浙江大学 | 曾泽阳，徐偲，戴立言，等：基于琼脂糖微球金属螯合层析介质的制备及性能评价

基于琼脂糖微球金属螯合层析介质的制备及性能评价

曾泽阳^1,2，徐偲^1,2，金子杰^1,2，王晓钟^1,2，陈英奇^1,2，戴立言^1,2

¹浙江大学化学工程与生物工程学院，浙江 杭州 310058；²浙江大学衢州研究院，浙江 衢州 324000

引用本文

曾泽阳, 徐偲, 金子杰, 等. 基于琼脂糖微球金属螯合层析介质的制备及性能评价[J]. 化工进展, 2024, 43(10): 5693-5703.

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2023-1528

摘要

以琼脂糖凝胶微球为研究对象，通过对微球进行化学交联与配体连接，制备系列金属螯合亲和层析介质，并测试其在模型蛋白中的吸附性能。首先，探究不同工艺条件对微球尺寸的影响。结果表明，在最优条件下，琼脂糖微球粒径集中在45~160μm之间，收率为95%，平均粒径为91.2μm。随后，以琼脂糖微球4B和6B为原料制备交联琼脂糖微球4FF（4 Fast Flow）和6FF（6 Fast Flow），调控交联剂滴加方式，探究不同因素对4FF微球机械强度的影响，所得4FF和6FF的最大流速分别达1190cm/h和2228cm/h。此外，本工作对制备的4FF微球进行复原性能测试及形貌表征，借助凝胶色谱法测定不同标准蛋白的保留体积，并计算有效分配系数。最后，以交联琼脂糖微球6FF为基质，制备葡聚糖接枝型金属螯合亲和层析介质，以单克隆抗体Ig G为模型蛋白，探究不同条件对介质动态蛋白载量的影响。结果表明，介质的最高动态蛋白载量可达44.8mg/mL gel。本工作为琼脂糖微球的可控制备、改性，以及在生物蛋白分离纯化中的应用提供了新思路，也为后续扩大化生产奠定了基础。

本研究对制备工艺进行改进，通过涡轮搅拌桨的强剪切力以及对乳化剂HLB值调控的共同作用，降低了油相和乳化剂用量，得到窄粒径分布的琼脂糖微球。在自制微球的基础上，进行化学交联，显著提高了微球的机械强度，并探究不同反应参数对微球机械强度的影响。随后，以交联琼脂糖微球6FF（6 Fast Flow）为基质，制备葡聚糖接枝型金属螯合层析介质，探究葡聚糖、螯合剂以及金属离子对介质动态蛋白载量的影响。该工作完成了一系列以琼脂糖微球为基质的金属螯合亲和层析介质的合成，对琼脂糖微球层析介质的制备、改性及应用提供了新思路。

蓝葡聚糖2000（M_w=2000kDa），甲状腺球蛋白（M_w=669kDa），γ球蛋白（M_w=150kDa），牛血清白蛋白（BSA，M_w=66kDa），核糖核酸酶A（M_w=16.9kDa），单克隆抗体Ig G（Mw=150kDa），多组氨酸（His）标签，分子量为5000、70000、150000葡聚糖分子，上海麦克林生化科技有限公司；琼脂糖粉LP900、SL91、SL901、M900、ML900等为日本产；GS001为西班牙产琼脂糖；1^#乳化剂、2^#乳化剂，苏州荣捷生物有限公司；甲苯、氯化钠、无水硫酸钠、环氧氯丙烷、烯丙基缩水甘油醚（AGE）、丙酮、亚氨基二乙酸（IDA）、次氮基三乙酸（NTA）等其他试剂均为分析纯，阿拉丁试剂（上海）有限公司。

