抑郁障碍（depressive disorder）是指各种原因引起的以显著而持久的心境低落为主要临床特征的一类心境障碍。重度抑郁症（Major Depressive Disorder, MDD）是抑郁障碍最常见的类型，是一组发作性的、无明确病因的、以显著而持久的心境低落为主要临床特征的综合征，是导致人类自杀和精神残疾的首要原因。重度抑郁症（Major depressive disorder，MDD），其病因不清、病机不明，至今仍缺乏用于临床实践的诊断生物标志物。早期诊断对于有效管理和治疗重度抑郁症至关重要，早期识别和干预可以防止症状进一步恶化，避免从轻度或中度抑郁进展到重度抑郁，这能够显著提高治疗效果，从而减轻抑郁带来的精神痛苦和生活质量下降。环状RNA（circRNAs）是一类非编码RNA分子，与传统的线性RNA不同，它们形成了一个共价闭合的环状结构，这使得它们相对稳定，不易被RNA酶降解。circRNAs在血液样本中的稳定性和特异性使其成为潜在的生物标志物，用于多种疾病的早期诊断，尤其是circRNAs在大脑中表达丰富，与神经精神疾病的病理生理学有关，但它们在MDD中的具体临床意义尚未明确。
为了探索这一领域，东南大学附属中大医院张志珺教授研究团队联合南京医科大学生物统计学系赵杨教授课题组，2021年4月14日以“Potential clinical value of circular RNAs as peripheral biomarkers for the diagnosis and treatment of major depressive disorder”为题在《柳叶刀》旗下子刊《EBioMedicine》（IF = 9.7）在线发表了创新性研究结果。该文第一作者为张志珺教授课题组的师亚晨博士生，共同第一作者为宋睿泽博士生和王赞博士，张志珺教授和赵杨教授为该文的共同通讯作者。
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研究设计中包含了发现集和验证集。发现集采用极端性状策略，由7位高同质性的MDD患者和7位匹配的健康对照组成。验证集则包含包括53位MDD患者和52位健康对照。2. RNA文库构建和测序和候选RNA筛选、ceRNA机制分析：使用PAXgene blood RNA kit (Qiagen)保存全血样本、通过去除rRNA构建全转录组【mRNA、lncRNA、circRNA、microRNA】RNAseq 15G/miRNA 20M测序文库，并对全血样本进行了全转录组RNA测序以及内源性ceRNA机制分析，以识别差异表达的circRNAs。【Sequencing libraries were generated and RNA high-throughput sequencing was performed by Genesky Biotechnologies Inc. (Shang hai, China)上海天昊生物科技有限公司】在独立的验证集中，通过定量PCR等方法验证了发现集中的候选circRNAs的差异表达情况。本文中通过开展干预研究评估抗抑郁治疗对circRNA表达的潜在影响，特别是在重复经颅磁刺激 (rTMS) 治疗后。使用ELISA检测血清BDNF浓度，作为神经可塑性相关的指标。使用MRI采集脑部影像学数据，特别是ALFF值，以评估大脑活动和功能。通过构建ceRNA网络通路，分析circFKBP8和circMBNL1的下游可能机制以及功能通路证据。
在发现集中进行了涉及16259个环状RNA的高度通量测序，其中88个环状RNA被确定在7名重度抑郁症(MDD)患者与7名健康对照(HC)相比有显著差异（图1a）。接下来，选取了12个上调的环状RNA和3个下调的环状RNA，使用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)进行了验证（图1b）。最终，4个环状RNA在两组之间的表达有显著不同，并且与环状RNA测序的结果一致（图1c至f）。
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图1 全转录组RNA测序、筛选分析以及CircRNA表达谱
在独立验证集中（包括53名重度抑郁症患者和52名健康对照），除了血清BDNF水平以及HAMD-24、SDS和BHS评分外，MDD组和健康对照组在基线临床特征上没有显著差异。4个候选环状RNA进一步在验证集合中得到验证，与健康对照相比，hsa_circ_0050119在MDD患者中表现出显著降低的水平（p=0.001），而hsa_circ_0001349则显示出显著升高的水平（p=0.009）。根据参考基因组，推测hsa_circ_0050119来源于FKBP8基因的第5和第6外显子，而hsa_circ_0001349来源于MBNL1基因的第2和第3外显子。因此，hsa_circ_0050119被称为circFKBP8，hsa_circ_0001349被称为circMBNL1。此外，通过搜索发现集的RNA测序数据，与7名健康对照相比，7名MDD患者的circFKBP8宿主基因表达也显著下降，但circMBNL1宿主基因表达没有显著变化。
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图2 circRNAs的验证和临床应用
在MDD患者中，circFKBP8与BDNF水平呈正相关（图2c），而circMBNL1表达与HAMD-24和BHS评分呈负相关（图2d和e）。然而，在MDD患者中，circFKBP8或circMBNL1的表达与CTQ-SF、LES和BSI-CV-C评分之间没有显著相关性。此外，MDD患者的中介分析显示，circMBNL1表达显著介导了BDNF对HAMD-24评分的影响（图2f）。与健康对照相比，MDD患者在双侧背外侧上额叶皮质区域显示出ALFF值减少，在左侧中枕叶皮质、双侧颞下回、右侧颞中回、右侧眶部中前额叶皮质（ORBmid）、双侧前扣带回和腹侧ACC区域则显示出ALFF值增加（图2g，p<0.05）。进一步的相关分析表明，右侧ORBmid区域的ALFF值与HAMD-24评分呈负相关（图2h），并且在MDD患者中与circFKBP8和circMBNL1的表达呈正相关（图2i和j）。此外，图2k展示了circFKBP8和circMBNL1的AUC值分别为0.679（95% CI: 0.576-0.781）和0.647（95% CI: 0.540-0.754）。然而，将两种环状RNA组合使用时，诊断能力更强，AUC值为0.813（95% CI: 0.729-0.897），对应于诊断MDD的特异性为73.1%，敏感性为83.0%（图2k）。这表明circFKBP8和circMBNL1的联合使用可能成为诊断MDD的有效生物标记物。3. 临床实验 rTMS干预对circFKBP8表达的影响
