序言
中性粒细胞是创伤性脑损伤（TBI）后最先响应的细胞，但其在TBI后的调节机制仍不清楚。中国人民解放军陆军军医大学ShuangShuang Dai教授团队发现一类新型中性粒细胞（FOXO1高表达中性粒细胞）在TBI后出现，其在急性期加重炎症加剧急性脑损伤；在慢性期通过“FOXO1-TFRC”机制促使少突胶质细胞铁稳态失衡，诱导TBI后抑郁。该研究为了解中性粒细胞在TBI中的作用提供了新的见解，相关结果发表在2024年《Military Medical Research》杂志。
文献地址: 10.1186/s40779-024-00523-w.
研究背景
免疫炎症是TBI继发性损伤的主要机制。由于血脑屏障的破坏，TBI后除脑内的炎症细胞（如小胶质细胞和星形胶质细胞）外，外周免疫细胞也被激活并浸润脑实质。中性粒细胞是常见的外周免疫细胞，是TBI后清除病原体和碎片的第一道防线，也是神经炎症的始动因素。传统观念认为中性粒细胞是短命的免疫细胞，只影响TBI的急性阶段。然而，越来越多的证据表明，中性粒细胞通过多种机制加剧了慢性炎症性疾病中的组织损伤。
TBI后抑郁症是慢性阶段中最常见的并发症之一，其发病率高达30%至77%。临床研究表明，TNF-α、IL-1和IL-6等炎症因子在TBI后抑郁症患者中显著增加。动物研究也表明炎症信号也与TBI后抑郁样行为密切相关。
叉头框蛋白O1（FOXO1）是一种保守的转录因子，其参与细胞周期、凋亡和应激等多种生物学进程。近年来，FOXO1在免疫细胞中的作用逐渐受到关注。例如，FOXO1调节L-选择素CD62L的表达，抑制晚期NK细胞的成熟，从而促进NK细胞回归淋巴结。此外，FOXO1还能正向调节巨噬细胞中的主要组织相容性复合体II基因，促进M2型巨噬细胞的极化，促进肿瘤生长。在肝缺血再灌注损伤中，FOXO1减少Th17细胞极化，缓解再灌注应激损伤。
本研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析发现了一类高表达FOXO1的中性粒细胞，这些细胞在TBI的急性和慢性阶段持续存在。因此，本文进一步研究了这些FOXO1高表达中性粒细胞在TBI后脑功能调节的作用及机制，有助于开发有效的TBI免疫调节疗法。
研究结果
1. 多组学整合揭示中性粒细胞FOXO1及其相关靶基因在TBI急性期高表达
鉴于中性粒细胞在TBI中的重要作用，笔者团队对健康人和TBI患者在TBI后48小时内的外周血中性粒细胞进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）。在初步质量控制过滤后，识别出14个细胞群，包括T细胞、B细胞、中性粒细胞、NK细胞、树突状细胞（DCs）、浆细胞和晚期红细胞（图1a）。聚类基因的表达水平见图1b。聚焦于中性粒细胞，最终获得了大约2000个细胞，并识别出3种不同的中性粒细胞亚型（图1c），及前10位显著差异基因（图1d）。根据ChEA3网站预测，发现每类中性粒细胞前10基因大多数是转录因子FOXO1的靶基因。此外，基于GO分析，研究人员发现FOXO1是在急性期调节TBI患者中性粒细胞转录（图1e）和蛋白质代谢过程（图1f）的唯一分子。这些数据表明，FOXO1相关基因谱是TBI患者中性粒细胞的一个显著特征（图1g）。与这一发现一致，代谢组学显示，小鼠假手术组和TBI组骨髓来源中性粒细胞的58个显著差异代谢物（图1h）的KEGG分析显示，FOXO信号通路显著激活（图1i）。笔者团队进一步在TBI患者和TBI小鼠的中性粒细胞中检测到FOXO1蛋白水平升高，而非mRNA水平（图1j、1k），表明FOXO1的高表达发生在转录后水平而非转录水平，这也解释为什么sc-RNA未能在TBI患者的中性粒细胞中识别出FOXO1高表达mRNA。这些数据表明，TBI后FOXO1高表达是急性期中性粒细胞的一个显著特征，其可能协调其下游靶基因形成信号网络，在疾病进展过程中调节中性粒细胞的功能。