参考文献[3-4,9]方法，配置质量分数4%和6%琼脂糖水溶液（所得琼脂糖凝胶微球分别标记为4B和6B），在一定温度下充分溶解，加入少量氯化钠溶液，降温至70℃待用；将1^#和2^#乳化剂按一定比例混合调控HLB值，溶解于甲苯中；将琼脂糖水溶液快速倒入装有涡轮搅拌桨的250mL甲苯反应瓶中发生乳化反应，其间即时取样至显微镜下观察，待大部分微球粒径在200μm以下后停止乳化，立即降温析出微球，对微球进行水洗筛分，最终得到45~160μm凝胶微球，并保存在20%乙醇溶液中。

琼脂糖凝胶微球机械强度较低，在高流速情况下易受压破碎，因此在微球4B、6B的基础上分别进行化学交联，提高其耐压程度，得到微球4FF   （4 Fast Flow）、6FF。参考文献方法，将保存在20%乙醇溶液中的微球置于量筒中，静置过夜滤去上层得到沉降胶，转移至烧瓶中，分别加入去离子水、丙酮和硫酸钠溶液，一定温度下分别滴加氢氧化钠溶液（含0.1g硼氢化钠）和环氧氯丙烷，滴加结束后保温反应，得到交联琼脂糖微球。图1是琼脂糖微球制备和交联过程示意图。

取10g洗净的交联琼脂糖微球6FF，以环氧氯丙烷、AGE、溴丙烯分别为活化剂，活化微球上的羟基，进行溴化操作后，加入分子量分别为5000、70000、150000的300mg/mL的葡聚糖溶液，在常温下170r/min振荡1h后，加入10mL的1mol/L氢氧化钠溶液（含30mg硼氢化钠），在25℃、170r/min下反应18h。接着，以上述相同方法对葡聚糖上的羟基进行活化。取洗净后的活化微球至三口烧瓶中，加入12mL的2mol/L碳酸钠溶液（含60mg硼氢化钠）和0.012mol的螯合剂，60℃反应18h；最后，加入金属盐溶液，常温下反应6h，并连接His标签，制得葡聚糖接枝型金属螯合层析介质。

将不同来源的琼脂糖粉溶解在水中，配置成质量分数4%的琼脂糖溶液，加热至95℃保温2h，降温至70℃，使用2^#转子，在60r/min下用数显旋转黏度计（上海仪昕，NDJ-1S）测定溶液黏度。

微球机械强度考察装置如图2所示，具体测量方法为：将一定体积的微球装入层析柱（1.2cm×20cm）中，微球填装高度10cm±0.2cm，用蠕动泵调节去离子水流速，数显压力计记录层析柱压降。首先，用去离子水以0.5mL/min的流速洗涤10个柱体积。开始测量后，逐渐增加流速，每个流速对应相应的压降，待压降稳定后记录数值，直至流速增大到一定值后压力无法稳定，结束测量并记录最大流速。随后以流速对压降作图，记录曲线的线性范围，压力最高点对应的流速即为微球所能承受的最大流速。

在1.6cm×40cm的层析柱中装入微球（高度30cm±0.2cm）后将其连入Bio-rad蛋白层析系统，通入去离子水洗涤微球，洗涤量为10个柱体积。待床层平稳后，通入平衡缓冲液（20mmol/L PB+0.15mol/L NaCl，pH=7.0，下同）使检测器基线稳定，随后通入NaCl溶液得到洗脱体积V₀；接着通入蓝葡聚糖溶液，得到洗脱体积V₁；最后分别加入甲状腺球蛋白、γ球蛋白、牛血清白蛋白、核糖核酸酶A溶液，得到各自的洗脱体积V₂。使用的蛋白浓度均为10mg/mL，上样量为250μL。K_av计算如式(1)。

