摘要
T辅助细胞1型（TH1）和2型（TH2）之间的平衡对于有效的抗病毒和抗肿瘤免疫反应至关重要，但其调节机制尚未得到充分理解。这项名为“神经肽信号调控T细胞分化”的研究探讨了神经肽如何影响T辅助细胞分化。
研究人员在体外和体内研究了急性病毒感染期间T辅助细胞1型（TH1）分化的动态调节机制。他们利用一种独特的TH1和TH2二元培养系统，通过全面的CRISPR筛选确定和验证了T辅助细胞分化的调节因子。研究的重点是RAMP3的作用，它是神经肽CGRP（降钙素基因相关肽）受体的组成部分，决定着TH1细胞的命运。
研究发现，RAMP3在促进TH1细胞分化的同时，抑制TH2细胞的发育，在细胞内发挥着关键作用。CGRP通过RAMP3-CALCRL受体复合物的胞外信号传递，激活下游涉及环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)和激活转录因子3(ATF3)的途径，进一步诱导Stat1表达——TH1分化的关键调节因子。在病毒感染期间，神经元产生的CGRP与表达RAMP3的T细胞相互作用，通过促进TH1和CD8+T细胞产生干扰素γ，增强抗病毒反应，从而促进及时清除病毒。
该研究发现了一种新的神经免疫回路，其中神经元通过神经肽信号传递影响T细胞的命运决定，凸显了神经免疫交叉对话在适应性免疫中的重要性。这些发现有助于了解神经肽如何指导T细胞分化，并为增强抗病毒免疫力和治疗由免疫失衡引起的疾病（如严重COVID-19，其中偏离的TH2分化与较高的死亡率相关）提供了潜在的治疗靶点。这项研究不仅加深了我们对免疫调节机制的理解，还为针对神经免疫相互作用的治疗干预开辟了新的途径。
T细胞分化过程的动态调节机制
图1结合了体外和体内实验，聚焦T细胞分化。研究采用TH1-TH2二元培养系统，在多个时间点（跨越72小时）分析T细胞分化条件下的转录组动态，发现三个阶段：早期（0-5小时）、中期（8-23小时）和晚期（32-72小时）。同时，通过单细胞RNA测序分析急性LCMV感染后8天的CD4+T细胞。这些实验旨在揭示T细胞分化中的基因表达动态，区分共享激活响应与TH1、TH2独特分化响应，从而探索调控网络。研究利用时间转录谱和单细胞分析，旨在识别影响T细胞命运、特别是TH1/TH2平衡的关键调节因子。
Fig1a：此图展示了体外TH1细胞分化过程中动态表达基因的相对表达量。研究人员在TH0、TH1或TH2条件下多个时间点对转录组进行了分析，确定了三个不同的动态表达阶段：早期（0-5小时）、中期（8-23小时）和晚期（32-72小时）。关键细胞因子受体基因和转录因子在不同阶段上调，凸显了T细胞分化过程中基因表达的时序动态变化。
Fig1b：此图展示了体外TH1和TH2细胞分化过程中 temporal bulk RNA-seq数据的主成分分析（PCA）。PCA区分了所有阶段中共享的激活响应（PC1）与TH1和TH2细胞分化特有的响应（PC2）。该分析有助于识别T辅助细胞在不同分化阶段特有的调节因子。
Fig1c：此示意图展示了LCMV Armstrong感染期间CD4+ T细胞单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析的实验设计。该研究涉及在感染后第八天收集脾脏CD4+ T细胞，以表征体内TH1细胞的分化情况。
Fig1d：此图展示了在LCMV Armstrong感染期间，根据CD4+ T细胞的表达谱将其分为八个不同组。这些组包括TH1细胞、T滤泡辅助细胞（TFH）以及其他免疫细胞类型，并使用Slingshot推断他们的分化过程，以展示从初始状态到效应状态的进展。
Fig1e：此图展示了图1d中鉴定的每个细胞簇所选标志基因的表达谱，提供了病毒感染期间不同阶段和类型的T细胞分化相关特异性基因特征的见解。
T细胞分化的平衡和调节机制
图2描述了TH1-TH2二分培养系统结合单细胞RNA测序（scRNA-seq）进行的实验。该实验是为了探索在受控条件下T细胞分化为TH1和TH2细胞的平衡和调节机制。
试验设计
1.TH1-TH2二分培养：将初未成熟CD4+ T细胞培养在同时含有低浓度IL-12和IL-4的培养基中，以创造一种支持TH1和TH2细胞同时分化的二分条件。
2.时序 scRNA-seq：在培养过程中，每隔4小时收集一次细胞，持续72小时，最终获得了一个包含27,406个细胞的全面数据集。
