文章信息
低碳合成气生物转化及产乙醇发酵工艺探索
方崇1,2，刘云云1，徐惠娟2，周雨2,3，邱雨心1，巨苗苗1
1陕西科技大学机电工程学院，陕西 西安 710016；2中国科学院广州能源研究所，中国科学院可再生能源重点实验室，广东 广州 510640；3汕头大学海洋生物研究所，广东 汕头 510632
引用本文
方崇, 刘云云, 徐惠娟, 等. 低碳合成气生物转化及产乙醇发酵工艺探索[J]. 化工进展, 2024, 43(11): 6111-6118.
DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2023-1815
摘要
在碳中和大目标下，生物质气化合成气（主要成分为CO、CO2和H2）的资源化利用受到广泛关注，将合成气转化为燃料乙醇具有碳减排和能源生产的双重功效。针对化学催化转化过程存在合成气不能被完全利用的问题，采用生物法对其尾气（低碳合成气）进行进一步利用, 以提高合成气的利用率。本文从气体底物、发酵工艺等方面对乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）发酵产乙醇过程进行了研究。结果表明：在合成气发酵中，菌株会优先利用CO，之后再利用CO2和H2，CO和H2消耗的比值为0.99±0.12，产物中乙醇与乙酸的摩尔比为0.78±0.10；以100% CO为底物时，CO消耗与CO2生成的比值为1.72±0.21，乙醇与乙酸的摩尔比为1.00±0.11。木糖-合成气共发酵时菌株对木糖的利用比较缓慢，与合成气发酵相比，菌体浓度较高，但乙醇浓度较低。培养基中添加乙酸钠浓度为4g/L时对菌株活性没有影响，高浓度（≥12g/L）则对菌株生长产生明显的抑制作用。3L搅拌罐式反应器的发酵实验显示，当发酵过程出现“酸崩溃”时，菌株的产乙醇代谢受到抑制，导致乙醇产量低；在菌株对数生长后期降低发酵温度可有效避免“酸崩溃”，发酵得到的最高乙醇浓度为3.46g/L，最高乙醇与乙酸的摩尔比达到2.01，最大乙醇产率达到0.35g/(L∙d)。上述研究结果可为Clostridium autoethanogenum发酵产乙醇过程工艺优化提供参考。
生物乙醇被世界公认为是一种绿色清洁燃料。传统生物乙醇以淀粉和糖作为原料进行生产，该技术被称为第一代生物乙醇技术。以木质纤维素类生物质为原料生产乙醇的技术称为第二代生物乙醇技术。木质纤维素原料含有木质素，木质素是由苯丙烷异构组成的交联三维聚合物，其与纤维素和半纤维素紧密结合，大大阻碍了将纤维素和半纤维素转变为可发酵糖的水解反应。木质纤维素类生物质热解气化制得合成气，再将合成气转化为生物乙醇的技术可克服木质素阻碍。气化得到的合成气主要成分是H2、CO和CO2，由于原料组成和气化工艺的不同可能存在H2O以及部分烷烃。合成气可通过两种方法转化为生物乙醇：化学催化法和生物发酵法。化学催化法通过金属催化剂的作用转化合成气生成柴油、甲醇、乙醇以及碳氢化合物等副产物，该工艺要求较高的温度和压力（200~350℃，20~300bar，1bar=105Pa），催化剂对H2与CO的摩尔比要求严格，而且容易受气体杂质影响而失活。此外，化学催化法反应不够完全，仍有一定浓度的CO、CO2、H2等作为尾气排出。生物发酵法则是利用微生物将合成气转化为乙醇、乙酸、丁醇等产物。该工艺的反应条件温和（常温常压），微生物可以耐受较高浓度的H2S、COS等杂质，具备较高的气体转化效率和乙醇选择性，与化学催化法相比分离成本更低。如果能将化学催化法产生的尾气进一步用生物发酵法转化，实现合成气的充分利用，将能有效提高气体转化效率和产物得率。
合成气发酵过程所用微生物主要为厌氧的产乙酸菌，如热醋酸梭菌（Clostridium thermoaceticum）、甲酸梭菌（Clostridium formicoaceticum）、伍氏醋酸杆菌（Acetobacterium woodii）、杨氏梭菌（Clostridium ljungdahlii）及乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum）等。Clostridium autoethanogenum为革兰氏阳性细菌，可以利用木糖、丙酮酸、阿拉伯糖、果糖、鼠李糖和L-谷氨酸进行异养生长，也可在以CO、H2和CO2为主要组分的合成气中进行自养生长，自养过程主要通过Wood-Ljungdahl途径将合成气转化为乙酸、乙醇等产物，式(1)~式(4)为CO、H2 CO2转化为乙醇或乙酸的化学反应式。
