而通过PDCI治疗能够使大部分上调或下调的基因恢复正常。这些结果证实了大脑皮层特异性神经元损伤是肝性脑病患者粪便菌群诱导的典型病理特征。

▲皮质特异性神经元损伤是粪便微生物群诱导的神经毒性的标志

为了阐明PEA与肝性脑病之间的因果联系，该研究纳入了一个包含60名接受经颈静脉肝内门体分流术（TIPS）的患者的纵向研究队列，并检测了术前的血清PEA水平，以探究其与术后3个月内肝性脑病发生的关系。结果显示，术后3个月内发展为肝性脑病的患者，其术前血清PEA水平显著高于未发生肝性脑病的患者 （P = 0.0045） 。调整年龄、性别、氨水平、腹水、既往肝性脑病病史等潜在混杂因素后，术前高PEA水平与术后肝性脑病发生的风险显著相关，高PEA水平的患者发生肝性脑病的风险是低PEA水平患者的7倍。这个发现表明，PEA不仅是肝性脑病的一个重要致病因子，还是一个非常有潜力的预警标志。

▲血清PEA水平与粪便PDC编码基因丰度相关，高基线PEA水平与TIPS后HE风险增加相关

总之，该研究提出了一个新的可能性，通过监测PEA的水平，医生或许能够预测肝性脑病的发生风险，甚至在病情加重之前就进行早期诊断和干预。此外，研究团队还将进一步探索抑制苯乙胺产生的药物用于治疗肝性脑病的效果，帮助改善患者的生活质量。

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