3.数据分析：利用scRNA-seq数据，研究人员确定了分化的三个主要时间阶段：早期、中期和晚期。他们观察到IFNγ（指示TH1细胞）和IL-13（指示TH2细胞）的表达模式在时间上互斥，特别是在较后的时间点。
Fig2a：此图展示了在TH1-TH2二分条件下培养初始CD4+ T细胞三天的结果。通过使用IfngYFP/IL13hCD4 小鼠，研究人员能够将细胞分类为IFNγ+、IL-13+和双阴性（DN）群体。通过qPCR测量TH1或TH2细胞特征基因的相对表达量，显示IFNγ+和IL-13+细胞的比例相当，突出了二分培养系统在产生不同T辅助细胞身份方面的有效性。
Fig2b：此图展示了在TH1-TH2二分条件下培养三天期间，每4小时进行一次的时序scRNA-seq分析。通过UMAP嵌入分析，展示了全局转录组动态。细胞根据其收集时间点着色，研究人员得以识别出了T细胞在分化中的三个主要动态阶段：早期、中期和晚期。
Fig2c：此图展示了在TH1-TH2二分条件下培养，所有收集的细胞中Ifng和Il13的互斥表达模式，在较后的时间点尤为明显。这种互斥性强调了控制TH1和TH2分化存在两条不同的调控轴。
Fig2d：与图2c相似，此图展示了收集的细胞中TH1和TH2细胞程序之间的互斥表达，进一步强化了这些分化途径之间存在抑制性相互作用。
FIg2e：此图描绘了二分培养条件下所有检测时间点中已定义细胞类型（初始细胞、TH1和TH2）的百分比分布，显示了细胞如何随时间演变而分化。
Fig2f-h：这些图展示了在二分培养条件下不同时间点收集的细胞的伪时间分析：
图2f：细胞根据其伪时间得分着色，展示了从未定义状态经过中间阶段到充分分化的TH1或TH2状态的进展。
图2g：细胞根据已定义的细胞类型（TH1、TH2或未定义）着色，说明了不同身份如何随时间出现。
图2h：细胞根据其收集时间点着色，为其分化轨迹提供了时间背景。
Fig2i：此图突出了图2f中伪时间分析所确定的分支基因的表达模式。它包括TH1和TH2细胞的特征基因，如Gata3、Batf、Tbx21和Stat4，以及潜在的调节因子，如Sat1和Ramp3。
识别和验证TH1细胞分化的调节因子
图3中的图像是通过一系列实验获得的，这些实验涉及CRISPR-Cas9基因组合筛选，旨在识别和验证T辅助1（TH1）细胞分化的调节因子。
试验设计
1.CRISPR-Cas9筛选基因：针对117个候选基因（TH1细胞分化的潜在调节因子）研究人员进行了组合的CRISPR-Cas9筛选，这些候选基因是基于它们在体内和体外环境中的表达谱而选择的。
2.细胞准备和转导：从Rosa26-Cas9小鼠中分离出初始CD4+ T细胞，激活并用慢病毒sgRNA文库进行转导。该文库旨在干扰这些细胞中候选基因的表达。
3.体外和体内分化：将转导后的细胞在体外置于TH1或TH2分化条件下，以及在LCMV Armstrong感染期间置于体内条件下。这使研究人员能够观察基因扰动在不同条件下对T细胞分化的影响。
4.分选和测序：分化后，根据关键细胞因子（对于TH1细胞为IFNγ）和其他标志物的表达水平对细胞进行分选。然后对每个分选群体中的sgRNA丰度进行测序，以确定哪些基因扰动影响了TH1细胞的分化。
Fig3a：此图概述了组合基因筛选的实验设计。从Rosa26-Cas9小鼠中分离出初始CD4+ T细胞，激活并用靶向候选TH1细胞调节基因的慢病毒sgRNA文库进行转导。然后将转导后的细胞在体外置于TH1或TH2条件下分别分化，并在LCMV Armstrong感染期间用于离体和体内分化。分化后，根据标志基因的表达对细胞进行分选，并对sgRNA的丰度进行测序，以评估对TH细胞分化的影响。
Fig3b：此图展示了在体外TH1条件下，靶向Stat4和Tbx21的sgRNA在不同分选细胞群体中的分布。对数转换的倍数变化（LFC）值表示特定sgRNA在TH1中的富集或减少，突出了它们作为IFNγ表达的正调节因子的作用。
Fig3c：该热图根据体外和离体筛选的结果，对TH1细胞的正负调节因子进行了排序。其中，RAMP3被突出显示为IFNγ表达的最强正调节因子之一。
Fig3d：此图提供了对筛选中发现的排名靠前的新型调节因子（如Hif1a、Aldoa、Hspa5（正调节因子）和P2rx7（负调节因子））的个别功能验证。验证采用体外基因扰动策略进行，确认了组合筛选的结果。