图1. 多组学整合揭示TBI急性期FOXO1高表达。
2. 干扰中性粒细胞FOXO1减轻TBI急性期的神经功能缺损和神经元损伤
为了检测FOXO1高表达中性粒细胞在TBI急性期的作用，作者团队比较了FOXO1基因骨髓细胞特异性敲除小鼠（FOXO1△Lyz2小鼠）与同窝其野生型小鼠在TBI后的行为学结果。在TBI后48 h，FOXO1△Lyz2小鼠表现出较低的死亡率和更快的恢复（包括运动协调平衡和神经功能缺损评分）（图2a, b）。在TBI后48小时内，损伤脑组织中检测到FOXO1高表达中性粒细胞的浸润。免疫荧光分析显示，FOXO1高表达的中性粒细胞特异性累积在TBI患者的创伤脑区（图2c）。与此一致，TBI小鼠模型中的发现，TBI后48 h损伤脑组织中浸润的中性粒细胞中约80%表现出高表达FOXO1（图2d）。流式细胞术也证明了外周血中存在FOXO1高表达中性粒细胞（图2e）。众所周知，TBI会导致组织损伤和神经元丧失。研究结果表明，FOXO1△Lyz2小鼠TBI后神经元丢失显著减少（图2f, 2g）。综上所述，这些发现表明，FOXO1高表达的中性粒细胞在TBI急性期加重了神经功能缺损和脑损伤。
图2. FOXO1高表达中性粒细胞加重脑外伤急性期神经元损伤。
3. FOXO1通过“FOXO1-VCAN”信号通路增强中性粒细胞抗凋亡能力，促进产生IL-6
为研究FOXO1在TBI后对中性粒细胞的调节作用，使用基因集富集分析进一步分析了TBI患者的scRNA-seq数据，获得了前10个生物学通路（图S4a），由凋亡调节因子BCL-2家族调节的细胞凋亡显著富集（图S4b）。流式细胞术分析表明，TBI小鼠的中性粒细胞表现出更强的抗凋亡能力，而这种能力在FOXO1条件性敲除后被削弱（图3a），表明FOXO1高表达有助于延长TBI后中性粒细胞的寿命。除抗凋亡作用外，FOXO1还显著增强中性粒细胞释放促炎细胞因子IL-6的能力，而非TNF-α和IL-1β（图3b）。
为探索潜在的分子机制，笔者团队验证了图1g所示的中性粒细胞中FOXO1的靶基因。VCAN在TBI患者和TBI小鼠模型的中性粒细胞中特异性高表达（图3c）。如预期一致，干扰FOXO1高表达中性粒细胞中的VCAN表达，阻断了中性粒细胞中FOXO1介导的抗凋亡作用和IL-6产生（图3d, 3e）。结合生物信息学分析，萤光素酶测定和ChIP实验，笔者团队确定VCAN在其启动子区域的-802至-813bp位点直接和特异性结合FOXO1（图3f-h）。综上所述，这些数据证实VCAN是一个参与中性粒细胞FOXO1功能的靶基因。VCAN是硫酸软骨素蛋白聚糖的一个重要亚群，通常作为细胞外基质分子分泌到细胞外。然而，在本研究发现FOXO1上调细胞质中的VCAN并增强其与促凋亡蛋白调节因子BAX的相互作用，从而抑制BAX易位至线粒体以形成促凋亡BAX-BCL2复合物（图3i-1），证明FOXO1触发“FOXO1-VCAN”信号重编程嗜中性粒细胞，增强其抗凋亡作用以及IL-6的产生。体外中性粒细胞—神经元共培养系结果表明，由FOXO1高表达中性粒细胞诱导的神经元损伤可以被小干扰RNA（siVCAN）阻断（图3m），为该机制参与TBI急性期神经元损伤提供进一步证据。
图3. FOXO1增强中性粒细胞抗凋亡和IL-6释放能力。
4. TBI慢性期脑内FOXO1高表达中性粒细胞浸润与抑郁症发生密切相关