动态蛋白载量测量方法如下：层析柱中（柱体积为1mL）装入金属螯合层析介质，连接到蛋白层析系统，通入缓冲液平衡系统。将单克隆抗体Ig G原液稀释至c₀（3.80mg/mL），控制0.25mL/min的速度上样。首先，让样品流经空柱，在出口处得到蛋白紫外检测信号（100%）；接着经缓冲液平衡系统，让样品流入装有填料的层析柱中，待流穿曲线的紫外检测信号达到10%结束上样，记录出峰体积V_{Ig G}。用缓冲液平衡系统，经缓冲液（20mmol/L PB+0.15mol/L NaCl+0.5mol/L咪唑，pH=7.4）洗脱。上样10μL 1%丙酮，记录出峰体积V_a。单位蛋白动态载量Q_10%（mg/mL）计算如式(2)。

由于BSA与金属螯合层析介质不存在特异性吸附，采用BSA作为杂蛋白测试，具体操作步骤如下。在层析柱（柱体积为5mL）中装满填料并压实，将其连入蛋白层析系统中，通入缓冲液使检测器基线稳定。取10mL标准储备液上样，经缓冲液淋洗至紫外检测无蛋白峰出现，然后进行洗脱，收集洗脱液并量取体积V_n。用紫外可见分光光度计分别测定标准工作溶液及洗脱液的吸光度，计算得到洗脱蛋白浓度c_n（mg/mL）。单位蛋白非特异性吸附量W_n（mg/mL）计算如式(3)。

不同来源的琼脂糖粉性能指标存在差异，这对后续成球情况及机械强度均存在较大影响；同时，琼脂糖溶液黏度也对微球有一定影响，溶液黏度过大，易黏结形成大球；黏度过小，易被旋减成小球。因此，对6种不同来源的琼脂糖粉进行性能指标和黏度测试，如表2和图3所示。同时，以6种琼脂糖粉为原料进行微球制备，在显微镜下观察微球的形貌和粒径分布。

图4展示了6种不同来源琼脂糖原料制备的凝胶微球显微镜图，发现M900琼脂糖粉制备的微球颗粒过大，而ML900琼脂糖粉未成球，这可能是这两款琼脂糖原料黏度过大造成的。其他4种琼脂糖微球在45~160μm收率均高于90%，而GS001和SL91制备微球的平均粒径略小于SL901和LP900，说明4%琼脂糖溶液黏度在100~150mPa·s范围内更利于琼脂糖微球的制备。

考察乳化过程中搅拌方式、乳化剂HLB值、乳化剂浓度、乳化温度、搅拌速度等参数对微球制备的影响。图5表明不同搅拌方式对微球粒径影响较大。与叶片式搅拌桨相比，涡轮搅拌桨的搅拌方式具有更高的剪切力和线速度，搅拌过程中产生的径向力使得液滴向壁侧流动，同时液滴上下两路回流至搅拌桨中心形成循环流动。在相同转速下，高速循环湍流带来的高剪切力将琼脂糖水溶液剪切成尺寸更小的微球。

由于成球乳化属于油包水体系，该体系使用的乳化剂HLB值往往在10以下，改变1^#和2^#乳化剂的比例，调节复合乳化剂的HLB值至4~9范围内，探究乳化剂的最优HLB值。图6表明HLB值低于5时微球球形较差，而HLB值高于8时微球粘连，颗粒过大；乳化剂HLB值保持在5~8之间，45~160μm的微球收率较高，均在95%以上，HLB值在6~7之间微球的均匀性更好。

此外，乳化剂浓度对微球形貌有重要影响。图7展示了在250mL反应瓶中不同乳化剂用量对微球制备的影响。结果表明，随着乳化剂用量增加，制备的微球球形变好且粒径减小。当乳化剂用量低于3%（质量分数）时，微球颗粒过大且球形不规则；相反当乳化剂用量高于4%（质量分数）时，微球中小颗粒过多。因此，选择乳化剂质量分数为3%时微球的形状与粒径较好。

