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在等温扩增结合CRISPR的一锅法核酸检测中，Cas酶反应过程干扰扩增过程，影响检测灵敏度和检测效率，怎么办？不怕，研究人员有办法！大家随小编一起来看看研究人员是怎么解决问题的吧~
在传染病防控中，灵敏、快速、直接和具有成本效益的POCT检测方法是控制疾病传播的一个必要因素。抗原检测法因其快速、成本低等优势已广泛家用，但其存在假阳性较高的缺陷。相比之下，等温扩增，如重组酶聚合酶扩增（RPA）法和环介导等温扩增（LAMP）法等，具有更高的灵敏度。等温扩增结合Cas12或Cas13的反式切割活性，可显著提高检测灵敏度，但该法检测过程步骤较多，延长了反应时间。一锅法等温扩增CRISPR检测操作简单，但在一锅法检测体系中，Cas12和Cas13酶影响了靶标序列的扩增过程，导致一锅检测的灵敏度和速度降低。为解决这一问题，武汉大学医学研究院殷昊课题组分析了Cas12b和cas13a介导的一锅法检测性能的限速因素，即在一锅法检测中，Cas12b通过结合和切割扩增子来干扰环介导的等温扩增，而Cas13a则通过直接降解病毒RNA模板来干扰其扩增过程。研究团队通过对Cas12b蛋白的PAM作用结构域进行改造，改进了基于Cas12b的一锅法检测效能，灵敏度提高了10-100000倍。同时，研究团队通过减少Cas13a对病毒RNA的干扰，优化基于Cas13a的一锅检测方法，可实现30 min，灵敏度低至0.5 cp/μL的临床样本准确检测。该研究论文“Fast and sensitive CRISPR detection by minimized interference of target amplification”发表在Nature Chemical Biology期刊上。
研究团队在之前的研究中发现在一锅法检测中，Cas12a的反应过程可能会干扰等温扩增，并通过选择次优PAM对Cas12a的反应动力学进行调整，大大提高了检测灵敏度和重现性。但经测试，该法不适用于Cas12b一锅法检测系统。因此，研究团队进一步分析了Cas12b蛋白与PAM相互作用的结构域，并选择与PAM区形成氢键的氨基酸，将其突变为丙氨酸（图1b），以达到调整Cas12b反应动力学的目的，进而平衡一锅法检测中的扩增过程与Cas12b反应过程（图1a）。在高于野生型（WT）荧光信号的单点突变中，G478A单突变信号最为显著，团队还对Cas12b进行了双突变，G478A/K396A双突变（Cas12-2M）显示出了最强的荧光信号（图1c,d）。
研究团队随后在LAMP介导的一锅法检测中使用不同的间隔区评估Cas12-2M的检测性能。在三个间隔区的测试中，与WT相比，Cas12b-2M均显示出加速的动力学（图1e-g），使得检测灵敏度提高了10-10000倍，同时显著提高了信噪比（图1h-j）。
为进一步探究Cas12-2M改进一锅法检测的作用机制，研究团队对Cas12b-WT和Cas12b-2M的底物裂解活性进行了比较，并设计了dead Cas12b-WT和dead Cas12b-2M作为对照。Cas12b孵育1 min后，通过qPCR对未裂解的底物进行定量分析。在孵育1分钟的时间内，Cas12b-2M处理样品中未裂解产物的数量是Cas12b-WT处理样品的7.4~44.4倍，结果表明Cas12b-2M对等温扩增初始步骤的干扰降低（图2a-d）。此外，研究团队还对一锅法测试中产生的扩增子进行了量化。与单独的LAMP相比，加入Cas12b-2M体系的扩增子数量平均减少了6.8倍，而加入Cas12b-WT体系的扩增子数量则显著减少（图2e-h）。结果表明，Cas12b-2M显著减少了对LAMP过程的干扰。
为了进一步提高一锅检测的效率，团队筛选了几种在LAMP反应中使用的商业Bst DNA聚合酶。Cas12b-2M结合优选的聚合酶，实现了15 min内对pseudo-SARS-CoV-2 RNA的检测，检测限（LOD）低至0.5 cp/μL。在对SARS-CoV-2临床样本的检测中，Cas12b-2M可以检测出所有85个阳性样本，灵敏度均为100%（图2i，j）。相比之下，Cas12b-WT的灵敏度为77.6%，检出66个阳性样本（图2i，j）。数据表明Cas12b-2M在一锅法检测中优于Cas12b-WT。