在Wood-Ljungdahl途径中，Clostridium autoethanogenum利用CO或CO2 H2作为底物合成乙酰辅酶A，乙酰辅酶A是菌体和代谢产物的前体。乙酰辅酶A转化为乙酸会生成ATP，转化乙醇过程中没有ATP产生，即乙酸是生长偶联型产物，乙醇是非生长偶联型产物，因而菌株的主要代谢产物为乙酸。为了提高乙醇产量，Xie等对不同发酵条件下的基因表达以及乙醇产量进行监测，发现醛:铁氧还蛋白氧化还原酶（aldehyde:ferredoxin oxidoreductase，AOR）在乙醇形成中较为关键，且AOR的转录可被外源酸（乙酸或盐酸）诱导。Schulz等在连续发酵后期持续补充含15mmol/L乙酸钠的培养基用于培养Clostridium ljungdahlii。结果表明，与未补充乙酸钠的对照实验相比，添加乙酸钠后Clostridium ljungdahlii的乙醇产率提高了2倍以上。本论文考察了气体底物、乙酸钠以及发酵工艺等因素对Clostridium autoethogenum发酵产物的影响，旨在探索低碳合成气发酵过程中提升乙醇产量的工艺和方法。
1
材料和方法
1.1
实验材料
1.1.1 菌株
本实验所用菌株为Clostridium autoethanogenum DSM 10061，德国菌种保藏中心（DSMZ，Braunschweig，Germany），由本实验室驯化后保存。
1.1.2 培养基
发酵培养基（1L）组分基于DSMZ640培养基和Rajagopalan培养基的组分进行了优化，具体成分如下：10mL无机盐溶液，10mL微量元素溶液，10mL维生素溶液，1.0g酵母膏，0.5g半胱氨酸盐酸，5.0g吗啉代乙磺酸，1.0mL 0.5%刃天青溶液，pH为6。无机盐、维生素、微量元素溶液组分参见文献。培养基在121℃灭菌20min后放置于厌氧箱（DWS A35，英国）中降温，直至指示剂显示无氧后加塞加盖密封。
生长培养基（1L）：在上述发酵培养基中加入2.5g木糖，pH为6。
1.2
实验方法
1.2.1 人工模拟合成气/CO发酵实验
实验在1L铝箔气体采样袋（德霖，中国大连）中进行，取样及接种操作均在厌氧箱中完成。10%（体积分数）接种Clostridium autoethanogenum至50mL发酵培养基，取样检测各组分浓度及OD600，接种后的菌液转移至预充了合成气（10.25% CO2，46.59% H2，22.58% CO，14.74% CH4，3.65% C2H6，1.41% C3H8，0.78% C4H10）或100% CO的气袋内，测量初始气袋体积，之后置于37℃恒温培养箱中进行发酵实验，发酵结束后测量气袋体积并取样分析液相产物浓度以及气相组分含量。每个样品设置三个平行。
1.2.2 木糖-合成气共发酵实验
实验在100mL钳口血清瓶（Sigma，德国）中进行，取样及接种在厌氧箱中完成。按2%（体积分数）接种Clostridium autoethanogenum至血清瓶中，瓶中分别含25mL发酵培养基（对照组）和25mL生长培养基（实验组），瓶内充混合气，压力为0.15MPa。充气完成后置于30℃摇床中震荡培养，转速150r/min，每个样品设置两个平行。定时取样检测样品产物浓度及OD600，并置换新的合成气。
1.2.3 乙酸钠实验
实验在75mL厌氧瓶中进行，瓶中含生长培养基25mL，向培养基中加入乙酸钠，使其浓度分别为4g/L、12g/L和16g/L，以未添加乙酸钠的培养基作为对照。2%（体积分数）接种Clostridium autoethanogenum至上述培养基中，37℃静置培养，每隔24h取样检测OD600及产物浓度。每个样品设置两个平行。
1.2.4 3L反应器实验