在基线时，rTMS治疗组与假治疗组的HAMD-24评分没有显著差异。但是，在接受rTMS治疗后，两个治疗组的HAMD-24评分出现了显著区别。进一步地，实际rTMS治疗后，血清BDNF水平显著上升，而在假治疗前后血清BDNF水平无显著变化。治疗结束时，实际治疗组的血清BDNF水平比假治疗组显著升高。另外，在实际治疗组中，除了双侧内侧前额叶皮层和腹侧ACC以外，其他脑区在治疗前后的ALFF值有显著差异。而在假治疗组中，仅左下颞回和背外侧上额叶皮层在治疗前后ALFF值有显著变化。环状RNA circFKBP8在53位重度抑郁症患者完全接受rTMS干预后，其表达出现差异，实际rTMS治疗组circFKBP8的表达显著高于假治疗组。尽管在实际rTMS治疗组治疗前后circFKBP8表达量仅有上升的趋势（p = 0.054）。在实际rTMS治疗结束时，circFKBP8的表达与HAMD-24和SDS评分呈现显著的负相关，同时circFKBP8表达与血清BDNF水平及HAMD-24评分变化率呈正相关。然而，circFKBP8表达与所识别脑区的ALFF值并无显著相关性。此外，在实际rTMS治疗组中，HAMD-24评分的变化率与治疗后circFKBP8水平变化呈负相关。但在假治疗组中未检测到任何相关性。![]()
线性混合效应模型分析表明，基于三等分的circFKBP8表达变化值能够预测MDD患者治疗后HAMD-24评分的增加（图3g）。这意味着circFKBP8表达的变化可以作为预测rTMS治疗效果的一个指标。
4. circFKBP8和circMBNL1可能的生物学作用机制
基于观察到的显著差异表达的环状RNA(circRNA)、微小RNA(miRNA)和信使RNA(mRNA)，研究团队在发现集中构建了与circRNA相关的ceRNA网络（竞争性内源RNA网络）。随后，根据circFKBP8和circMBNL1分别建立了两个独立的ceRNA网络，其中包含14个miRNA和10个mRNA（图4a）。
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差异表达的mRNA，进行了GO（Gene Ontology）功能富集分析，以此来识别两个ceRNA网络相关的mRNA的潜在功能（图4b）。在GO富集分析的结果中，主要的生物过程术语包括非典型Wnt信号通路的负调控（GO: 2000051）、动粒组装（GO: 0051382）和异源抗原的处理与展示（GO: 0002480）。此外，针对两个ceRNA网络中各自10个mRNA的GO分析也显示，最富集的生物过程术语同样位于相同的途径中（GO: 2000051 和 GO: 0002480）。这表明circFKBP8和circMBNL1可能通过调控这些特定的mRNA参与调控非典型Wnt信号通路、动粒装配和异源抗原处理展示等生物过程。
本研究基于病例对照极端性状策略高通量筛选候选circRNAs，并基于独立大样本横断面验证、多层面临床表型测定分析及抗抑郁干预性研究，不同阶段/技术方法一致证实外周血circFKBP8或circMBNL1作为客观标记物在MDD诊疗中的潜在临床价值，为抑郁症的分子机制提供了新见解。本研究结果表明环状RNA可能通过调节神经炎症和神经可塑性，以及与情绪相关的大脑活动变化，参与MDD的发病过程。因此，circFKBP8和circMBNL1不仅可能成为识别潜在抑郁风险个体的预筛工具，而且circFKBP8尤其可能作为有价值的疗效指标，用于指导个性化的治疗决策。
总之，研究揭示了环状RNA作为生物标志物在MDD临床诊断和治疗监测中的潜在价值，为抑郁症的早期诊断和个体化医疗提供了新的视角和策略。尤其circFKBP8在抑郁发生中的功能验证课题组也在深入研究，并在近期发表了研究成果【Jiao J, Xu D, Kong Y, Cao Y, Wang L, Hong Y, Li L, Gao C, Liu J, Zhang G, Zhou J, Dai J, Lu Z, Liu Y, Wang Y, Zhang Z. circFKBP8(5S,6)-encoded protein as a novel endogenous regulator in major depressive disorder by inhibiting glucocorticoid receptor nucleus translocation. Sci Bull (Beijing). 2024 Jun 19:S2095-9273(24)00446-8. doi: 10.1016/j.scib.2024.06.021. Epub ahead of print. PMID: 38945750.】，更为MDD生物学诊断和靶向RNA药物研发提供了原创性、可靠性、持续性的临床研究和成果案例，研究团队从“临床的疾病”出发，“以患者为中心”，为抑郁症疾病和临床患者的治疗和干预方案提供科学依据和循证医学方案。张志珺，博士（英国Sheffield大学医学院PhD），主任医师，教授，东南大学首席教授，东南大学神经精神医学研究所所长，国家杰出青年基金获得者，享受政府特殊津贴，国家卫生计生突出贡献中青年专家，中国杰出神经内科医师，先后获得国家级科研项目20余项，排名第一的省部级一等奖4项，发表SCI收录论文300余篇，尤其围绕情感认知障碍诊断生物标记物筛选确定和发病机制研究与神经调控干预取得了系列创新成果，获得中国发明专利授权十余项，2014年始连续十次获得“中国高被引学者”，入围全球神经科学top2%影响力学者，全球top2%顶尖科学家榜单等。
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