抑郁症是创伤性脑损伤后最常见的并发症之一，在第一年发病率很高，并在损伤后50年持续高发。笔者团队在TBI小鼠模型中，通过过度减肥、减少蔗糖摄入量、增加尾部悬吊时间等指标来识别TBI引起的抑郁小鼠，观察到FOXO1△Lyz2小鼠在TBI后1个月的抑郁发生率明显降低，从37.0%降至20.0%（图4a-c）。此外，与TBI后的非抑郁小鼠相比，抑郁小鼠损伤脑皮质组织中纤维蛋白原的血管外积累显著增加（图4d），表明TBI和抑郁小鼠中BBB的持续损伤。即使在TBI的慢性阶段，血脑屏障的破坏也会促进循环免疫细胞渗入大脑。因此，我们检测了在患或未患TBI诱导的抑郁症的这些小鼠脑实质中的中性粒细胞浸润情况。令人惊讶的是，免疫染色结果显示，在患有TBI诱导的抑郁症小鼠损伤脑区中存在大量的FOXO1高表达中性粒细胞聚集（图4e）。这进一步证实了在TBI的慢性阶段，FOXO1高表达中性粒细胞的存在和浸润与TBI诱导的抑郁症有关。
图4. FOXO1在中性粒细胞中的高表达与TBI后抑郁的发生率相关。
5. FOXO1高表达中性粒细胞显著降低少突胶质细胞MBP的表达
为阐明FOXO1在TBI诱导的抑郁症中调节中性粒细胞的潜在分子机制，我们采用蛋白质组学方法分析和比较了患有或未患有TBI诱导的抑郁症的小鼠损伤脑组织中蛋白质的变化。GO分析表明，细胞功能中最显著的变化发生在髓鞘，包括紧密髓鞘和髓鞘轴突区域（图5a）。值得注意的是，在患有TBI诱导的抑郁症的小鼠中，髓鞘碱性蛋白（MBP）的水平显著降低。免疫染色和透射电镜显示，与未患抑郁症的小鼠相比，患有抑郁症的TBI小鼠的髓鞘密度和厚度减少。但在 FOXO1条件性敲除小鼠中，这些病理变化得到缓解（图5b, c）。蛋白质印迹结果也证实，在这个时间点，患有抑郁症的TBI小鼠的脑组织中MBP的表达与未患抑郁症的小鼠相比显著降低（图5d）。这些数据表明，MBP表达降低参与了FOXO1高表达中性粒细胞在TBI诱导的抑郁症中的促进作用。
图5. 中性粒细胞FOXO1高表达增加髓鞘损伤。
6. FOXO1破坏中性粒细胞和少突胶质细胞之间的铁稳态，导致少突胶质细胞中 MBP 的降低
通过检查患有或未患有TBI诱导的抑郁症的小鼠的脑组织蛋白质组学以及从骨髓中分离出的中性粒细胞，我们在“细胞过程”层面发现了铁代谢紊乱的证据，这可能与铁死亡有关。结果表明，铁死亡相关蛋白，包括脑组织中的FTH1/FTL1以及中性粒细胞中的FTL1/TFRC均增加（图6a, b）。通过蛋白质印迹进一步证实了这些蛋白在TBI诱导的抑郁症小鼠中的表达（图 6c）。通过检测xCT、总铁浓度和脂质过氧化物（LPO）水平，我们证实了TBI诱导的抑郁症小鼠的骨髓中性粒细胞中的铁死亡水平显著增加，而中性粒细胞中FOXO1条件性敲除显著减轻了这种情况（图6c-e）。
通过生物信息学分析、荧光素酶测定和染色质免疫沉淀实验研究了中性粒细胞中与FOXO1相关的铁死亡机制。结果表明，TFRC是TBI诱导抑郁的中性粒细胞中FOXO1的靶基因，在其启动子区域的-1070至-1095碱基对处与FOXO1直接且特异性结合（图6f-h）。siTFRC在体外抑制了由FOXO1过表达诱导的中性粒细胞铁死亡（图6i-k），表明“FOXO1-TFRC”参与了TBI慢性阶段中性粒细胞中铁稳态的破坏。此外，在中性粒细胞和少突胶质细胞的共培养系统中，我们观察到这些受“FOXO1-TFRC”信号调节的中性粒细胞导致了铁水平和FTH表达的异常，这与少突胶质细胞中MBP的减少密切相关（图6l）。总之，这些发现揭示了中性粒细胞和少突胶质细胞之间由FOXO1介导的铁代谢失调导致少突胶质细胞中MBP减少，从而促进了TBI后抑郁的发展。
图6. FOXO1破坏中性粒细胞和少突胶质细胞铁稳态。
结论
TBI急性和慢性阶段出现一类新型中性粒细胞（FOXO1高表达中性粒细胞），其加剧急性期脑损伤和促进慢性期抑郁发生。该研究揭示了中性粒细胞在TBI中的异质性和多功能性，为TBI后潜在的免疫疗法提供见解。
译者
医学博士，毕业于复旦大学附属华山医院，导师胡锦教授。