反应装置为3L玻璃反应器（BIOTECH，上海保兴生物设备有限公司）。于反应器中配制2.5L发酵培养基，121℃灭菌20min，然后通氮气除氧，并降温至37℃。将生长至对数期的Clostridium autoethanogenum接种至反应器中，接种率12%（体积分数），切换氮气为人工模拟合成气（24% CO，11% CO2，50% H2，15% CH4）进行通气培养，搅拌转速300r/min，气体流量20mL/min，罐压0.03MPa，培养温度37℃，每隔24h取样检测OD600、产物浓度及出口CO含量。
1.3
分析方法
1.3.1 产物分析和菌浓测定
发酵液中的乙酸、乙醇、木糖浓度采用HPLC Waters 2695液相色谱仪检测，色谱柱为Shodex sugar SH1011，以0.005mol/L H2SO4为流动相，流量0.5mL/min，柱温50℃，使用示差折光检测器，检测器温度为50℃。发酵液经离心（10000r/min，4min）并以0.22μm滤膜过滤。发酵液菌体浓度采用酶标仪（Biotek Eon，美国）检测，检测菌液在波长为600nm下的OD值，根据OD600-菌体干重曲线计算得到菌体干重。
1.3.2 气体组分含量分析
气体采样袋中气体含量采用Agilent 7890A气相色谱仪进行检测，柱子为Agilent 5A分子筛柱和Agilent Hayesep Q 柱，检测器采用FID检测器及TCD检测器，FID检测器300℃，TCD检测器200℃。载气为Ar，分流比为20∶1，柱流量为3mL/min，柱子在60℃保持2.5min，之后以15℃/min升到180℃。反应器出口尾气中CO含量采用泵吸式CO检测仪（JA-1000-CO，震殷生物科技有限公司）进行检测。
气袋体积用自制的装置进行测量。各气体组分的消耗/生成以体积（mL）来计量，计算方法如式(5)所示。
式中，c1为发酵初始气体组分体积分数，%；V1为发酵初始的气体总体积，mL；c2为发酵结束后气体组分体积分数，%；V2为发酵后的气体总体积，mL。
2
结果与讨论
2.1
人工模拟合成气/CO发酵
在Clostridium autoethanogenum代谢合成气的过程中，CO可在CO脱氢酶（carbon monoxide dehydrogenase，CODH）催化下氧化生成CO2，同时产生电子用于后续产物的合成，如果底物中仅存在H2和CO2，则H2可提供电子用于还原CO2。本实验分别考察了以100% CO或人工模拟合成气为底物时Clostridium autoethanogenum的发酵结果（图1和表1），其中人工模拟合成气成分基于合作单位的实验结果而确定，与合成气化学法制混合醇中试试验的尾气成分一致。如图1(a)所示，发酵后合成气中的CO气体已经耗尽，CO2含量升高，H2含量减少；底物为100% CO时，发酵结束时CO也几乎耗尽，上层气相测得的气体主要是CO2（＞98%）以及微量的H2。图1(b)显示，在合成气或CO发酵中，乙酸仍是最主要的产物，其浓度高于乙醇浓度；以100% CO为底物，发酵产物乙酸、乙醇的浓度以及菌体干重均高于合成气发酵，这是因为合成气中CO含量只有22.58%。如表1所示，100% CO发酵与合成气发酵相比较，前者消耗的CO约为后者的5倍，但是得到的产物浓度及菌体干重仅为后者的2~3倍，因此推测合成气发酵过程中菌株不仅利用CO，也利用CO2和H2，发酵前后H2的消耗证实了这一点。研究指出浓度为7nmol/L的CO即可抑制50%的氢化酶活性，因此合成气发酵中菌株对CO的利用会优先于CO2和H2。基于式(1)~式(4)，可以得到化学计量式式(6)和式(7)。以100% CO为底物，消耗的CO与生成的CO2之间的比值（ΔCO/ΔCO2）为1.72±0.21，乙醇与乙酸的摩尔比为1.00±0.11；以合成气为底物，消耗的CO和H2的比值（ΔCO/ΔH2）为0.99±0.12，乙醇与乙酸的摩尔比为0.78±0.10，上述结果与式(6)、式(7)的理论值非常接近。
图1 合成气与CO发酵
表1 合成气/CO发酵结果
