本文通过分析青光眼患者和健康受试者的死后视神经样本，揭示了青光眼视神经中髓鞘蛋白特别是髓鞘碱性蛋白（MBP）的显著减少，以及MBP丢失与少突胶质细胞前体减少和神经胶质细胞活性增加的关联，从而首次量化了青光眼死后组织中的视神经脱髓鞘，并支持了脱髓鞘可能是青光眼疾病进展中的次级退化过程的理论。
青光眼是一种影响全球数百万人的神经退行性疾病，其特征是视网膜神经节细胞 (RGC) 退化，严重者会导致失明。尽管青光眼的发病机制和潜在机制尚未完全了解，但有理论暗示脱髓鞘在疾病过程中发挥了作用。先前使用青光眼动物模型和青光眼患者临床评估的研究发现了脱髓鞘，即轴突周围髓鞘的退化。然而，这在青光眼患者中尚未完全实现或量化。利用来自青光眼和健康受试者的死后视神经样本，进行了各种免疫组织化学和形态学评估，以确定青光眼视神经脱髓鞘的程度（如果有的话）。我们的研究结果表明，除了神经萎缩和神经组织束退化外，青光眼视神经中的髓鞘蛋白（特别是髓鞘碱性蛋白 (MBP)）也显著减少。此外，MBP 的丢失与少突胶质细胞 (OLG) 前体细胞减少和神经胶质细胞活性增加有关。这进一步支持了先前的证据，即脱髓鞘可能是与青光眼疾病进展相关的继发性退化过程。这些结果不仅为潜在的疾病机制提供了证据，而且这也是第一项量化青光眼死后组织中视神经脱髓鞘的研究。
关键词：青光眼、脱髓鞘、神经变性、视神经
介绍
青光眼是一种视神经病变，主要影响视网膜神经节细胞 (RGC)，其退化是全球失明的主要原因之一 [ 1 , 2 ]。尽管青光眼的病理生理学尚不完全清楚，但眼压升高 (IOP) 是两种原发性青光眼（开角型和闭角型青光眼）的主要危险因素。尽管引起青光眼的原因不同，但眼内房水动力学失衡和随之而来的眼压升高被认为会对轴突造成压力和机械应力。然而，青光眼相关的视神经病变也可发生在眼压正常的患者中，称为正常眼压性青光眼 (NTG)，许多眼压升高的人不会患上青光眼 [ 1 , 3 ]。
青光眼中 RGC 变性的过程尚未完全了解，但已发现一些机制在此过程中发挥关键作用。由于青光眼的多面性，很难确定特定的基因或生化机制，而是多种关键因素共同作用，形成了变性的环境。例如，RGC 轴突功能障碍是青光眼早期进展的已知标志，其中顺向和逆向轴突运输减少 [ 3,4 ]轴突运输缺陷或阻塞可导致 RGC 受到环境压力，如谷氨酸增加引起的兴奋性毒性或神经营养因子的剥夺 [ 4 ]。关于青光眼变性过程的另一种理论涉及脱髓鞘，即视神经内神经元外髓鞘损伤，这可能会降低神经元的结构完整性和传输效率 [ 2 ]。虽然尚未完全了解，但青光眼中脱髓鞘发生的原因有很多种。负责髓鞘化轴突的少突胶质细胞 (OLG) 已被发现在青光眼动物模型中减少[ 2 , 5 - 7 ]。Nakazawa 和同事 [ 5 ] 报告说，在青光眼动物模型中，诱导高眼压后，肿瘤坏死因子 α (TNF-α) 相应上调，活化小胶质细胞表达增加。这可能会创造一种细胞毒性环境，因为表达 TNF-α 特异性受体的小胶质细胞会攻击和损伤 OLG，并间接对 RGC 产生有害影响。虽然脱髓鞘可能不是青光眼的主要病理，但视觉通路的神经元高度依赖于髓鞘完整性 [ 8 ]。由于髓鞘在这些神经元的结构和维持中起着不可或缺的作用，脱髓鞘可促进 RGC 死亡。这也成为进一步研究对髓鞘具有修复或保护作用的治疗方法的来源，例如针对巨噬细胞介导的炎症或 OLG 上的毒蕈碱受体 [ 9 , 10 ]。
尽管之前有多项研究从不同角度显示了脱髓鞘如何促进青光眼中的 RGC 死亡，但对于 OLG 和髓鞘损伤是否是 RGC 损伤的原因或结果仍存在争议。许多研究发现，在青光眼模型中，以及基于青光眼患者的临床证据，髓鞘结构和/或髓鞘相关蛋白的功能障碍发生在 RGC 损伤之前 [ 5,11,12 ] 。相反，一些研究仅在 RGC 损伤或死亡之后才发现脱髓鞘的影响。Son 等人 [6] 就是这种情况，他们与 Nakazawa 等人类似，发现 DBA/2J 小鼠中有星形胶质细胞活化、小胶质细胞活化和 OLG丢失。该小鼠品系经过基因选择和近交，以产生遗传性青光眼及其与人类青光眼相似的相应症状 [ 13 ]。然而，星形胶质细胞反应性的增加是动物疾病进展中的早期反应，OLG 损失直到大多数轴突和 RGC 已经耗尽后才发生。在其他形式的动物青光眼模型中也发现了类似的结果，包括实验性自身免疫性青光眼 (EAG)。该模型对视网膜和视神经的影响，包括激活自身免疫补体系统，发生在髓鞘蛋白（髓鞘碱性蛋白，MBP）受损之前 [ 14 ]。
