PMID: 39053649
DOI: 10.1016/j.brainresbull.2024.111034
概述
接受外科手术的老年人经常面临术后认知功能障碍 （POCD） 的危险。先前的研究表明，七氟烷麻醉对神经炎症的加剧作用，这会进一步恶化老年患者的 POCD 病情。间歇性禁食 （IF） 将食物摄取限制在特定的时间窗口内，并已被证明可以改善神经性炎症诱导的认知功能障碍。在本研究中，研究人员让 18 个月大的雄性小鼠在 24 小时内禁食 16 小时和 8 小时无限制进食，持续 0 、 1 、 2 和 4 周，然后在七氟烷麻醉下进行腹部探查。旨在通过术前实施 IF 措施来探讨 IF 对接受七氟烷手术的老年小鼠术后认知功能的潜在影响。研究结果表明，两周的 IF 导致手术后小鼠的学习和记忆能力显着增强。由新物体识别试验和莫里斯水迷宫测试确定的认知能力，以及通过体内电生理记录测量的突触可塑性，已显示出显着的改善。此外，IF 的施用显着增强了海马神经元中突触相关蛋白的表达，同时促炎因子的表达降低和海马脑区域内小胶质细胞密度的降低。总而言之，这项研究的结果表明，IF 可以减轻大脑海马区域的炎症。此外，IF 似乎为七氟烷麻醉引起的认知障碍和突触可塑性障碍提供了保护措施。
背景
POCD 发生在手术后 30 天到 12 个月之间，其特征是在手术干预和麻醉给药后发生的记忆、注意力、注意力和信息处理能力下降。一项国际多中心研究得出结论：年龄是长期 POCD 的危险因素。实际调查表明，大约 40% 的 65 岁或以上的老年人会遇到 POCD。与 POCD 不同，术后谵妄是另一种类型的术后认知障碍，在手术后即可发生，发生率为 11 %-51 %。最近的研究表明，术后谵妄患者更有可能患有 POCD。与非 POCD 相比，受 POCD 影响的个体死亡率显着增加，生活质量下降，并且对社会造成的经济负担更大。
七氟烷是一种广泛使用的吸入全身麻醉剂，因为它具有良好的低血气分配系数和血流动力学稳定性。然而，最近的研究表明，七氟烷麻醉手术可以诱导神经元和小胶质细胞的神经炎症，其中核因子-κB （NF-κB） 激活并促进炎性细胞因子的产生，包括白细胞介素-1β （IL-1β）、白细胞介素-6 （IL-6） 和肿瘤坏死因子-α （TNF-α），通过 toll 样受体，最早可在手术后 30 分钟在循环中检测到炎性细胞因子。这已在许多动物实验中报道。例如，有报道表明，七氟烷通过下调海马体中 PPAR-γ 活性来加剧小胶质细胞调节的神经炎症，从而促进认知能力下降。七氟烷通过激活 NF-κB 增加 TNF-α 和 IL-1β 的表达，从而导致成年后的长期认知功能障碍。麻醉和手术引起的损伤和炎症是不可避免的。然而，许多报告证实，手术前后应用的干预措施可以有效降低炎症程度和随后的认知障碍。因此，采用旨在减轻认知障碍的干预方法可能被证明是有利的。
IF 是一种饮食和禁食交替的饮食方案，受到广泛关注，因为它提供了一种实用的卡路里限制策略。肥胖已成为中国亟待解决的重大公共卫生问题。过量的卡路里摄入会大大增加患病的风险。广泛的动物实验和临床研究证实，高脂饮食 （HFD） 会加重 POCD 或诱发认知障碍，IF 可以改善 HFD 造成的上述损害。它的功效在于它能够调节昼夜节律周期，从而更有效地调节下丘脑（能量代谢的关键调节因子）以及炎症反应。因此，IF 是一种很有前途的方法，人们通过它来操纵身体的生理过程并促进健康。IF 可以改善与阿尔茨海默病 （AD） 相关的小鼠模型和老年大鼠的认知功能。此外，IF 的实施表明局灶性缺血性中风小鼠模型中的脑损伤显着减少，神经营养指标升高，炎症指标降低。
因此，本研究猜想假设 IF 可能通过改善啮齿动物的神经炎症来减轻七氟烷诱导的认知障碍。为了验证这一假设，研究者饲养 18 个月大的小鼠，通过在吸入七氟烷下进行的剖腹手术建立了认知障碍模型。此外，还仔细研究了 IF 对七氟烷诱导的认知障碍的调节作用。
材料与方法
动物