如表1所示，CO发酵得到的乙醇与乙酸的摩尔比高于合成气发酵的结果。Hurst等以CO与CO2的混合气体作为底物进行Clostridium carboxidivorans P7发酵，发现增加CO分压会使得产物中乙酸含量降低，乙醇含量升高。当CO含量较高时，CODH会催化CO氧化来防止CO的毒害，该反应可得到还原型铁氧化蛋白（reduced ferredoxin，Fdred），Fdred通过膜结合的Rnf复合物将电子传递给NAD+得到NADH，同时产生跨膜质子浓度梯度可促进ATP合成。乙醇是一种还原性代谢产物，其合成过程需要NADH提供电子，NADH氧化后得到的NAD+进入下一轮电子传递过程。由能量平衡分析可知，每摩尔CO氧化可为Wood Ljungdahl途径（又称还原性乙酰辅酶A途径，简称WL途径）提供0.77mol Fdred、0.49mol NAD+及0.02mol NADPH，每摩尔H2氧化可提供0.44mol Fdred、0.43mol NAD+和0.008mol NADPH。显然以CO为电子供体时产生的NADH及ATP较H2为电子供体时更多，因而高浓度的CO更有利于乙醇的合成。
2.2
木糖-合成气共发酵
Clostridium autoethanogenum通过WL途径将CO2转化为乙酰辅酶A的自养过程中消耗1mol ATP，乙酰辅酶A经底物水平磷酸化生成1mol ATP和乙酸，整个过程的净ATP为零，由乙酰辅酶A转化为乙醛进一步还原为乙醇的过程不产生ATP，过程净ATP为负值。糖异养过程可以产生额外ATP，且产生的CO2可被利用，因此考虑将自养和异养过程相结合，基于此开展了木糖-合成气共发酵的研究。结果如图2所示，与木糖发酵相比较，木糖-合成气共发酵时木糖的消耗速率降低，乙酸、乙醇浓度及菌体干重均有所升高，可能是因为菌株在利用木糖的过程中同时利用合成气。与仅以合成气为底物的对照组相比，木糖-合成气共发酵得到的菌体浓度更高，但是菌体生长速率和乙酸、乙醇浓度却较低。Mann等在反应器中分别进行了木糖-CO两步法发酵以及木糖-CO共发酵实验，发现木糖-CO共发酵得到的Clostridium autoethanogenum菌体干重高于木糖-CO两步法发酵；Abubackar等在Clostridium autoethanogenum的木糖-CO共发酵实验中发现木糖和CO同时被利用，但木糖直至12d左右才被耗尽。这些现象与本实验中观察到的现象一致。
图2 木糖-合成气共发酵与合成气发酵的比较
2.3
添加乙酸钠对Clostridium autoethanogenum生长的影响
本实验考察了不同乙酸钠浓度对菌株生长的影响，结果如图3所示。由图3(a)可以看出，培养基中添加4g/L、12g/L、16g/L乙酸钠后，测得初始乙酸浓度分别为2.56g/L、7.85g/L、9.85g/L。随着培养时间增加，所有样品的乙酸含量均呈上升趋势，且乙酸增长速率随着乙酸钠浓度的增加而减小。其中，添加4g/L乙酸钠时，乙酸增长速率、木糖利用速率以及菌体浓度的增长速率均与对照一致，说明该添加量对菌株生长几乎没有影响。但是乙酸钠浓度为12g/L和16g/L时，木糖利用速率明显降低，得到的菌体浓度也急剧下降，分别为对照组的1/2和1/4，由上述结果可知随着培养基中乙酸钠浓度的增加，菌株生长受到一定程度的抑制。Mann的研究指出乙酸浓度为15g/L时不会对Clostridium autoethanogenum生长产生抑制，因此乙酸浓度可能不是抑制菌株生长的原因。乙酸钠属于强碱弱酸盐，水溶液呈碱性，添加4g/L、12g/L、16g/L乙酸钠后测得培养基pH分别为6.06、6.20和6.25，后两个培养基的pH已经偏离Clostridium autoethanogenum生长的最适pH范围，因而产生了抑制。
图3 乙酸钠对生长的影响
2.4
3L反应器发酵实验
图4为3L反应器的发酵实验结果，实验中用到的气体底物均为合成气。图4(a)的发酵实验在第15d时补加了2g/L乙酸钠，如图4(a)所示，在发酵初期菌株生长有延滞，各产物浓度及pH几乎不变，出口CO含量保持在较高水平；4d后菌株进入产酸期，乙酸及菌体浓度快速增长，pH迅速降低，同时出口CO含量下降；9d后各产物及pH趋于稳定，第11d将进口气体流量调低至10mL/min，出口CO含量随之下降，但之后又逐步上升，说明菌株对CO的利用在逐渐减少。第15d加入2g/L乙酸钠后，pH由4.5上升至4.8，但继续培养发现菌体浓度以及乙醇含量都没有明显变化，而出口CO含量持续上升，最终的乙醇浓度只有0.53g/L。