PMID:10915991
DOI: 10.1111/cns.14429
摘要
脑出血（ICH）后血脑屏障（BBB）破坏可显著诱导神经功能损伤。既往研究表明，HDAC6敲低或TubA可保护TNF诱导的内皮功能障碍。然而，HDAC6抑制在ICH诱导的血脑屏障破坏中的作用尚不清楚。本研究采用Hemin诱导的人脑微血管内皮细胞（HBMECs）和胶原酶诱导的大鼠，研究HDAC6抑制对脑出血后血脑屏障病变和神经元功能障碍的潜在影响。结果显示，乙酰化α-tubulin在脑出血早期明显减少。25或40 mg/kg TubA均能减轻脑出血动物模型的神经功能缺损、血肿周围细胞凋亡和同侧脑水肿。TubA或HDAC6特异性siRNA抑制HBMECs细胞凋亡，降低其内皮通透性。抑制HDAC6恢复了脑出血诱导的TJ蛋白的降解，修复了TJ的损伤。结果表明，该药物对脑出血诱导的血脑屏障损伤的保护作用可能是通过上调乙酰化α-tubulin和减少应激纤维的形成来实现的。总之，抑制HDAC6的表达对实验性脑出血后血脑屏障损伤具有保护性作用，这表明HDAC6可能是脑出血治疗的一个潜在新靶点。
研究背景
脑出血是临床上常见的急性脑血管病，以原发性非外伤性脑实质出血为特征。尽管最近在治疗脑出血方面取得了一定进展，但临床结果仍然不令人满意。只有大约1/5的患者在6个月后恢复了功能独立。血脑屏障（BBB）破坏被认为是脑出血继发性脑损伤的标志。此外，内皮功能障碍导致的血管源性脑水肿被认为是长期预后不良的重要因素。因此，近年来，寻找新的治疗方法来对抗血脑屏障损伤是至关重要的。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACis）已被发现通过多种机制作用于中风和神经退行性疾病。泛型和同型特异性HDACis在包括出血性中风在内的不同脑疾病中发挥作用。HDAC6属于IIb类HDAC，主要位于细胞质中，具有两个催化结构域。TubastatinA（TubA）是HDAC6最有效的抑制剂，对HDAC6的选择性超过1000倍。值得注意的是，遗传或药理学抑制HDAC6已被发现在缺血卒中、亨廷顿病、阿尔茨海默病和出血性卒中中发挥神经保护作用。此外，研究人员发现，通过siRNA或TubA敲低HDAC6可以控制肺水肿模型内皮屏障完整性的动态变化。正如我们所知，内皮屏障的完整性对于维持血脑屏障的功能至关重要。然而，药物抑制或者基因干扰HDAC6是否能够改善脑出血后血脑屏障功能尚不清楚。因此，本研究旨在探讨抑制HDAC6对脑出血模型血脑屏障渗漏的保护作用及其机制。
研究方法
(1) 使用Hemin诱导的人脑微血管内皮细胞（HBMECs）和胶原酶诱导的大鼠来研究HDAC6抑制在脑出血后BBB损伤和神经元功能障碍中的潜在影响。
(2) 通过Western blot、免疫荧光染色、TUNEL染色、流式细胞术、Transwell实验和透射电镜等手段评估神经功能、BBB通透性、细胞凋亡、内皮细胞通透性、TJ蛋白表达和TJ超微结构。
(3) 通过腹腔注射TubA或siRNA处理动物和细胞，观察其对脑出血后BBB损伤的保护作用。
(4) 通过比较不同处理组的实验结果，分析HDAC6抑制对脑出血后BBB损伤的保护作用及其相关机制。
研究结果
1、体内和体外ICH诱导后乙酰化α-tubulin的表达
通过WB分析血肿周围组织中乙酰化α-tubulin的蛋白水平。与假手术组相比，ICH后1天乙酰化α-tubulin减少，在ICH后3天达到最低水平，然后在7天逐渐回升（图1A）。在培养的HBMECs中，血红素处理24小时后乙酰化α-tubulin的表达也显著下降（图1B）。同时，通过免疫组化染色在ICH后3天进一步检测了乙酰化α-tubulin的表达和分布。如图1C所示，在ICH后3天的大鼠脑内皮细胞中几乎未发现乙酰化α-tubulin共定位。
2、体内和体外抑制HDAC6的神经保护作用
ICH诱导的大鼠在术后第1天和第3天通过改良的Garcia试验显示出严重的神经功能损害（图2A）。用高剂量TubA（40mg/kg）给药对ICH后1至3天的神经功能损害有显著改善，而中等剂量TubA（25mg/kg）只能在第3天改善神经功能损害。与行为结果一致，TUNEL阳性细胞的数量在TubA处理组明显减少，与ICH组相比（安慰剂与TubA 25mg/kg相比，p=0.001，安慰剂与TubA 40mg/kg相比，p<0.001，图2C）。在体外，CCK-8用于评估HDAC6抑制对HBMECs活力的影响。正如预期，血红素诱导的细胞活力下降在用TubA或特定HDAC6敲低siRNA转染处理时显著提高（图2B）。相应地，血红素诱导的HBMECs的凋亡通过siRNA处理或TubA处理后得到显著改善（p<0.001，图2D）。
