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【Movement Disorders】浙江大学附属第二医院罗巍教授团队发现，原发性家族性脑钙化病新基因和致病机制

文摘 2024-10-03 19:18 上海

导读

原发性家族性脑钙化（PFBC）是一种以双侧基底节、小脑、丘脑、皮质、皮质下白质和其他脑区对称性钙化为主要影像特征的遗传性神经退行性疾病。患者可表现为帕金森症、共济失调、言语障碍、认知功能障碍和精神障碍等，也有部分患者终身无临床症状。

自 1850 年 Delacour首次报告基底节钙化病例以来，对颅内钙化的研究已持续 170 多年。2012 年，中国武汉科技大学刘静宇教授团队鉴定了 PFBC 第一个致病基因 SLC20A2。随后，国内外团队陆续鉴定了其他 PFBC 致病基因，迄今为止，已有 6 个PFBC 致病基因被鉴定，包括常染色体显性遗传的 SLC20A2、PDGFRB、PDGFB 和 XPR1，以及常染色体隐性遗传的 MYORG和 JAM2（2018年浙江大学附属第二医院的罗巍教授、岑志栋教授团队鉴定）。然而上述致病基因如何导致颅内钙化的形成，致病基因之间是否有功能上的相互联系仍不清楚。此外，目前已发现的致病基因并不能解释所有 PFBC 患者的表型，仍有超过一半的患者无法检测到已知致病基因的突变，这提示我们对未知致病基因的探索和鉴定具有重要意义。

2024年9月4日，针对原发性家族性脑钙化致病基因 NAA60 的鉴定和致病机制探索，浙江大学附属第二医院的罗巍教授、岑志栋教授团队最新研究成果以“A Homozygous Variant in NAA60 Is Associated with Primary Familial Brain Calcification”为题，发表在《Movement Disorders》杂志。

本研究在一个有3名PFBC患者的中国近亲家系中鉴定了NAA60基因内的致病突变c.460_461del（p.D154Lfs*113）。NAA60基因编码N-α-乙酰转移酶60（NAA60），这是一种定位在高尔基体膜的N端乙酰化跨膜蛋白。本研究的功能分析展示了这个突变破坏NAA60与两种PFBC相关蛋白PiT2（SLC20A2）和XPR1之间的相互作用，这两种蛋白对于磷酸盐转运至关重要。进一步的质谱（MS）分析表明，还有更多的NAA60乙酰化底物蛋白参与其中。结合Chelban等人最近确定NAA60是PFBC的新型致病基因的研究报告，本研究更进一步确认了他们的发现，并为PFBC提出了新的可能致病机制。

主要内容&结果

1.PFBC家系中NAA60基因致病突变c.460_461del (p.D154Lfs*113)的筛查

研究基于一个包含三名患者的中国近亲PFBC家系。家系先证者18岁男性（II-3）自五岁起经历反复癫痫发作，表现为每日3至10次的全身强直-阵挛性发作，丙戊酸钠治疗控制良好。他的脑CT扫描显示对称性钙化，钙化评分为34。其16岁兄弟（II-4）也有类似的癫痫症状，CT钙化评分为11。26岁姐妹（II-1）主诉有偏头痛，CT显示钙化评分为40。父母和其他姐妹无脑钙化表现。通过全基因组测序，研究者检测到在16号染色体上的NAA60基因内的突变c.460_461del (p.D154Lfs*113)，在家系内与疾病共分离。

图1 NAA60基因致病突变筛查和sanger测序验证图

2.NAA60 p.D154Lfs*113突变可能导致功能丧失

体外分析表明，c.460_461del（p.D154Lfs*113）导致了NAA60蛋白的延长，其C末端发生了改变，这对其在高尔基体上的细胞定位至关重要。在转染了突变NAA60-V5的HEK293T细胞中，与野生型NAA60蛋白相比，检测到分子量更高且表达水平较低的NAA60-V5蛋白。细胞色素C追踪实验显示，突变型NAA60在细胞内的降解速率明显高于野生型NAA60蛋白。免疫荧光研究表明，野生型NAA60与cis-Golgi标记物GM130共定位，而突变型NAA60则分布于细胞质和细胞核中。这些发现支持了p.D154Lfs*113突变可能导致NAA60功能缺失的假设。