本研究中使用的实验对象是雄性 C57BL/6 J 小鼠（IF 对激素和代谢水平的影响因性别而异，雌性小鼠未参与本研究），年龄 9 个月，体重在 35 至 36 克之间。这些小鼠在恒温恒湿的条件下维持，从上午 7：00 开始 12 小时的光/暗循环。除了在模型建立和 IF 的特定程序期间，这些小鼠被提供足够的食物和水。小鼠被饲养到 18 个月大。训练期后一周，将小鼠随机分为四个不同的组：自由喂养组（0 周，n=18），IF 组一周（1 周，n=18），IF 组两周（2 周，n=18）和 IF 组 4 周（4 周，n=18）（图 1B）。每个笼子可容纳 5 只老鼠。IF 协议引用了 Hatori 等人的研究，在 24 小时内禁食 16 小时，留出 8 小时（晚上 11 点至早上 7 点）的时间窗不受限制地进食。1 周组在手术前 7 天开始 IF。2 周组在手术前 14 天开始 IF，4 周组在手术前 28 天开始 IF。除 IF 期外，所有组均在相同的条件下饲喂，并不受限制地获得水。
实验方法
根据已发布的 POCD 模型方案，外科手术在 3%（约 1.2 最低肺泡浓度）七氟烷麻醉下进行。在稳定小鼠的生命参数后，使用无菌手术器械打开腹腔并对腹部器官进行彻底检查。然后缝合切口。整个吸入麻醉过程持续了三个小时。术后，连续给予抗生素（80,000 单位/100 g 青霉素）和镇痛药（3 mg/kg 布比卡因）方案，持续 3 天。
实验时间表如图 1A 所示，4 周组开始 IF 的日期记录为第 0 天。图 1B 显示实验的分组。
行为学
NOR试验：每组随机选择 8 只小鼠在第 35 天进行 NOR 评估，以评估识别、学习和记忆能力。NOR 评估包括四个连续阶段，即习惯、熟悉和两个不同的测试。在适应阶段，将小鼠单独引入实验环境 10 分钟，以适应周围环境。在此之后，在熟悉阶段，将两个相同的对象，即对象 A 和对象 B，呈现给小鼠，为期 5 分钟。初始测试在熟悉阶段两个小时后进行，其中对象 B 被新对象 C 替换，并将小鼠置于实验装置中 5 分钟。第二次测试是在熟悉阶段 24 小时后进行的，其中对象 C 被另一个不同的对象 D 替换，并将小鼠重新引入实验装置中再 5 分钟。两项测试用于评估小鼠的短期和长期识别学习和记忆能力。通过使用已建立的统计方法计算新物体面积停留时间占总停留时间的百分比来分析小鼠区分两个物体的能力。
MWM试验：结束 NOR 评估的小鼠在第 37 天进行 MWM 测试，以评估空间学习和记忆能力。一个直径为 90 厘米、高度为 50 厘米的圆柱形容器装满了含有二氧化钛的不透明水，并保持在 25±1◦C 的恒定温度。容器被分为四个象限进行特定的测试程序，一个直径为 5 厘米的圆形平台位于指定象限中心的水面以下 2 厘米处。为了防止任何测试前的目视检查和评估，将小鼠放入面向墙壁的水中。每次在水中探险后，都会用吹风机吹干老鼠，然后再放回笼子里。MWM 分两个连续阶段进行：初始训练 （IT） 和空间探索测试 （SET） （图 1C）。在 IT 阶段，平台位于第二象限的中心，小鼠被随机释放到其余三个象限之一。允许小鼠自由探索 1 分钟，以在迷宫中导航并找到隐藏的平台;或者，如果他们没有这样做，他们就会被引导到平台并在那里停留 10 秒。经过 5 天的初始训练期后，移除平台，将小鼠置于与 IT 阶段相同的象限，并使用 CCD 相机记录它们的运动 1 分钟。记录小鼠穿过初始平台的次数。
体内长时程增强 （LTP） 记录
从每组其余 10 只小鼠中随机选择 6 只小鼠进行体内电生理检查。实现了沿穿孔路径 （PP） 到海马齿状回 （DG） 回路的长期增强 （LTP） 记录。本研究中的小鼠使用 30% 氨基甲酸乙酯溶液以 0.4 mL/10 g 体重的剂量腹膜内给药进行麻醉。然后将动物头部固定在立体定位装置 中。切开头皮以露出颅骨，并在两个感兴趣的区域进行了小型开颅手术。将双极刺激电极插入 PP 区（前囟后 3.8 mm，中线外侧 3.0 mm，硬脑膜腹侧 1.5 mm），并将单极电极植入 DG 区（前囟后 2.0 mm，中线外侧 1.4 mm，硬脑膜下方腹侧 1.5 mm）。调整电极的深度以满足电生理标准。选择最佳刺激强度以唤起约 70% 的最大响应，范围为 0.3-0.5 mA。记录在单脉冲刺激下开始，以 0.2 ms 和 0.05 Hz 持续 20 min，以建立基线。随后，应用由 30 个 12 个脉冲 （200 Hz） 的轨迹组成的 θ 爆发刺激 （TBS） 来诱导 LTP。用于基线记录的相同模式的单脉冲刺激每 1 分钟执行一次，总共 360 分钟。所有初始数据均使用 Clampfit 10.2 测量。