CGRP-RAMP3轴对分化的作用
图4中的图像是通过旨在研究CGRP-RAMP3轴在T细胞分化中的作用，特别是通过cAMP信号传导对TH1细胞分化的影响的实验获得的。
试验设计：
1.CGRP处理T细胞：用神经肽CGRP（降钙素基因相关肽）处理T细胞，以评估其对TH1和TH2细胞分化的影响。通过对IFNγ和IL-13进行标记，这两者分别是TH1和TH2细胞的关键标志物。
2.下游目的基因敲除：研究中使用了敲除Ramp3的小鼠，以评估RAMP3是否是观察到CGRP效应所必需的。
3.cAMP信号传导分析：实验包括用cAMP类似物二丁酰基-cAMP（dbcAMP）和cAMP信号传导途径的抑制剂处理，以探索cAMP如何介导CGRP对T细胞分化的影响。
4.流式细胞术和细胞因子分析：使用流式细胞术量化IFNγ和IL-13，而细胞因子水平则使用如LegendPlex等检测方法进行测量。
Fig4a：此图展示了CGRP处理如何影响TH1和TH2细胞的分化。在体外分化三天并用CGRP处理后，通过流式细胞术评估细胞内细胞因子的产生，特别是TH1细胞的IFNγ和TH2细胞的IL-13。结果表明，CGRP显著增强了IFNγ的产生，同时抑制了IL-13的表达，这表明CGRP促进了TH1细胞的分化并抑制了TH2细胞的分化。
Fig4b：此图显示了来自基因集富集分析（GSEA）的富集图，表明CGRP处理上调了TH1细胞特征基因。标准化富集分数（NES）显示，与载体处理的对照组相比，CGRP处理的细胞中TH1细胞相关表达程序显著增强。
Fig4c：此图表明，在Ramp3−/− T细胞中，CGRP或ADM（RAMP3–CRLR的另一种配体）对TH1分化的增强作用被消除。流式细胞术分析显示，在Ramp3缺失的T细胞中，CGRP或ADM处理后IFNγ表达降低，突显了RAMP3对于这些效应的必要性。
Fig4d：此图显示，在未进行外源性CGRP处理的情况下，Ramp3−/− T细胞在TH1分化方面没有表现出缺陷，这表明在这些条件下，内源性CGRP对TH1分化的影响不显著。
Fig4e：此图表明，使用cAMP类似物二丁酰环磷酸腺苷（dbcAMP）处理，可模拟CGRP和ADM的作用，在TH1条件下以剂量依赖的方式增强IFNγ的产生，并在TH2条件下抑制IL-13的产生。
Fig4f：此图表明，CGRP对TH1分化的增强作用被CREB抑制剂666-15所阻断，这表明CREB激活是参与此过程的cAMP信号通路的关键组成部分。
CGRP-RAMP3-cAMP调节轴
图5所描述的这些实验旨在研究T辅助细胞1（TH1）分化过程中与降钙素基因相关肽（CGRP）–受体活性修饰蛋白3（RAMP3）–环磷酸腺苷（cAMP）信号轴相关的表观基因组变化和转录调控。作者结合了RNA测序（RNA-seq）和转座酶可及染色质测序（ATAC-seq）来分析这些变化。
实验设计
1.RNA-seq和ATAC-seq：将初始T细胞在TH1或TH2极化条件下培养，并用CGRP处理4小时。使用RNA-seq评估基因表达的变化，而ATAC-seq则用于评估染色质的变化。这种双重方法使研究人员能够将转录活性与表观遗传修饰相关联。
2.主成分分析（PCA）：对RNA-seq和ATAC-seq数据都进行了PCA，以可视化与载体对照相比，CGRP处理后引起的独特转录组和染色质可及性特征。
3.基因表达和染色质可及性：研究人员关注了早期TH1细胞调控基因，如Stat1、Il12rb2和Il18r1，并研究了它们的表达和染色质可及性如何受到CGRP处理的影响。
Fig5a：此图展示了在TH1或TH2极化条件下培养的初始T细胞经载体或CGRP处理4小时后的RNA-seq和ATAC-seq数据的主成分分析（PCA）。PCA结果显示，与载体对照组相比，CGRP处理诱导了独特的转录组和染色质可及性特征。
Fig5b：此图展示了经CGRP处理后，通过RNA-seq数据所显示的早期TH1细胞调节基因（如Stat1、Il12rb2和Il18r1）的诱导情况。这些基因的上调表明CGRP促进了一个类似TH1细胞的转录程序。
Fig5c：此图展示了经CGRP处理后，利用ATAC-seq技术评估的早期TH1调节基因位点上染色质可及性的变化。这些位点上可及性的增加与其表达上调相关，表明发生了表观遗传重塑。
Fig5d：此图显示了经CGRP处理后，在诱导TH1的培养条件下Il12rb2基因座上染色质可及性的差异，进一步阐释了与TH1分化相关的表观遗传变化。