为建立更大规模制备技术，在3L反应瓶中进行实验。图8展示了以3L反应瓶作为乳化容器、其他操作条件不变的情况下不同乳化剂浓度对微球制备的影响。与图7的实验结果对比发现，在相同乳化剂用量下，3L反应瓶制得的微球粒径比250mL反应瓶中的微球粒径更小更均匀；在3L反应瓶中，当乳化剂用量为1%（质量分数）时，45~160μm微球收率较高；当乳化剂用量提高至2%（质量分数）时，微球粒径过小。最终确定3L反应瓶中乳化剂用量为1%（质量分数）。实验结果表明，随着反应容器增大，涡轮搅拌桨直径增大，乳化剂用量降低。从图7不同乳化剂用量对微球尺寸影响的实验数据看出，乳化剂用量较大时，微球粒径较小。一般认为，搅拌桨直径增大，对溶液的剪切力也增大，更易将乳液中碰撞融合后形成的大球旋减成小球，而无需增大乳化剂用量即可达到减小粒径的效果。因此，放大实验可使乳化剂用量得到有效降低。

同理，分别考察不同乳化温度（55~75℃）和搅拌速度（250~450r/min）对微球制备的影响。从图9可得，随着乳化温度升高，微球粒径不断减小。当乳化温度在60~70℃之间，微球粒径较为均一且45~160μm范围内的微球收率超过95%。乳化温度低，琼脂糖溶液黏度大，得到的微球粒径也大；反之，粒径则小。综合考虑，选择65℃作为后续实验的乳化温度。图10展示了不同搅拌速度对微球制备的影响。结果表明，随着搅拌速度的增加，对溶液的剪切力变大，微球粒径呈减小趋势。当搅拌速度在300~400r/min之间，琼脂糖微球均匀性好且粒径在45~160μm范围内的收率高于95%。因此，选择350r/min作为实验的搅拌转速。

通过对上述工艺参数的考察，确定最优的制备条件为：采用涡轮搅拌方式，水油相质量比1∶1，乳化剂用量为3%（质量分数, 250mL反应瓶）、1%（质量分数, 3L反应瓶），乳化温度为65℃，搅拌速度为350r/min。在最优条件下，所制备的微球粒径集中在45~160μm，收率95%以上，显微镜下微球呈透明球状，无破损。

以自制琼脂糖微球4B为原料，采用滴加的方式加入环氧氯丙烷和氢氧化钠溶液，探究了溶剂种类、环氧氯丙烷加入量、氢氧化钠浓度、交联时间对交联后琼脂糖微球机械强度的影响，结果如图11所示。其中，最优条件为：水∶丙酮=1∶1（体积比）作为溶剂，环氧氯丙烷加入量为琼脂糖微球的1∶5（体积比），NaOH浓度为2.0mol/L，交联时间为24h（常温6h，保温反应18h），反应温度45℃。经优化后，微球4FF的最大流速可达1190cm/h，对比相关文献，高于商品化介质Sepharose 4FF的最大流速611cm/h；同理，微球6FF的最大流速可达2228cm/h，优于Sepharose 6FF的最大流速1220cm/h。从图12结果可得，制备的微球粒径主要集中在45~160μm之间。激光粒度仪测定的平均粒径为91.2μm，分布宽度Span值为1.39。

首先，对交联琼脂糖微球的复原性能进行探究。取5mL微球4FF于冰箱冷冻过夜，随后放入真空冷冻干燥机中（-40℃干燥6h），将干燥后的粉末重新放入水中，24h后观察微球是否恢复原状。图13展示了复原性能测试结果，发现微球4FF在干燥成粉末后浸泡入水中的第二天可恢复原状，而未交联琼脂糖微球仍为粉末，说明交联琼脂糖微球的孔道经冷冻干燥后仍具有复原性，孔道具备抗形变能力。

图14为微球4FF和6FF的扫描电子显微镜照片。从图中可看出，微球4FF和6FF表面分布着较多孔道，而相较于微球4FF，微球6FF表面孔道更为丰富，这可能与微球6FF在混合蛋白分离中更优异的效果相关。