大多数脱髓鞘证据都是通过青光眼患者的影像学研究间接发现的，包括使用扩散张量成像 (DTI) [ 11 , 15 ]。这些研究表明，视神经存在一些功能障碍或异常，包括扩散率增加和轴突完整性降低，表明发生了脱髓鞘。这些测量结果甚至可以与青光眼的严重程度相关联，这进一步加强了青光眼发生脱髓鞘的论点 [ 15 ]。在青光眼患者中，难以直接测量脱髓鞘，并且可供研究人员使用的适当收集的死后组织供应量很低 [ 16 ]。本研究的目的是能够使用健康和青光眼患者死后的视神经来量化青光眼的脱髓鞘程度。我们使用免疫荧光来观察视神经中的 MBP，作为存在或不存在脱髓鞘的标记。这进一步与视神经形态、RGC 存活率以及反应性星形胶质细胞 (GFAP 染色) 和 OLG 转录因子 (Olig2 染色) 的存在相关。这不仅能描述和阐明青光眼脱髓鞘的程度，还能描述青光眼脱髓鞘的可能介质。
材料与方法
死后组织
经麦考瑞大学医学和健康科学小组委员会的当地伦理批准（编号 5201831944629）并符合 NHMRC HREA 规定后，从 Lions NSW 眼库获取了死后眼部样本。这些样本包括保存液（甲醛，在固定剂中平均保存 2 年 4 个月）中的眼球和附着的视神经。在这些样本中，随机选择了四名健康受试者（男性 n = 2，平均年龄 71 岁）和四名原发性开角型青光眼 (POAG) 患者（男性 n = 3，平均年龄 80 岁）的左眼和右眼使用（n=8 名受试者，n=16 条视神经）。受试者和所用组织的详细信息显示在补充材料中。如果视神经尚未切除，则从距离眼球其余部分最近的区域切除。然后将其固定在石蜡中，并在切片机（Mikrom HM325 切片机）上切成 10μm 厚度的横截面。
以类似的方式准备了 10 个之前描述的相同对应眼睛（对照组 n=5，青光眼组 n=5）的视网膜：首先从眼球的其余部分切下，使视神经头和周边视网膜对齐。然后在切片机（上图）上将其切成 7μm 厚。补充材料中进一步详细介绍了此用途。
免疫荧光
视神经和视网膜切片分别在二甲苯和乙醇中脱蜡和再水化。随后在柠檬酸缓冲液（pH 6）中用吐温-20（Sigma-Aldrich，PBS 中 0.1% 吐温 20）在 60C 下进行抗原修复 45 分钟。通过应用 0.1% Triton X-100（Lomb Scientific Pty Ltd，PBS 中 0.2% Triton X-100）增强通透性，然后在室温下封闭 90 分钟至 2 小时。封闭溶液包括 PBS 中的驴血清和 0.3% Triton X-100。将切片与选定的一抗、牛血清白蛋白 (BSA) 和 0.3% Triton X-100 在 4C 下孵育过夜。所用抗体列于以下小节 (2.2.1)。与适当的二抗孵育并对 DAPI 进行复染 1 小时后，涂上封固剂和盖玻片。
为了确保免疫荧光结果的有效性，我们采用了某些对照。这包括首先选择在之前的研究或在同一实验室内进行的其他实验中得到验证的抗体。通过使用相同类型和不同来源（动物）的对照组织来验证抗体的靶标特异性并尽量减少背景染色。此后进行了进一步的“练习”运行，以确保所用抗体在原位准确。
抗体
本研究中使用的一抗详述如下：MBP（1:500 Abcam - ab40390）、Olig2（1:1000，R&D Systems - AF2418）、GFAP（1:1000，Dako - Z0334）。二抗与适当的一抗一起使用，包括驴抗兔 Cy3（1:500，Jackson ImmunoResearch - 编号 711-105-152）和驴抗山羊 Alexa 488（1:500，Jackson ImmunoResearch - 编号 705-546-147），并使用 DAPI（1:1000，Invitrogen - 编号 D1306）进行复染。
视网膜被染色为 NeuN（1:500，Abcam - ab104224），并且仅考虑 NeuN 和 DAPI 双阳性细胞用于 RGC 计数。视网膜中使用的二抗是驴抗鼠 Alexa 488（1:500，Jackson ImmunoResearch，cat. 715-545-150）或驴抗鼠 Alexa 647（1:500，Jackson ImmunoResearch，cat. 715-605-151）。