图1：A：实验时间表。B：实验的分组。红色：自由进食;蓝色：间歇性禁食。C：莫里斯水迷宫示意图。内圈：平台;三角箭头：老鼠入水的位置。D：平台穿越次数统计图表。E：逃逸延迟的统计图表。F：游泳速度统计图表。G：物体识别试验示意图。H：熟悉阶段的辨别指数统计图 新物体识别统计图。I：新物体识别第一次测试（2 小时）的辨别指数统计图。J：新物体识别第二次测试（24 小时）的辨别指数统计图。* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001.
结果
间歇性禁食对老年小鼠术后认知功能有显著增强
为了评估与海马体功能密切相关的空间学习和记忆能力，进行了 水迷宫试验（MWM ）和 新物体识别试验（NOR ）测试。
在 MWM 测试中，在初始训练阶段，逃逸潜伏期随着重复训练而减少（图 1E）。与四个不同组相关的逃逸潜伏期数据符合 Mauchly 球度检验 （P> 0.05）。进行双向重复测量方差分析，表明日×组存在显著的主效应 （F(12, 112)= 2.748，P< 0.01），没有任何显著的交互作用。与 2 周组相比，0 周队列中的受试者在连续 5 天的跨度内表现出更长的逃逸潜伏期（第 1 天，P < 0.01;第 2 天，P < 0.001;第 3 天，P < 0.001;第 4 天，P < 0.01;第 5 天，P < 0.05;图 1E）。四组之间的游泳速度没有明显的统计差异（图 1F）。Levene 检验的结果表明，有关寻找隐藏平台的路径的相关数据表现出方差同质性 （P> 0.05）。与 0 周组相比，上述指数在 1 周、2 周和 4 周组中表现出显着改善（平台交叉：P<0.001，图 1D）。
在 NOR 测试中（图 1G），每组中的小鼠在熟悉阶段识别同一物体方面没有差异（P>0.05，图 1H）。两项测试分别距离熟悉期 2 小时和 24 小时，单因素方差分析显示四组之间的辨别指数（图 1I-J）存在统计学显着差异（2 h：F(3,28)=7.875 <0.01;24 小时：F(3,28)=12.208 P<0.001）。2 周和 4 周组的辨别指数高于 0 周组 （2 h：2 周：P<0.01;4 周 P<0.01;24 小时：2 周：P<0.01;4 周 P<0.001）。
间歇性禁食改善老年小鼠 PP-DG 通路突触可塑性缺陷
研究记录并量化了从穿质通路( PP) 到海马齿状回回路(DG) 的长时程增强作用( LTP)（图 2A）。突触可塑性在学习和记忆的细胞机制中起着至关重要的作用。记录基线 fEPSP 后，评估 LTP。所有四组 TBS 治疗后 fEPSP 的斜率均增加 （图 2B）。Levene 检验显示 4 组 LTP 数据具有方差同质性 （P>0.05）。利用单因素方差分析的统计分析揭示了 IF 对 fEPSP 斜率 （F(3,20)=13.197 P<0.001）。值得注意的是，Bonferroni 的事后分析显示，与 2 周和 4 周组相比，0 周组的平均 fEPSP 倾斜度显着受损（图 2C，p<0.01）。
图 2.A：从 PP 到 DG 的基线 fEPSP 和 LTP。B：TBS 治疗后基于基线的 fEPSP 的斜率。C：基于基线的 fEPSP 斜率统计图表。* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001.
