1) 慢性睡眠剥夺（SD）对小鼠认知功能和突触相关蛋白的影响

水迷宫（MWM）实验：5天训练阶段，与对照组相比，睡眠剥夺组的小鼠表现出延长的逃避潜伏期，尤其是在第4天和第5天（图1A）。在空间探索实验阶段，慢性SD小鼠的表现也比对照组差，这反映在平台交叉次数较少（图1B）和在目标象限花费的时间百分比较低（图1C）。图1D显示了游泳路径的相应热图，对照组的小鼠在平台周围游泳，而慢性睡眠剥夺组的小鼠则在远离平台的区域周围游泳。

新物体识别测试(NOR)：与对照组相比，慢性睡眠剥夺组的识别指数显著降低（图1E）。通过蛋白质印迹法测定突触相关蛋白的水平，以研究小鼠的突触功能。蛋白质印迹显示，与对照组相比，睡眠剥夺小鼠的海马中的PSD95和PSD93水平降低（图1F）。

以上这些结果表明，SD可导致小鼠出现显著的认知缺陷。

2) SD对小鼠脑内NLRP3炎症小体和血脑屏障（BBB）活性的影响

采用WB和免疫荧光染色分别检测IBA-1、NLRP3和IL-1β在小鼠前额叶皮层和海马的表达水平。WB显示，与对照组相比，慢性睡眠剥夺组的IBA-1、NLRP3和IL-1β水平显著上调（图2A），同时，免疫荧光染色显示，睡眠剥夺小鼠海马中活化的小胶质细胞更加明显，IBA-1阳性细胞数量增加（图2C）

为了研究SD是否影响血脑屏障，我们分别通过WB和免疫荧光染色检测通透性标志物的水平。SD小鼠在前额叶皮层和海马中的Occludin、ZO-1和Claudin-5的表达显著低于对照组（图2B）。在内皮细胞中，PECAM-1（CD-31）定位于细胞间连接处，在内皮细胞的粘附中发挥重要作用。免疫荧光染色表明，与对照组相比（图2D），SD小鼠海马中CD-31的表达显著降低。

3) SD对小鼠肠道微生物群组成的影响

与对照组相比，SD组的肠道微生物群α多样性显著降低（图3A）。PCoA用于研究肠道微生物群落组成的相似性或差异性（β多样性），显示慢性睡眠不足小鼠和对照小鼠之间存在明显的差异（图3E）。

团队进一步分析了在不同分类水平上占据高丰度的差异分类群。在门水平上，与对照组相比，慢性睡眠不足组的厚壁菌门和变形菌门的丰度降低，而拟杆菌门的丰度升高。厚壁菌门和拟杆菌门是哺乳动物肠道中最常见的两个门，它们的比例（F:B）是群落变异的直接衡量标准。在慢性睡眠剥夺组中观察到F:B比率降低，这表明慢性SD可能会影响肠道微生物群的稳态。在属水平上，与对照组相比，慢性睡眠不足组的乳酸杆菌显著减少，臭味杆菌增加（图3B-D）。LEfSe分析确定慢性睡眠剥夺组和对照组之间存在显著差异的菌群（图3F）。这些结果表明，慢性SD可以减少细菌多样性，并有助于肠道微生物群组成的显著改变。

4) SD对小鼠肠道NLRP3炎症小体和肠道屏障活性的影响

为了评估肠道上皮屏障的完整性，通过WB测量结肠中紧密连接蛋白的表达。发现与对照组相比，SD小鼠结肠中Occludin、ZO-1和Claudin-5蛋白的表达显著降低（图4A）。免疫荧光染色进一步证实了SD小鼠结肠中ZO-1蛋白的下调（图4B）。在H&E染色的结肠切片中，SD的粘膜被炎症细胞浸润，杯状细胞数量减少，杯状细胞分泌的粘蛋白-2（MUC2）是粘液层中表达最丰富的粘蛋白，在形成肠道屏障中起着重要作用。MUC2的免疫荧光染色表明，与对照组相比，SD小鼠的粘液层的连续性被破坏，粘液层更薄（图4B）。通过测量外周血中脂多糖（LPS）的浓度，进一步证实了肠道通透性的增加，与对照组相比，SD小鼠表现出更高水平的LPS，这表明肠道上皮通透性的增加同时伴随着细菌产物的移位。SD外周血中炎症因子的表达上调，包括IL-1β、IL-6和TNF-α（图4C）

为了研究SD后肠道NLRP3炎症小体是否被激活，团队检测了小鼠肠道中NLRP3和IL-1β的表达水平。发现与对照组相比，SD组的NLRP3和IL-1β的表达显著上调（图4A）。这些发现表明，SD促进了小鼠肠道组织中NLRP3炎症小体的激活。

5）“SD微生物群”的移植会导致认知障碍和突触可塑性缺陷

通过将来自SD小鼠和对照正常睡眠小鼠的肠道微生物群分别通过灌胃法移植到用抗生素治疗的健康WT小鼠肠道中，观察后续表型以及行为和菌种的变化。

为了确定SD受体小鼠和对照正常睡眠小鼠之间微生物群群落结构的差异是否得以维持，在FMT 一周后对从受体小鼠采集的粪便进行16S rRNA测序。PCoA显示，正常睡眠受体小鼠微生物群和SD受体小之间存在明显的分离，相比之下，观察到相应受体和供体小鼠之间的相似性（图5A）。在MWM测试中，与对照小鼠相比，SD受体小鼠表现出更长的逃避潜伏期（图5B），平台交叉次数更少（图5C），并且在目标象限停留的时间更短（图5D，E）。蛋白质印迹显示，SD受体小鼠的前额叶皮层和海马中的PSD95和PSD93水平低于对照组（图5F）。