显微镜和图像采集
对来自八个视神经的四到六个 10μm 横截面切片进行染色，然后使用荧光显微镜 Zeiss Axio Imager 2 进行成像。所有成像参数，包括光强度（100%）、像素合并（1, 1）和荧光曝光时间均基于“自动”设置，并在所有分析样本中保持不变。使用 Zeiss Axio Imager 2 中的“自动”曝光功能的多张对照图像确定所有放大倍数下特定通道的曝光时间，然后手动微调以确保以最短的曝光时间呈现最明显的全面图像。以 5 倍放大率拍摄整个横截面的平铺图像，然后使用 Zeiss ZEN Blue 3.5（RRID：SCR_013672）进行拼接。对于 MBP 和形态学分析，从每个切片中拍摄两张代表性图像，而 Olig2 和 GFAP 分析则以 20 倍放大率拍摄六张代表性图像。
图中使用的代表性图像是根据图像的整体质量来选择的，以排除模糊、有遮挡或碎片的图像等。如果图像无法在不改变图像质量或细节的情况下进行适当裁剪或调整大小，则不可用于图。最后，选择最能代表每次评估结果的图像，并且不进行任何修改（图 4进行的数字重新着色除外）。
图 4.
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少突胶质细胞前体在青光眼视神经中的表达显著恶化。（A）对照和青光眼视神经的代表性图像展示了健康和青光眼视神经中 Olig2 染色（数字着色为红色）的性质和外观。对照（左）图像显示视神经内有鲜红色的 Olig2 染色斑块，而青光眼（中和右）则有一些稀疏的红色染色。每幅图像右下角的比例尺表示 500um。（B）对照（n = 2）视神经的 Olig2 荧光强度明显高于青光眼（n = 2）（非配对 t 检验，p = 0.0011）。(C) 当将 Olig2 表达与 MBP 关联时，两者之间存在显著的正相关性，如绘制的最佳拟合线和相应的 GEE beta 系数所示（GEE，B = 1.172，p <0.001）。C 的 beta 系数 (B) 和 p 值显示在图表旁边。
视神经形态学（改编自 Pelot 等人，2020 年）
视神经形态分析改编自 Pelot 及其同事 [ 17 ]。视神经表面积从 5X 平铺图像中获取，包括周围软脑膜鞘和中央动脉的视神经在 ImageJ/FIJI 中测量 [ 18 ]。在 ImageJ/FIJI 中还手动计算了同一图像中可见的束状结构数量。
使用 MBP 染色的 20X 代表性图像来确定平均束面积：将每张图像转换为灰度图像，分离单个束并测量其表面积。对单个图像的结果取平均值（
视神经、神经束、结缔组织和隔膜的有效直径是通过将圆与相同的表面积相等来确定的，如 Pelot 和同事 (2020) 所述，详情如下：
•
平均视神经面积 = ON
视神经有效直径 =
2 × 五 （ 𝑂 𝑁 𝑝 ） •
总束表面积 (F) =
𝑎 𝑣 𝑒 𝑟 𝑎 𝑔 𝑒 # 𝑜 𝑓 𝑓 𝑎 𝑠 𝑐 𝑖 𝑐 𝑙 𝑒 × 𝑎 𝑣 𝑒 𝑟 𝑎 𝑔 𝑒 𝑓 𝑎 𝑠 𝑐 𝑖 𝑐 𝑙 𝑒 𝑠 𝑢 𝑟 𝑓 𝑎 𝑐 𝑒 𝑎 𝑟 𝑒 𝑎 束有效直径 =
2 × 五 （ 𝐹 𝑝 ） •
隔膜面积 (S) = ON - F
束有效直径 =
2 × 五 （ 𝑆 𝑝 ）
通过将束状面积和隔膜面积与视神经总面积的比率除以各自的有效直径，可推算出束状面积和隔膜面积与视神经总面积的比率。这两个比率之间的比例变化或差异以百分比表示，计算方法如下：
•
ON:束支比 (FR) =
𝐹 / 𝑂 𝑁 ON:隔垫比率 (SR) =
𝑆 / 𝑂 𝑁 •
百分比比较 =
（ 𝐹 𝑅 𝑆 𝑅 − 1 ） × 1 0 0
GFAP/星形胶质细胞形态（改编自 Bosco 等人，2016 年）
用 GFAP 染色的载玻片在 ImageJ/FIJI 中转换为二值图像。使用以下公式自动得出每幅图像的阈值水平：
高于平均背景阈值的像素在二值图像中变为白色。这种基于强度的阈值化和测量方法改编自 Bosco 及其同事 [ 19 ]。然后对该图像进行骨架化，移除每个物体边缘的像素，直到只剩下该物体的单个像素“骨架”。然后测量该骨架的面积，以得到 GFAP 阳性区域，如图5E所示。
图 5.