图2体外功能实验验证突变蛋白的表达、位置、功能‍‍

3. NAA60功能缺失影响PiT2和XPR1的质膜含量水平，破坏Pi稳态

NAA60 主要乙酰化跨膜蛋白的N末端。为探讨NAA60突变对PFBC的影响，本研究探索了NAA60与已知致病基因（SLC20A2、PDGFRB、PDGFB、XPR1、MYORG和JAM2）编码蛋白的相互作用，发现PiT2、XPR1和PDGFRB是NAA60的候选底物。共免疫沉淀实验显示，野生型NAA60与PiT2和XPR1相互作用明显，而p.D154Lfs*113突变型与其的相互作用减弱。Western blot分析显示，NAA60 KO细胞中PiT2和XPR1的细胞膜水平显著降低。进一步测量细胞内磷酸盐浓度发现，NAA60 KO细胞的细胞内磷酸盐水平显著升高。这表明，NAA60功能缺失可能通过影响PiT2和XPR1的表达而干扰磷酸盐稳态，从而导致PFBC。

图3 NAA60功能实验验证蛋白的具体生物学基础和机制

4. NAA60功能缺失破坏多种膜蛋白底物可能是PFBC的一种新型致病机制

作为N-α-乙酰转移酶，NAA60对多种跨膜蛋白底物具有广泛影响。为研究NAA60功能缺失对其他跨膜蛋白的影响，本研究采用液相色谱-质谱联用（LC-MS）检测NAA60 KO细胞系与野生型细胞系之间膜蛋白的差异表达。结果显示55种膜蛋白表达量受影响，其中14种上调，41种下调。下调的膜蛋白中，JAM2、DDR2、CD73、ANK和还原叶酸载体（RFC）与脑钙化相关。功能试验进一步证明了RFC的细胞膜表达在NAA60缺失细胞系中显著降低。这些发现为NAA60功能缺失相关的PFBC病理机制提供了进一步证据，表明其多个膜蛋白底物受到影响，从而导致NAA60-PFBC的进展。

图4 功能实验表明NAA60功能缺失破坏多种膜蛋白底物导致NAA60-PFBC的进展

研究结论&讨论

本研究在一个近亲PFBC家系中鉴定出了NAA60基因的致病突变c.460_461del (p.D154Lfs*113)，所有患者均表现出发作性症状，如癫痫或偏头痛，特别是3名兄弟姐妹的大脑钙化表现出多发皮质下和皮质区域的特征。NAA60-PFBC患者的癫痫患病率为53.8%，显著高于其他基因突变患者。发作性症状和相关钙化在NAA60-PFBC患者中非常普遍，可能是该疾病的特征性症状。

NAA60编码的N-α-乙酰转移酶在调节膜蛋白乙酰化方面发挥重要作用。研究发现，NAA60可能影响其他PFBC致病基因编码的蛋白质的乙酰化，例如PiT2和XPR1，这些蛋白质与大脑的磷稳态有关。在NAA60功能缺失的细胞中，检测到这些蛋白的膜表面表达水平下降和细胞内磷稳态失调。进一步功能试验揭示了NAA60功能丧失可能导致多种膜蛋白（如RFC等）的乙酰化异常，从而参与致病机制。

总而言之，本研究鉴定了一个新的常染色体隐性遗传 PFBC 致病基因 NAA60，功能验证提示该基因纯合突变c.460_461del（p.D154Lfs*113）可能因功能丧失而致病。NAA60 功能丧失与磷转运蛋白细胞膜定位异常、细胞磷稳态失衡有关，并可能减少与脑钙化相关叶酸载体蛋白水平，提示 NAA60 基因功能丧失可能通过多种途径导致 PFBC。

团队介绍

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