间歇性禁食增加了老年小鼠海马体中突触相关蛋白的表达
研究者研究了与突触可塑性和认知表现显着相关的突触相关蛋白的表达模式。Western Blot 用于量化海马体中 NR2B （N-甲基-D-天冬氨酸受体 2B） 、PSD95 （突触后致密蛋白 95，一种突触后支架蛋白） 和 SYP （突触前素，一种必需的突触前囊泡膜蛋白） 的表达（图 3A）。单因素方差分析显示，上述蛋白水平在 4 组间存在统计学差异（NR2B、F(3, 20)= 4.543，P < 0.05;PSD95、F(3, 20)= 26.588，P < 0.001;SYP、F(3, 20)= 7.735，P < 0.01）。与 0 周组相比，2 周和 4 周组的 NR2B 、 PSD95 和 SYP 显著增加 （2 周：NR2B，P < 0.05;PSD95，P < 0.001;SYP，P < 0.01;4 周：NR2B，P < 0.01;PSD95，P < 0.001;SYP，P < 0.01;图 3B-D）。
图 3.A：老年小鼠海马中 NR2b 、 PSD95 、 SYP 、 TNF-α 、 IL-1β 和 β-微管蛋白的 Western 印迹图像。B：NR2b 的 Western blot 定量分析。C：PSD95 的 Western blot 定量分析。D：SYP 的 Western blot 定量分析。E：TNF-α 的 Western blot 定量分析。F：IL-1β 的 Western blot 定量分析。* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001.
间歇性禁食降低了老年小鼠的神经炎症反应
此外，研究者通过 WB 实验测量了海马体中炎性细胞因子的表达，以研究潜在的机制（图 3A）。单因素方差分析显示，4 组 TNF-α 和 IL-1β 表达差异有统计学意义 （TNF-α、F(3, 20)= 16.540，P < 0.001;IL-1β，F(3, 20)= 17.634，P < 0.001）。2 周和 4 周组海马中 TNF-α 和 IL-1β 的表达低于 0 周组 （2 周：TNF-α，P < 0.05;IL-1β，P < 0.01;4 周：TNF-α，P < 0.001;IL-1β，P < 0.001;图 3E-F）
小胶质细胞是促炎细胞因子的主要生产者，在神经炎症反应的放大中起着关键作用。Iba-1 是小胶质细胞的一种独特标志物，已知在炎症存在时会增加。为了评估海马 DG 区域中 Iba1 的表达，采用了使用 Iba1 特异性抗体的免疫荧光分析（图 4A）。单因素方差分析显示，4 组间荧光强度存在统计学差异 （F(3, 8)= 81.419，P < 0.001）。2 周和 4 周组荧光强度低于 0 周组 （2 周：P < 0.001;4 周：P < 0.001;图 4B），表明 IF 有效改善了七氟烷麻醉和手术诱导的小胶质细胞过度激活。
图 4.A：老年小鼠海马 DG 区 Iba-1 的免疫荧光染色。bar=50μm。DAPI：核;IBA1：小胶质细胞。B：Iba-1 的荧光密度统计。* P<0.05，** P<0.01，*** P<0.001.