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青光眼视神经中星形胶质细胞更加活跃，GFAP 表达增加。（A）健康 GFAP 表达（左，黄色）和青光眼（右，橙色）的代表性图像，放大 40 倍（顶部），下方是单个星形胶质细胞的放大图像。这些图像显示了青光眼视神经中多个活跃星形胶质细胞（右）的形态，具有广泛、粗的分支和一些萎缩的星形胶质细胞体（白色箭头），而对照视神经中的静止星形胶质细胞（左）具有少量、浅染色的突起。A 右下方的比例尺表示 10um（顶部）和 5um（底部）。（B）青光眼（n = 2）受试者的 GFAP 荧光强度明显高于对照组（n = 2）（非配对 t 检验，p <0.0001）。(C) 当绘制 MBP 荧光强度与 GFAP 的关系图时，根据 GEE beta 相关性，存在轻微的负相关性，但并不显著 (GEE，B = -0.172，p = 0.654)。(D) 青光眼患者中 GFAP 阳性星形胶质细胞突起占据的神经纤维面积明显大于对照组 (非配对 t 检验，p = 0.0005)。这在 GFAP 阳性区域的骨架图像 (E) 中显示，顶部为对照视神经，与中间和底部图像中 GFAP 阳性星形胶质细胞突起的密集网格形成对比。所有图像右下角的比例尺显示 50 μm。此外，健康对照视神经中神经纤维面积与 GFAP 阳性面积 (F) 的比率明显较高，表明青光眼视神经中神经束内有更多的 GFAP 阳性染色区域 (非配对 t 检验，p = 0.0011)。图表旁边显示了 C 的 beta 系数 (B) 和 p 值。
荧光强度
在 Zen Blue 3.5 中，每张图像被拆分成单独的通道（例如 MBP、GFAP、Olig2），并转换为 TIF 图像类型。然后在 ImageJ/FIJI 中将其转换为 8Bit 图像，并按照前面所述计算每张图像的阈值。每张图像的平均强度定义为：
RGC 计数
在 20 倍放大倍数下，对五名对照组和五名青光眼患者的整个视网膜切片长度拍摄了多张图像，这些患者的视神经也进行了分析。仅对 NeuN 和 DAPI 双重染色的 RGC 进行计数，然后对整个视网膜的每张图像进行求和，以得出视网膜子集的代表性计数。这是在 ImageJ/FIJI 中手动完成的。
统计分析
使用 GraphPad 10.1.2 版 [ 20 ]中的非配对 T 检验对两组（对照组与青光眼组）进行统计分析，结果以平均值±标准差 (SD) 表示，后跟 p 值。多组（两组或两组以上）之间的所有其他操作均以普通单因素方差分析进行，后跟 Tukey 多重比较检验，如图1D和3B所示。这也以平均绝对差异 (diff)±差异标准误差 (SE) 和 p 值在文本中表示。所有得出显著结果（p ≤ 0.0500）的统计检验都将在其后列出相应的 95% 置信区间，格式为 CI 95% 下限，上限。使用 Mann-Whitney 检验对非正态分布的数据集（三个实例）进行了统计检验，并根据需要报告了平均值 ± sd、Mann-Whitney p 值（精确值或近似值）和置信区间。这些实例已在文中标识出来。
图 2.
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对照组和青光眼组视神经的代表性免疫荧光图像。（A）5 倍放大倍数的视神经横截面平铺图像，用 MBP（黄色）和 DAPI（蓝色）染色，左侧为对照组，右侧为更严重的退化性青光眼。右侧图像显示 Schnabel 海绵状变性，这是某些更晚期青光眼病例的特征。（B）20 倍放大倍数的神经纤维束代表性图像，显示方式与（A）类似，左侧为对照组，右侧为更严重的退化性纤维束。每幅图像右下角的比例尺表示 500 μm（A）和 100 μm（B）。
图 3.