Fig5e：此图为经CGRP处理后，诱导TH1和TH2的培养条件下的差异可及区域之间的相对可及性。结果表明，CGRP增加了与IFNγ信号通路相关基因的可及性，同时降低了Gata3和Il13等TH2相关基因座的可及性。
Fig5f：此图展示了在CGRP处理后，TH2条件下GATA3基因座上染色质可及性的丧失，这支持了CGRP在抑制TH2分化中的作用。
Fig5g：经CGRP处理的TH1细胞中ATF3表达增加，表明该转录因子作为信号通路的一部分被激活。
Fig5h：一张代表性印迹显示，经CGRP处理的TH1细胞中CREB（p-CREB）的磷酸化水平升高，表明CREB作为cAMP信号级联的一部分被激活。
Fig5i：染色质免疫沉淀后接荧光定量PCR（ChIP-qPCR）证实，p-CREB与TH1细胞中的Atf3启动子结合，支持其在调节ATF3表达中的作用。
Fig5j：在Atf3敲除的T细胞中，CGRP没有诱导Stat1的表达，表明ATF3对于CGRP诱导的Stat1表达是必需的。
Fig5k：ChIP-qPCR分析显示，ATF3与Stat1启动子结合，表明ATF3在Stat1表达中起直接调控作用。
Fig5l：荧光定量PCR分析显示，在Stat1敲除的T细胞中，CGRP对早期TH1调节模块的诱导被阻断，突显了STAT1在介导CGRP对TH1分化的影响中的重要性。
神经系统调节免疫反应
研究CGRP-RAMP3轴在病毒感染过程中增强T细胞反应的作用的实验，特别是使用了LCMV Armstrong感染的小鼠模型
实验设计
1.小鼠模型：本研究使用了缺乏编码CGRP基因的Calca−/−小鼠和缺乏RAMP3受体的Ramp3−/−小鼠，以评估它们在LCMV感染期间对T细胞反应的影响。
2.LCMV感染：给小鼠感染LCMV Armstrong株，以诱导抗病毒免疫反应。研究人员在感染后不同时间点测量了各种免疫参数，包括T细胞反应和病毒载量。
3.神经元CGRP来源：通过评估神经元中CGRP的表达和使用树脂毒素（RTX）删除已知产生CGRP的TRPV1+神经元，来研究感染期间CGRP的来源。
4.过继转移：进行过继转移实验，将来自野生型（WT）或Ramp3−/−小鼠的初始CD4+ T细胞转移至受体小鼠中，以专门研究感染期间T细胞中RAMP3的内在作用。
Fig6a：该图显示，缺乏编码CGRP基因的Calca−/−小鼠在LCMV感染后，抗原特异性CD4+ T细胞中的TH1反应降低。与野生型（WT）小鼠相比，流式细胞术分析显示产生IFNγ的CD4+ T细胞减少，表明在缺乏CGRP的情况下，TH1分化受损。
Fig6b：该图显示，在LCMV感染后第8天，与WT小鼠相比，Calca−/−小鼠的脾脏增大且病毒滴度更高。这些发现表明，CGRP对于有效清除病毒和控制感染期间脾脏肿大至关重要。
Fig6c：免疫荧光染色显示，LCMV感染后，脾脏内神经元中的CGRP表达增加。CGRP存在于靠近T细胞的神经元中，这表明存在一种神经免疫相互作用，即神经元CGRP影响T细胞反应。
Fig6d：ELISA检测显示，LCMV感染后，用高氯化钾（KCl）处理的脾脏组织块中CGRP分泌增加，表明病毒感染期间神经元活动和CGRP释放增强。
Fig6e：RTX处理的小鼠（TRPV1+神经元被消融）在LCMV特异性CD4+ T细胞中产生的IFNγ减少，与Calca−/−小鼠相似。这支持了神经元CGRP在感染期间促进TH1反应的作用。
Figf-g：这两幅图显示，Ramp3−/−小鼠在LCMV感染期间表现出降低的TH1和Tc1细胞反应，如总抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞中IFNγ表达减少所示。这强调了RAMP3在介导有效抗病毒免疫反应中的重要性。
Fig6h：Ramp3−/−小鼠在感染后第8天表现出脾脏增大和病毒载量增加，与Calca−/−小鼠相似，进一步证实了CGRP-RAMP3轴在控制病毒复制和免疫反应效率中的作用。
Figi-k：这些图描述了一项过继转移实验，其中在LCMV感染前，将来自WT或Ramp3−/−小鼠的初始CD4+ T细胞转移至受体小鼠中。结果显示，与WT T细胞相比，转移的Ramp3−/− T细胞中IFNγ表达显著降低，表明RAMP3在病毒感染期间促进TH1分化中具有细胞内在作用。