前人报道了一种结合RPA和LwaCas13a的SARS-CoV-2一锅检测法，SHINE。SHINE通过使用RPA反向引物将病毒RNA逆转录为互补DNA（cDNA），然后使用包含T7启动子序列的正向引物进行cDNA扩增（图3a）。扩增后的DNA在体外转录成RNA，随后被LwaCas13a识别，触发其反式裂解活性。报道中SHINE对鼻咽拭子样本的检测灵敏度在100-1000 cp/μL之间，(37°C，40 min）。团队发现体外转录（IVT）过程中合成的RNA与SHINE中的病毒RNA具有相同的序列（图3a），因此推断病毒RNA也可以被Cas13a识别和切割，干扰序列扩增过程。团队发现在一锅法测试中，Cas13a介导的切割严重损害了逆转录和RPA过程（图3b，c）。为了减少对扩增的干扰，同时保持Cas13a的反式切割活性，研究团队开发了一种新方法（REVERSE）。
在REVERSE中，使用短引物将病毒RNA逆转录为cDNA。随后，使用包含T7启动子序列的反向引物进行扩增。这使得以DNA扩增子为模板转录出的RNA与病毒RNA反向互补，从而为Cas13a介导的切割提供了序列特异性（图3a）。实验表明，在REVERSE中，扩增子在5分钟内变得明显，随后不断积累，而SHINE中的扩增子在10分钟时才可观察到，且随着时间的推移扩增子含量始终较低（图3b）。当在单管中混合逆转录反应和Cas13a，并使用qPCR追踪cDNA的丰度，REVERSE组的cDNA数量与无crRNA对照组相当，比SHINE高出约十倍（图3c）。这些数据表明Cas13a不会干扰REVERSE中底物的逆转录。
研究团队比较了REVERSE和SHINE对SARS-CoV-2的检测性能。REVERSE比SHINE检测早10 min达到最大荧光值，且其最大荧光值比SHINE高2.5倍（图3d）。研究团队还比较了REVERSE和SHINE的LOD，结果表明REVERSE能够一致地检测来自IVT的1 cp/μL RNA样本，其灵敏度比SHINE高100-1000倍（图3e）。在对SARS-CoV-2临床样本检测中，REVERSE检出了所有17份SARS-CoV-2 RNA样本，尤其是相对较高的Ct值（29.1~35.9）的RNA样本（图3f）。
基于CRISPR的检测温度通常在37-60°C范围内，而基于抗原的检测则可在室温下进行（16-19°C）。尽管基于CRISPR的一锅检测速度快、灵敏度高，但加热装置提高了使用成本，阻碍了其推广应用。为评估在较低温度下REVERSE的可行性，研究团队在23~37°C对REVERSE进行了测试。23°C，45 min内，在蓝光下可检出pseudo-SARS-CoV-2 RNA（图4a）。随后，为实现室温30 min内检测病毒RNA的目标，研究团队优化了引物组和6U-FQ的浓度（图4b，c），并实现了在20°C下30 min内的有效检测（图4d）。优化后的REVERSE，命名为REVERSE-2。
图4 REVERSE-2室温检测核酸
研究团队评估了REVERSE-2在20°C下检测临床SARS-CoV-2样本的性能，包括87份SARS-CoV-2阳性鼻咽拭子样本（Ct值为22.2~37.6），以及20份阴性样本。结果显示，REVERSE-2的检测灵敏度为98.9%，检测特异性为100%，在室温下30 min内能够检出Ct值为37.6（0.5 cp/μL）的SARS-CoV-2样本（图4e-i）。检测信号可以通过蓝光或智能手机上的相机读出，这凸显了REVERSE-2的家用性能（图4e，f）。
针对等温扩增结合CRISPR一锅法核酸检测中，Cas12和Cas13酶对靶标序列扩增过程的干扰问题，研究团队通过对Cas12b蛋白的PAM作用结构域进行改造，改进了基于Cas12b的一锅法检测效能，灵敏度提高了10-100000倍。同时，研究团队通过减少Cas13a对病毒RNA的干扰，优化了基于Cas13a的一锅检测方法（REVERSE-2），可实现室温30 min，灵敏度低至0.5 cp/μL的临床样本准确检测。这两种方法，因其反应条件宽松及性能的显著改进，在病原体检测应用中显示出极大的竞争力。
参考文献：
[1] Tong X, Zhang K, Han Y, Li T, Duan M, Ji R, Wang X, Zhou X, Zhang Y, Yin H. Fast and sensitive CRISPR detection by minimized interference of target amplification. Nat Chem Biol. 2024 Jul;20(7):885-893. doi: 10.1038/s41589-023-01534-9. Epub 2024 Feb 8. PMID: 38332130.