讨论
目前的研究中评估了 IF 在老年雄性小鼠吸入七氟烷时抑制神经炎症和缓解腹部手术后认知障碍的潜力。本研究观察结果表明，IF 导致 TNF-α 和 IL-1β 水平降低，同时提高海马区突触相关蛋白如突触素、PSD-95 和 NMDAR2b 的表达。
七氟烷是一种挥发性麻醉剂，广泛用于临床手术中的麻醉维持，尤其是老年患者。然而，最近的研究强调了七氟烷可能引发术后认知功能障碍，此类不良反应的严重程度取决于各种因素，例如浓度、持续时间和麻醉剂暴露频率。其主要特征是学习和记忆力下降，以及注意力、执行力和语言技能下降。Xu 等人进行的一项研究表明，暴露于最低肺泡浓度 （MAC） 为 1 的老年大鼠在第 1 天出现空间记忆障碍，而暴露于 1.5 MAC 会导致第 1、3 和 7 天出现记忆缺陷。这些发现表明七氟烷的浓度与认知障碍的程度之间存在正相关。
研究表明，外科手术和麻醉给药与短暂性和永久性认知障碍有关。此外，已经确定神经炎症在手术后认知功能障碍的发展中起着至关重要的作用。神经炎症已被确定为许多神经退行性和认知障碍的关键因素，包括 POCD。全身性炎症对大脑的影响可能是深远的。越来越多的证据表明，血源性因素和促炎系统环境对中枢神经系统功能有负面影响，对正常衰老过程中突触可塑性和认知功能有直接影响。已发现吸入七氟烷通过引发大鼠成熟海马中 NF-κB 信号级联的激活来增加细胞因子（即 IL-1β、IL-6 和 TNF-α）的分泌。IL-1β 和 TNF-α 是慢性疾病（包括但不限于 AD）中大脑内炎症状态的主要驱动因素。此外，认知功能障碍与人类和动物模型中 IL-1β 和 TNF-α 的存在有关，该领域非凡的研究证明了这一点。
禁食行为有可能刺激海马和内嗅皮层神经元中的 cAMP 反应元件结合信号通路，这些神经元是突触功能和记忆形成不可或缺的一部分。IF 已被证明可以通过钙信号传导增强海马体的可塑性并改善线粒体功能。Liu 等人发现 IF 可以通过肠脑轴影响肠道代谢物并改善认知障碍，这可能与 IF 治疗改善 OXPHOS 中能量代谢相关基因的表达有关。这种饮食方法也被证明可以改善学习和巩固过程，以及部分逆转啮齿动物运动协调和记忆功能与年龄相关的缺陷。对于患有轻度认知障碍的老年人，常规 IF 有效改善了认知功能并显示出更高的认知评分。IF 可以提高认知能力，同时保持阿尔茨海默病的病理水平，从而表明 IF 可以增强对病理和神经元损伤的恢复力。此外，IF 对海马区域内新生神经元的增殖和活力表现出增强作用。这一发现强调了 IF 在促进神经发生和神经元存活方面的潜在作用。先前的研究表明，IF 导致动物模型和人类群体中循环促炎细胞因子（即 IL-1β 和 TNF-α）的存在减少。尽管文献证据有限，但接受术后 IF 的大鼠有效显示神经炎症和氧化应激减少，认知功能改善。以上所有证据都为 IF 改善老年人 POCD 提供了强有力的基础，无论是在术前还是术后实施。
突触丢失现象代表了认知障碍的关键事件。该蛋白 SYP 主要位于容纳突触小泡的神经末梢内。通过评估 SYP 表达水平，可以得出突触的数量并近似神经末梢的密度。PSD-95 是一种位于突触后膜上的细胞骨架蛋白，是信息传输和记忆巩固的重要枢纽。它的主要责任在于维护突触连接的完整性和结构。因此，SYP 和 PSD-95 作为海马突触可塑性的识别指标具有重要价值。在目前的研究中，通过 Western blot 分析评估 SYP 和 PSD-95 的表达。结果表明，与随意饮食组相比，IF 组表现出 SYP 和 PSD-95 表达增加。同样，随着 IF 持续时间的延长，突触蛋白恢复的速率也随之升高。这一发现强调了禁食的时间维度与突触年轻化过程之间错综复杂的相互作用，这对认知功能和神经保护具有重要意义。