图15展示了不同分子在琼脂糖微球4B、4FF、6FF中的保留体积，结果如表3所示。以蓝葡聚糖2000作为完全排阻物质，氯化钠作为完全渗透物质。在相同分离条件下，蛋白分子量越大，流入微球孔道的越少，更易从微球间的空隙流出，因此蛋白分子的保留体积越小。通过对比不同蛋白的K_av,4B、K_av,4FF和K_av,6FF值，表明不同分子量的蛋白可在各类微球中得到一定程度分离。其中，琼脂糖微球6FF中各类蛋白的K_av差异更明显，说明其分离效果优于琼脂糖微球4B和4FF。而微球4B的γ球蛋白和BSA的K_av几乎相等，表明琼脂糖微球4B在50~150kDa的蛋白中分离效果较差，而经交联后蛋白分配系数差异变大，分离效果有所好转。

如图16所示，激光共聚焦扫描显微镜结果表明葡聚糖分子顺利接枝到琼脂糖微球上，并进一步研究不同活化剂对葡聚糖接枝量的影响，反应条件如下：葡聚糖为Dextran70000，葡聚糖溶液浓度为300mg/mL，葡聚糖溶液∶凝胶微球=1∶1（体积比）。由图17可知，以环氧氯丙烷、AGE、溴丙烯作为活化剂时葡聚糖的接枝量分别为9.7mg/mL gel、14.6mg/mL gel、15.9mg/mL gel。由于环氧氯丙烷容易水解和自交联，导致活化效果差。而AGE和溴丙烯仅一端与琼脂糖分子上的羟基反应，另一端碳-碳双键经溴水活化后与葡聚糖反应，避免琼脂糖分子间发生交联，活化效果好。与AGE相比，溴丙烯带有的卤素基团比环氧基团具有更高的反应活性，这使得琼脂糖分子具有更高的烯丙基密度，可接枝更多葡聚糖分子。因此，选用溴丙烯作为介质制备过程中的活化剂。

选用IDA为螯合剂，Ni²⁺为螯合离子，探究不同分子量葡聚糖对介质动态蛋白载量的影响。图18(a)表明，4种介质的动态蛋白载量分别为32.8mg/mL、40.3mg/mL、41.8mg/mL、44.8mg/mL。与未接枝葡聚糖相比，接枝葡聚糖的介质具有更高的动态蛋白载量。且随着接枝葡聚糖分子量的增加，介质的动态蛋白载量不断提高，说明葡聚糖分子量适当增大有利于增加介质活性结合位点，进而提高后续配基接入密度。

同理，螯合剂和金属离子种类对介质动态蛋白载量的影响也被探究。图18(b)表明，以IDA为螯合剂的介质具有更高的动态蛋白载量，由于IDA具有3个配位键，NTA具有4个配位键，而Ni²⁺含有6个配位键，因此Ni²⁺与IDA结合后有更多的空配位键留给目标蛋白，使其具有更高的动态蛋白载量。图18(c)表明，以Ni²⁺作为螯合离子的介质动态蛋白载量为34.8mg/mL。与Co²⁺相比，Ni²⁺的离子半径更小，螯合蛋白时形成的配位键更牢固，因此Ni²⁺具有更强的蛋白结合力及更高的蛋白载量。综合上述分析，以Dextran150000作为接枝葡聚糖，IDA作为螯合剂，Ni²⁺作为螯合金属时，介质的动态蛋白载量最高，为44.8mg/mL gel。

以标准蛋白溶液与吸光度做标准曲线，拟合得到标准方程y=0.62547x+0.00532。以最优条件（Dextran150000为接枝葡聚糖、IDA为螯合剂、Ni²⁺为螯合金属）制备的介质作为测试填料，用10mg/mL BSA溶液上样，共上样10.0mL，得到洗脱液14.8mL，经紫外可见分光光度计测得吸光度为0.09，因此得到介质的单位蛋白非特异性吸附量W_n为0.401mg/mL，介质非特异性吸附量较低。

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