有文献报道添加外源乙酸可以促进乙醇生成，但是上述发酵实验显示，发酵后期加入乙酸钠后，发酵液中乙酸含量增加，却没有促进乙醇的生成，分析原因，可能是因为产生了“酸崩溃”现象。“酸崩溃”是由于有机酸的快速积累导致梭菌溶剂生成提前终止，使得最终的溶剂产量偏低。Maddox等在ABE发酵过程中观察到“酸崩溃”现象，他们认为可能是由于未解离酸浓度过高或产酸速率过高所导致，之后通过控制发酵pH在5.0以上或将发酵温度降低至28℃可以避免产生“酸崩溃”。Yang等在ABE发酵过程中发现，产醇能力丧失可能发生在对数期早期，对数生长期时将发酵pH调控在4.7左右可以获得较高的醇浓度，而在发酵后期调控pH未促进醇的生产。Ramió Pujol等分别在37℃和25℃进行Clostridium carboxidivorans P7发酵实验，结果显示37℃时由于产生“酸崩溃”导致乙醇浓度较低（1.56mmol/L），而25℃时未出现“酸崩溃”，乙醇浓度达到32.1mmol/L。上述研究为合成气发酵稳定产醇提供了思路。
图4 3L反应器发酵曲线
图4(b)的发酵实验在第20d时补加了12%（体积比）的Clostridium autoethanogenum菌液。图4(b)显示，在0~4d时发酵液中乙酸浓度、菌体浓度均快速增长，pH迅速下降，出口CO浓度明显降低，这些现象表明菌株几乎没有生长延滞期，很快就进入了对数期。4d后乙酸浓度增长速度降低，与之对应的是pH小幅下降，菌体浓度增长速率减缓；乙醇浓度在3d后开始增长，12d时达到最大浓度3.46g/L，这一阶段得到最高乙醇与乙酸摩尔比为2.01，乙醇产率为0.35g/(Ld)，上述结果均高于文献报道；同时在该阶段出口CO含量持续大幅降低，11d达到最低值，最大CO利用率达到39.9%。12d后菌株开始出现衰亡，菌体黏附在反应器内壁上，使得菌体浓度迅速下降，之后乙酸和乙醇浓度、pH以及出口CO含量趋于稳定。20d时补加新鲜菌液后，由于发酵液被稀释，乙酸和乙醇浓度出现一定程度的降低，但是菌体浓度小幅度增长，出口CO含量再次降低，24d后出口CO含量开始上升，乙酸和乙醇浓度、pH及菌体浓度基本不再变化，补加菌液对延续发酵的作用不明显。此次实验中，初始发酵温度为37℃，第6d时将温度调至30℃，此时发酵液的pH为4.79，乙酸浓度为1.7g/L，降温后发酵过程未观察到明显的“酸崩溃”现象，说明降低发酵温度对避免“酸崩溃”的产生有一定作用。
3
结论
从气体底物和发酵工艺等多个方面对Clostridium autoethanogenum的发酵过程进行了研究，揭示了不同气体底物与产物的对应关系，探究了木糖-合成气共发酵特性以及乙酸钠、发酵温度等对生长和代谢产物的影响，得出如下结论。
（1）不同气体底物发酵实验表明，在合成气发酵过程中，菌株对CO的利用会优先于CO2和H2，CO和H2消耗的比值为0.99±0.12，产物中乙醇与乙酸摩尔比为0.78±0.10；在CO发酵过程中，CO消耗与CO2生成的比值为1.72±0.21，乙醇与乙酸摩尔比为1.00±0.11。对比两者的醇酸比可知高浓度的CO更有利于乙醇合成。
（2）木糖-合成气共发酵时木糖利用速率降低，乙酸、乙醇浓度均低于合成气发酵的结果，该现象的原因有待进一步研究。
（3）随着乙酸钠浓度的升高，菌株对木糖的利用速率降低，乙酸钠浓度为4g/L时对菌株生长基本没有影响，当浓度达到12g/L以上时则产生明显的抑制作用。
（4）发酵过程应尽量避免产生“酸崩溃”，在菌株对数生长后期适当降低温度后没有出现明显的“酸崩溃”现象。连续通气的合成气发酵过程中，最高乙醇浓度为3.46g/L，乙醇与乙酸摩尔比最高达到2.01，最大乙醇产率达到0.35g/(L∙d)。
利用合成气/CO发酵制备生物乙醇对于碳减排具有重要意义。研究发现乙酸钠浓度过高会抑制菌株的生长，未来需深入探究其抑制机理；“酸崩溃”显著影响乙醇的产量，需要进一步研究缓解“酸崩溃”的工艺条件，解决乙酸增长与乙醇合成之间的矛盾，以期获得稳定的产醇工艺。
作者简介
第一作者：方崇，硕士，研究方向为生物质资源高效转化与利用技术开发。
通信作者：徐惠娟，博士，副研究员，研究方向为生物质资源高效转化与利用技术开发。
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