N-甲基-D-天冬氨酸受体 （NMDAR） 是大脑中的关键受体，在神经元网络的重塑中起着重要作用。例如，PSD-95 能够与突触前和突触后区域的粘附分子相互作用，从而促进新突触连接的建立和现有突触连接的维持。这个过程用于调节神经元之间的信息传递，这是由 NMDAR 介导的。实证调查表明，NMDAR 与突触增强、知识获取、信息保留和神经可塑性表现出显着相关性。在这项研究中，通过采用 western blot 分析来检测 NMDAR2b 的表达。研究结果显示，与随意饮食组相比，IF 组表现出更高程度的 NMDAR2b 表达。这些结果有助于阐明 IF 在接受麻醉和手术条件时对小鼠的突触可塑性有积极影响的事实。此外，已确定为期两周的 IF 足以保护小鼠免受突触丢失。
海马体构成了巩固和检索记忆的关键神经网络。然而，该区域的完整性可能会受到各种因素的损害，包括传染病、脑部疾病和自然衰老过程。这些因素会触发炎症反应，并最终破坏海马依赖性记忆表现。LTP 构成了一种重要的突触机制，其特征是通过简洁的传入活动模式实现突触传递的迅速且极其持久的增强。这种现象在神经科学领域得到了广泛的研究和记录，强调了它在人脑错综复杂的功能中的关键作用。多项研究提供的证据表明，IL-1β 对海马体内的 LTP 具有抑制作用。同样，TNF-α 抑制来自小鼠标本的海马切片中的 LTP。在这项调查中，研究者观察到小鼠海马体内 LTP 的改变。结果表明，麻醉和手术对海马 LTP 有显着的抑制作用，这可能归因于 IL-1β 表达的上调。此外，一周的 IF 可以改善海马 LTP。然而，2 周和 4 周 IF 组之间 LTP 的差异没有统计学意义。本研究提供了麻醉、手术和 IF 对小鼠海马 LTP 影响的证据。
本研究深入研究了 IF 对麻醉和手术诱导的认知功能障碍的改善作用。研究结果表明，与随意喂食的组相比，暴露于两周 IF 饮食并在七氟烷吸入麻醉下接受腹部手术的大鼠表现出神经炎症减少。在本研究中，使用 NOR 和 MWM 作为评估方法来评估小鼠的认知能力。研究结果表明，与接受自由饮食的小鼠相比，接受一周 IF 饮食的小鼠表现出增强的空间学习和记忆能力。此外，随着 IF 持续时间的延长，有益影响会相应升级。本研究的结果提供了证据，证明 IF 通过抑制神经炎症过程增强了七氟烷麻醉和手术后老年小鼠的认知能力。
然而本实验中仍然存在一些不足。首先，研究参考了已发表的文献进行建模，没有建立非手术组。其次，每组小鼠数量少，行为测试每组只有 8 只。第三，虽然研究证实术前 IF （≥2 周） 可以改善七氟烷手术诱导的 POCD，但老年人是否可以用 IF 治疗一段时间来预防 POCD 尚无定论。
结论
总而言之，14 天的 IF 已被证明可有效降低 TNF-α 和 IL-1β 的表达。同时，在七氟烷麻醉和手术条件下，它增加小鼠海马体内各种突触相关蛋白的表达，包括 SYP、PSD-95 和 NMDAR2b。术前 IF 的实施可能被证明是通过抑制神经炎症和改善接受七氟烷麻醉的老年患者的突触可塑性来减轻 POCD 的可行策略。