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青光眼患者髓鞘表达明显减少。（A）对照组（n = 8）与青光眼组（n = 8）患者的平均荧光强度明显较高（非配对 t 检验，p<0.0001），比较各组左眼和右眼时存在进一步差异（图中按图例着色）（普通单因素方差分析，右眼比较 p <0.0001，左眼比较 ns）（B）。（C）青光眼患者（n = 5）视网膜亚区中计数的 RGC 数量明显低于对照组（n = 5）（Mann-Whitney 检验，精确 p = 0.0238）。这与 MBP 荧光强度呈负相关（未显示）。B 的值表示为平均差异 ± SE。
在图形中，某些类型的数据集以不同的方式表示。例如，为了传达来自一个受试者或分析的一组重复数据，使用显示平均值和 SD 的条形图。所有其他表示来自多个受试者的多个数据集的图形都位于散点图中，其中绘制了来自各个受试者的数据点以及平均值和 SD。
通过在 GraphPad 中绘制给定变量，可以直观地表示相关性。然后在 IBM SPSS Statistics 版本 28.0.0.0 中计算广义估计方程 (GEE)。这允许考虑年龄和性别等受试者内变量，否则这些变量会被忽略。这些结果由其 beta 系数 (B) 和 p 值给出。
结果
青光眼的轴突变性表现为视神经变化
青光眼和健康受试者的视神经面积在左眼和右眼之间表现出很大的差异，有些受试者的一侧明显大于另一侧（图 1A、图 2A，n=16）。总体而言，与青光眼患者相比，健康眼的视神经表面积略有增加，但并不显著（Mann-Whitney 精确 p = 0.1550）（图 1B）。这种细微的差异可以归因于组间（对照组 vs 青光眼组）和受试者内（左眼 vs 右眼）的差异。
图 1.
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对照组和青光眼患者眼睛的形态学分析。（A）所有分析眼睛（n = 16，重复 = 4-5）的视神经表面积在此处显示，并在图表中按其组（对照组，黑色和橙色，或青光眼组，蓝色和粉色）和眼睛（左眼，黑色或蓝色，右眼，橙色或粉色）进行标记。这样做是为了显示组间和受试者内的视神经大小的变化。（B）对照组和青光眼患者的视神经表面积无显著差异（非配对 t 检验）。（C）青光眼患者每条视神经计数的神经束数量明显高于对照组（非配对 t 检验，p <0.0001）。(D) 与对照组相比，青光眼患者的神经纤维总面积（平均神经束面积 x 神经束数）明显较小（Mann-Whitney 精确概率法 p = 0.0018）。（E）所有对照变量中视神经内容物（神经纤维束或结缔组织和隔膜，按图中图例着色）的比例均明显高于相应的青光眼（普通单因素方差分析，所有值 p<0.0001）。此外，视神经内神经束和隔膜面积比率的百分比比较显示，对照视神经与青光眼相比呈更大的正相关关系（非配对 t 检验）。（F）在所有图中，对照组以黑色圆形图标表示，青光眼组以橙色方形图标表示，除非图例和/或标题另有说明。图中的所有 p 值均表示为 * = p ≤ 0.05；** = p ≤ 0.01；*** = p ≤ 0.001；**** = p > 0.0001。除非图题另有说明，否则图形中表示的所有值均为平均值 ± SD。E 的值表示为平均值差异 ± SE。
尽可能从整个视神经的 5 倍放大图像中计数神经纤维束，然后从 ImageJ/FIJI 中的 20 倍放大视神经图像中分离神经纤维束以确定面积。青光眼性视神经中的神经纤维束明显更多（591.14 束 ± 61.64 vs 357.97 束 ± 48.51，p < 0.0001，CI 95% 94.71, 247.7）（图 1C，图 2B）。然而，束的表面积明显较小（2589438 μm 2 ± 1463024 vs 3862228 μm 2 ± 2534216，Mann-Whitney 精确 p = 0.0018，CI -1692844, -520433）（图 1D，图 2B）。
根据 Pelot 及其同事 (2020) 先前对视神经形态的分析，通过拟合与不规则形状的视神经表面积相同的圆来确定视神经各部分的有效直径。这样可以更直接地比较视神经的某些部分，包括束区和隔膜/结缔组织区。对照组的视神经有效直径、束区和结缔组织区均显著大于青光眼患者（diff 分别为 9488μm ± 1386、6703 μm ± 1176 和 6571 μm ± 1661）（图 1E）。对照组视神经内束与隔膜面积比率的百分比比较（8.985% ± 39.37）显示，与青光眼视神经（-15.32% ± 30.65）相比，束与隔膜面积比率呈现更大的正相关关系（图 1F、图 2A 和 B）。