3、在体和离体实验显示HDAC6抑制减轻ICH诱导的BBB损伤
在ICH后第1天和3天，同侧基底节区的脑组织含水量显著高于假手术组（p<0.001，图3A）。而TubA治疗在25mg/kg（与安慰剂相比，p=0.001，1天；p=0.024，3天）和40mg/kg（与安慰剂相比，p<0.001，1天和3天）剂量下可有效减轻脑水肿。并且，高剂量组对脑水肿的效果优于低剂量组（TubA 40mg/kg与TubA 25mg/kg相比，p=0.006，1天，p=0.036，3天）。Evans蓝染色显示，在ICH诱导后第1天和3天，BBB明显被破坏。而使用两种剂量的TubA明显减轻了EB染料在同侧半球的渗漏（与安慰剂相比，p<0.001，1天和3天，图3B），但它们之间没有显著差异。
体外实验中研究者评估了HDAC6抑制对血红素诱导后内皮通透性的影响。血红素导致HBMECs对FITC-葡聚糖的高通透性，表明内皮功能障碍。相反，TubA治疗和siRNA治疗显著降低了血红素诱导的内皮通透性（p<0.001，图3C）。
4、在体和离体实验显示抑制HDAC6可减轻ICH诱导的TJ蛋白降解和TJ超微结构破坏
研究者探讨了TubA对ICH诱导后两种主要TJ蛋白（Occludin和ZO-1）的影响。结果表明，ICH引起Occludin和ZO-1的显著降解，而40mg/kg的TubA显著增加了这两种TJ蛋白（ZO-1：安慰剂与TubA 40mg/kg相比：p=0.024；Occludin：安慰剂与TubA 40mg/kg相比：p=0.049，图4A）。体外实验显示，通过TubA处理，Occludin和ZO-1在血红素诱导的HBMECs中显著上调（图4C）。通过siRNA转染特异性敲低HDAC6对ZO-1和Occludin的降解有显著的挽救作用（p<0.05）。
同时，通过透射电镜检测了ICH诱导后内皮细胞TJs的超微结构变化。在正常状态，基底膜完整连续，内皮TJs完整。然而，脑出血后第3天，BBB超微结构发生明显破坏。如图4B所示，部分内皮细胞TJs严重打开，看起来较短且模糊。与假手术组相比，基底膜呈断续、不规则、变薄。而TubA处理（40 mg/kg）组内皮细胞基底膜更加规则、光滑、完整，TJs几乎完整（图4B）。尽管在低剂量（25mg/kg）组的TJs之间有断裂，但它们比安慰剂组更长和更完整。与在体研究结果一致，研究者也检测了HDAC6抑制后的HBMECs的超微结构变化。与血红素诱导组相比，HDAC6 siRNA组和TubA组的内皮细胞基底膜更连续和平滑。此外，TJs更长，并在相邻细胞之间出现更多的紧密连接（图4D）。
5、HDAC6抑制增加了乙酰化α-tubulin的表达，并阻止随后的肌动蛋白应力纤维形成
在体内实验中，中等剂量的TubA（25mg/kg）只显示出挽救ICH诱导后乙酰化α-tubulin减少的趋势（p=0.322），而高剂量TubA（40mg/kg）显著上调了ICH后乙酰化α-tubulin蛋白（与安慰剂相比，p=0.003，图5A）。在体外实验中，TubA处理和HDAC6敲低都上调了血红素诱导的HBMECs中乙酰化α-tubulin的表达（图6A）。此外，还对每组进行了免疫荧光染色，结果与WB一致（图5B和6B）。
免疫染色结果表明，在体内和体外ICH构建后，phalloidin阳性细胞显著增加，这表明了肌动蛋白应力纤维的形成。此外，用25和40mg/kg剂量的TubA治疗均抑制了ICH体内和体外模型中的肌动蛋白应力纤维形成（图5C）。体外实验也证实TubA处理和siRNA处理抑制了血红素诱导的HBMECs中的肌动蛋白应力纤维形成（图6C）。
研究结论
该研究表明，HDAC6至少部分地参与了ICH后脑损伤的早期病理生理过程。药物抑制或基因抑制HDAC6对BBB具有保护作用，而这种神经保护作用是通过上调乙酰化α-tubulin和抑制应力纤维形成来实现的。总之，HDAC6可能是对抗ICH诱导的BBB破坏的潜在靶点。
译者简介
茹德文，复旦大学附属华山医院神经外科博士（在读），导师胡锦教授，主要从事神经重症的临床和研究工作。