6) “SD微生物群”的移植诱导小鼠肠道NLRP3炎症小体的激活和肠道屏障的破坏

与对照组相比，SD受体小鼠的结肠中NLRP3和IL-1β的表达显著增加（图6A），紧密连接蛋白Occludin、ZO-1和Claudin-5显著下调（图6A、B）。睡眠剥夺受体小鼠的结肠切片的组织学分析显示，杯状细胞丢失，粘液层不连续且较薄，炎症浸润增加（图6B）。炎症因子包括LPS、IL-1β和IL-6在慢性睡眠剥夺受体小鼠的外周血中表达上调（图6C）。

7) “SD微生物群”的移植诱导小鼠大脑中血脑屏障的破坏和NLRP3炎症小体的激活

与对照组相比，在SD受体小鼠中，ZO-1、Occludin、Claudin-5和CD-31在前额叶皮层和海马体的表达水平下调（图7A，C），IBA-1、NLRP3和IL-1β的过度表达（图7B）。脑切片中显示出显著更高的IBA-1阳性细胞（图7D）。

8) SD引起的认知行为和病理变化在NLRP3-/-小鼠中表型恢复

与WT小鼠相比，在NLRP3-/-小鼠中前额叶皮层和海马中NLRP3和IL-1β水平极低。同时发现小胶质细胞活化的IBA-1表达水平和IBA-1阳性细胞数量也是显著下调（图8F）。相应地，NLRP3和IL-1β在NLRP3-/-小鼠的结肠表达极低（图8I）。此外，肠道屏障、血脑屏障的相关指标（Claudin-5、Occludin、ZO-1）、LPS和炎性细胞因子在NLRP3-/-小鼠中也是没有变化的（图8H、I、J）

总之，这些发现表明，NLRP3缺乏可缓解慢性SD患者的肠道屏障破坏、外周血清LPS和炎性细胞因子浓度以及血脑屏障损伤。

9) 敲低肠道或大脑中NLRP3保护认知功能

为了进一步研究NLRP3炎症小体分别在肠道和大脑中的作用，使用靶向NLRP3的腺相关病毒（AAV-NLRP3）载体分别敲除结肠和海马中的NLRP3。通过GFP的免疫荧光染色证实了向结肠和海马注射AAV-NLRP3的准确性。

团队通过腹膜内注射AAV-NLRP3来敲低结肠中的NLRP3。发现SD组与结肠-AAV-GFP小鼠相比，结肠-AAV-NLRP3小鼠表现出ZO-1、Occludin和Claudin-5蛋白水平增加，外周血中LPS水平显著降低，并伴有炎症因子IL-6和IL-1β降低（图9A、B），表明在结肠中敲低NLRP3可以逆转慢性SD中增加的肠道通透性。

同时，研究团队将AAV-NLRP3立体定向注射到海马体敲低NLRP3表达。与SD后的对照组相比，脑-AAV-NLRP3小鼠海马中IBA-1、NLRP3、IL-1β的表达水平下降，突触相关蛋白水平增加（图9J，K）。

综上，通过不同组织（肠道和大脑）功能和表型实验，证实NLRP3的激活在SD诱导的认知障碍中的重要功能。

1）首先本研究通过构建正常模型和SD模型小鼠，结合定量的表型实验确认SD可导致小鼠出现显著的认知缺陷。通过16s测序分析发现SD组的肠道微生物群α多样性显著降低，表明慢性SD可以减少细菌多样性并导致肠道微生物群的显著改变。

2）团队通过免疫荧光和H&E染色技术对结肠组织定量检测，发现NLRP3和IL-1β的表达显著上调，证实了肠道NLRP3炎症小体被激活。同时结合外周血中脂多糖（LPS）浓度的增加亦证实：SD小鼠的粘液层的连续性被破坏，肠道通透性的增加导致SD外周血中炎症因子的表达上调，包括IL-1β、IL-6和TNF-α。综上，肠道菌群改变导致肠道屏障通透性增加，相关可能的代谢产物进入血液后造成外周血中炎症因子的表达上调。

3）团队采用WB和免疫荧光染色对小鼠脑组织小鼠前额叶皮层检测IBA-1、NLRP3和IL-1β，证实脑组织中NLRP3炎症小体被激活。通过对通透性标志物检测发现Occludin、ZO-1和Claudin-5高表达证实了“SD微生物群”对小鼠脑内NLRP3炎症小体激活和穿透血脑屏障（BBB）。

以上，本研究通过严谨的科学设计以及正反向功能实验证实了“SD微生物群”-肠道屏障-血液炎症-血脑屏障（BBB）对于深入理解“肠-脑轴”机制提供了系统的理解和全新的见解。

总结展望

本文研究团队确定了肠道微生物群的改变可能是慢性SD的诱因或者结果，它通过激活肠道中的NLRP3炎症小体来诱导肠道屏障破坏，随后导致炎症因子的释放。外周炎症因子通过血脑屏障可以进一步激活中枢神经系统中的NLRP3炎症小体，从而加重突触功能障碍和认知障碍。

本研究基于小鼠模型的功能机制探讨，未来可能需要“多中心多阶段大样本”的临床真实人群数据随访和验证，为走向临床的应用转化提供坚实的基础。

总之，团队发现了NLRP3炎症小体是微生物群-肠道-炎症-大脑轴内的核心介质，肠道微生物群和NLRP3炎症小体可能是未来的潜在治疗靶点，更为后续临床的治疗和操作提供强有力的支撑和参考。

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