青光眼患者的髓鞘碱性蛋白水平显著降低
在视神经横截面上测量了 MBP 的荧光强度，并在组内和受试者之间进行了比较。同一受试者的左眼和右眼之间的荧光强度有一些差异，但这并不显著。取每张图像中单个像素的平均荧光，健康视神经的免疫反应性高于青光眼视神经（32.30AU ± 14.55 vs 24.09AU ± 7.668，p < 0.0001，CI 95% -12.19，-4.229）（图 3A）。当比较眼睛时，例如左对照眼与左青光眼眼相比，两者之间存在一些差异，青光眼眼的强度较低（差异 -4.622AU ± 2.603，p = 0.0800）（图 3B）。在比较对照右眼和青光眼右眼时也发现了这一点，显示出显着差异（差异 -13.29AU ± 3.100，p < 0.0001，CI 95％-19.50，-7.078）（图 3B）。
为了确定青光眼中的 RGC 损失与脱髓鞘之间是否存在相关性，对五名具有代表性的健康和青光眼受试者的 RGC 数量进行了计数，并绘制了 RGC 与平均 MBP 强度的关系图。对照组视网膜子切片中计数的 RGC 数量明显多于青光眼组（986.4 RGC ± 130.9 vs 703.4 RGC ± 155.4，Mann Whitney 精确 p = 0.0238，CI -483.0, -74.00）（图 3C）。RGC 数量与平均 MBP 荧光之间存在轻微的正相关性（B = 0.001），但不显著（p = 0.966）（未显示）。
青光眼脱髓鞘的探索性分析
对照组和青光眼组（n=4）中的两名代表性受试者被用于进一步的免疫荧光染色，以确定青光眼变性的潜在方法之间是否存在相关性。少突胶质细胞转录因子（Olig2）在对照组中的荧光强度明显高于青光眼组代表（14.14 AU ± 5.063 vs 8.432 AU ± 2.464，p = 0.0011，CI 95% -8.901，-2.507）（图 4A 和 B）。当与平均 MBP 荧光作图时，这两个因子之间存在显著的正相关性（B = 1.172，p < 0.001，CI 95% 0.728，1.616）（图 4C）。
与上述相同代表性受试者的青光眼视神经横截面具有明显更亮的 GFAP 荧光 (48.64AU ± 7.406 vs 36.97 AU ± 5.397, p < 0.0001, CI 95% 9.048, 14.29) (图 5A 和 B，图 4A为红色)。与平均 MBP 作图时也产生了负相关性 (B = -0.172)，但统计上并不显著 (p = 0.654) (图 5C )。
观察每位受试者的 GFAP 染色时，可以发现青光眼受试者的反应性星形胶质细胞比对照组多（观察其形态）。通过测量视神经的 GFAP 染色面积对此进行了量化，结果显示青光眼受试者的活性星形胶质细胞面积大于健康受试者（9854 μm 2 ± 1645 vs 7707 μm 2 ± 684.7，p = 0.0005，CI 95% 1062, 3232）（图 5D 和 E）。此外，对照组总束状面积与 GFAP 阳性面积之比 (462.4 μm 2 ± 73.66) 明显高于青光眼组总束状面积与 GFAP 阳性面积之比 (268.0 μm 2 ± 112.1, p = 0.0011, CI 95% -296.1, -92.67) (图 5F )。
不对称青光眼病例研究
为了确定罕见的非对称性青光眼病例是否会对对侧眼产生影响，我们比较了一位受试者的 MBP 荧光强度，左眼患有青光眼，右眼患有视野前青光眼。这是非对称性青光眼的一个例子，被称为受试者 AG。研究发现，左眼青光眼的 MBP 荧光强度低于受影响较轻的眼睛（21.84 AU ± 7.426 vs 29.88 AU ± 10.11）（图 6A）。
图 6.
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不对称青光眼显示 MBP 表达减少，并伴有形态学变化。（A）左眼青光眼（蓝色，重复 = 6）的 MBP 表达低于右眼视野前眼（红色，重复 = 5）。然而，右眼的形态与青光眼受试者的相似性高于其他对照右眼（n = 4）。与对照组（B，红色条）相比，这包括视神经表面积和神经纤维/束面积（B，蓝色条）减少。视野前眼的 MBP 水平也与对照组更相似。
还观察到对侧 (视野前) 眼的某些方面与青光眼患者的相似度高于健康人。例如，与对照组的右眼相比，AG 右眼的整体视神经面积和束状面积均减小 (图 6B )。这与前面提到的青光眼患者的视神经和束状面积小于健康人的观察结果一致。但是，将右眼视野前眼与对照眼进行比较时，MBP 荧光强度没有差异 (29.88 AU ± 10.11 vs 33.51 AU ± 11.91)，进一步支持青光眼脱髓鞘与疾病进展有关 (图6C )。
讨论
这项研究的结果与许多临床评估和动物模型研究的结果相吻合：青光眼患者的视神经会发生脱髓鞘，这种恶化与青光眼相关的其他细胞和生化缺陷有关。这不仅与视神经的形态分析相结合，还与青光眼可能发生的退化模式的其他指标相结合。青光眼脱髓鞘的确认
青光眼脱髓鞘的确认
本研究的主要发现之一是证实青光眼视神经的髓鞘比健康视神经的髓鞘恶化程度更显著。这项研究也是首批使用免疫荧光技术量化青光眼患者死后组织脱髓鞘程度的研究之一。尽管之前已在正常、健康的视神经 [ 21 ] 和其他眼部疾病，如 Leber 遗传性视神经病变 [ 22 ] 中阐明了这一点，但是对死后青光眼组织进行脱髓鞘组织学评估的案例极少。通过研究髓鞘蛋白的变化和脱髓鞘的其他加重特征，如蛋白质印迹分析或酶联免疫吸附试验 (ELISA)，可以进一步证实本研究的免疫荧光结果。
这些结果得到了先前在青光眼动物模型中进行的研究和在青光眼患者中进行的临床观察的支持，这些结果表明脱髓鞘是青光眼病理学的一个潜在关键因素[ 2,11,14 ] 。例如，DTI 测量已被证明是一种可靠的测量轴突完整性丧失和脱髓鞘的方法，因为它可以指示轴突存在时水分子的扩散率和方向[ 23 ]。在原发性闭角型青光眼 (PACG)、 POAG和正常眼压性青光眼 (NTG) 中，研究发现它们表现出比正常人更高的扩散率和更低的各向异性[ 11,15 ]。轴突和髓鞘损伤的证据也与基于海德堡视网膜断层扫描 (HRT) 的线性判别函数的青光眼严重程度测量值呈正相关[ 15 ]。然而，这些测量结果无法表明脱髓鞘的确切程度，只能表明脱髓鞘的潜在存在或不存在。
动物研究进一步提示脱髓鞘在青光眼模型中的作用，但这一作用尚未完全扩展到人体研究。最近，Chaudhary 及其同事 [ 24 ] 证实，在患有实验性青光眼的非人类灵长类动物（恒河猴）中，视神经的后板部分无髓鞘轴突和较小轴突的比例显著增加。其他动物模型，如小鼠青光眼模型的新型组合（βB1-结缔组织生长因子 + 视神经抗原匀浆），可用于探索青光眼中的眼高压和免疫反应的影响 [ 25 ]。这种组合显示髓鞘染色（luxol fast blue，LFB）较少，髓鞘结合蛋白的 mRNA 表达降低。这一结果在单个青光眼模型中未能重复，在之前使用相同视神经抗原匀浆模型的研究中也未能重复 [ 14 , 25 ]。这一有趣的发现意味着，由于只有诱导眼压升高的青光眼模型才会诱导脱髓鞘，所以眼压和髓鞘完整性之间存在依赖性的相互作用。尽管在一些人体 NTG 分析中发现了相互矛盾的结果 [ 2 , 15 ]，但对于眼高压如何影响 RGC 和髓鞘损坏还是有一些解释的。髓鞘抑制蛋白 Nogo-A 在眼高压大鼠的视网膜中显著上调 [ 7 ]。Nogo-A 在正常视网膜中对突触维持和神经元存活的调节作用在过表达时会发生逆转，因为突触功能中断会抑制轴突再生，进而导致 RGC 死亡 [ 7 , 26 ]。
本研究结果显示，通过比较 MBP 的荧光强度与视网膜某部分中计数的 RGC 数量，可以发现 RGC 变性和脱髓鞘之间存在轻微但不显著的相关性。造成这种现象的一个主要原因可能是可供比较的样本量较小，因为两次分析都只使用了 10 只眼（5 只对照眼和 5 只青光眼眼）。此外，更全面的轴突密度分析可以更准确地计算出青光眼患者中存活的 RGC 数量。另一个原因是，在某些情况下，在轴突损伤和脱髓鞘发生后，RGC 体可以部分保留或存活，因此，根据疾病的进程，视网膜中观察到的 RGC 数量可能多于视神经内完整轴突的实际数量 [ 3 ]。此外，在视神经炎病例中，由于炎症和/或损伤导致脱髓鞘，RGC萎缩的病程会随着时间的推移而发展，即萎缩会随着时间的推移而减轻，青光眼中的脱髓鞘可能也是如此[ 27 ]。
青光眼球后视神经的形态学改变
通过 HRT 测量分析视神经头部的形态变化比分析青光眼患者视神经远端部分更常见 [ 15 , 28 ]。然而，也有一些研究分析了视神经的直径和横截面积。在有和没有眼高压的 POAG 患者中，超声扫描显示青光眼患者的直径和横截面积明显小于健康患者 [ 29 ]。这在表现出不同程度视野缺损的 POAG 患者中也得到了类似的证实，并且他们的视神经直径也小于正常人 [ 30 ]。有趣的是，视神经萎缩与青光眼的严重程度有关，因为视神经直径较小与视野缺损和视盘测量结果（如杯盘比）的恶化有关。这被归因于青光眼中的轴突变性和视神经内容物的丢失 [ 28 , 30 ]。进一步的研究可以利用这些发现进行进一步的尸检分析，并结合患者的临床病史来确定青光眼严重程度、轴突丢失和脱髓鞘之间是否存在相关性。
除了视神经整体萎缩之外，随着轴突变性的进展，视神经内的神经束也会萎缩。这导致观察到更多具有较小表面积的神经束，这是因为它们分解成多个较小的束（如图 2 所示）。这解释了神经纤维面积与整体视神经的比例以及视神经内隔膜与结缔组织的比例的变化。对于表现出 Schnabel 海绵状视神经萎缩的青光眼视神经尤其如此。这种形态特征表现为球后视神经（筛板后部）内髓鞘和轴突的急剧损失，而周围的隔膜周边仍然存在，从而呈现空洞的外观 [ 31 , 32 ]。这是一种相对罕见的现象，最常见于患有青光眼和/或葡萄膜黑色素瘤的患者，但在没有报告眼科疾病或相应症状的患者的视神经中也可发现[ 31,32 ]。
星形胶质细胞反应性和少突胶质细胞变性之间的关系
本研究中的免疫荧光分析包括髓鞘蛋白 (MBP)、反应性星形胶质细胞 (GFAP) 和少突胶质细胞前体 (Olig2)。这些结果证实了先前文献中关于青光眼变性和脱髓鞘的潜在方法。例如，青光眼患者的 Olig2 荧光强度显著降低，并且与 MBP 强度呈正相关。这表明 OLG 前体减少（脱髓鞘的征兆）与髓鞘蛋白的数量之间存在潜在关系。这之前已在青光眼动物模型中观察到，其中 OLG 数量显著减少，OLG 前体 (OPC) 增殖增加 [ 5,6 ]。虽然这支持 OLG 变性在青光眼脱髓鞘中起主要作用，但关于这种变性的时间和原因存在相互矛盾的证据。关于星形胶质细胞反应性发生在 OLG 变性之前还是之后，以及星形胶质细胞活化是否在脱髓鞘中起因果作用，也有相互矛盾的证据。利用青光眼动物模型的研究报告了支持 [ 5 ] 和矛盾 [ 6 ] 的结果。在对微珠诱发的青光眼高眼压模型中的基因表达进行分析时，Keuthan 和同事 [ 33 ] 发现，在注射微珠三天后，Olig2 基因表达显著降低。虽然 GFAP 基因表达在视神经髓鞘区域的表达没有显著变化，但在这些动物的视网膜中，GFAP 基因表达显著增加。通过前房灌注引起的高眼压也支持了这一点，在 1 天后，整个视网膜的 GFAP 表达显著增加 [ 34 ]。进一步的研究需要从更早的时间点开始更多的观察，以确认 OLG 退化与星形胶质细胞活动的时间过程，因为以前的研究中的观察时间范围是受伤或疾病发作后的一天到一周。
在本研究中，不仅青光眼视神经中的 GFAP 荧光强度显著增加，而且 GFAP 阳性区域也更大，表明星形胶质细胞更活跃。尽管之前的研究（例如 [ 34 ]）从表面层面支持了这一观点，但它并不一定支持或反驳脱髓鞘过程中胶质细胞活性发生变化的可能性。很难确定仅有 GFAP 表达是有益还是有害，因为识别范围已经超出了“静息”和“活跃”阶段 [ 35 ]。未来的研究中，可以通过使用已知有益和有害胶质细胞表型的更特异性标记物来克服这一问题 [ 6 , 25 , 33 ]。
非对称性青光眼病例中的跨突触变性证据
在分析一例不对称青光眼病例时，左眼受累更为严重，发现 MBP 荧光强度明显低于对侧眼。此外，右眼（视野前）的形态特征更类似于青光眼视神经而非健康视神经，并且 MBP 表达也降低。这支持了脱髓鞘是青光眼神经变性的众多潜在驱动力之一，与疾病进展和严重程度有关。这些结果可以在未来的研究中进一步扩展，使用来自此类不对称青光眼患者的可靠尸检样本。
在青光眼动物模型中也有类似的损伤扩散报告。例如，在大鼠右眼眼压升高后，对侧眼的视束会萎缩 [ 34 ]。此外，损伤还通过突触扩散到大脑的高级视觉中枢。在青光眼和视神经损伤动物模型中，背外侧膝状体 (dLGN) 和上丘 (SC) 发现了细胞凋亡和星形胶质细胞反应的证据 [ 12,34 ] 。随后，有证据表明这些动物的 dLGN 神经元萎缩和收缩增加，在青光眼患者的 LGN 区域也发现了这种情况[ 34,36 ] 。
结论
本研究的结果是首次量化青光眼患者脱髓鞘程度的研究结果之一，进一步支持了脱髓鞘与青光眼性神经变性之间的关联。未来的研究可以从更多的纵向研究结构中受益，利用有关青光眼严重程度和脱髓鞘评估的临床信息，并将其与尸检分析进一步关联起来。这将克服本研究的一些局限性，例如可用的可行样本数量较少。另一个限制是无法获得患者的病史，例如以前的药物和治疗、青光眼疾病的严重程度以及相关的临床信息，例如眼压。进一步的研究还可以支持以前关于青光眼潜在病理机制的研究，尽管这种疾病广泛流行，但这些机制仍未完全了解。这些发现的意义可以为新的研究领域和新的潜在治疗目标（例如髓鞘再生策略）提供启示。
