类风湿关节炎（RA）是一种复杂的自身免疫性疾病，以系统性的关节炎症为主要特征，最终可导致软骨和骨破坏以及严重残疾。目前大量研究通过全基因组关联研究（GWAS）和meta分析识别了RA的遗传易感性位点，但大多数研究仅建立了统计关联，尚未深入探讨遗传位点的功能机制。miRNAs是一类非编码RNA，通过与目标基因的3'UTR区靶向结合调节基因表达。研究表明，miRNA靶向结合位点的遗传多态性（poly-miRTSs）在多种疾病的发病机制中发挥着重要作用。
针对以上问题，近期苏州大学公共卫生学院雷署丰教授团队在Clinical Molecular Medicine （CME）杂志上在线发表了题为“Integrative Analysis Identified rs907091 at the miRNA Binding Region of the IKZF3 Gene as a Potential Functional Variant for Rheumatoid Arthritis”的研究论文。该研究通过整合分析探索了miRNA靶向结合位点的遗传多态性与RA间的关系及其潜在功能机制。
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1. 研究方法
该项研究首先从最近的大型 GWAS meta分析中下载了遗传变异与RA之间的关联结果，筛选亚洲人群中P值小于5E-8的显著SNP，重点关注miRNA靶向结合位点的调控变异。接着，利用MirSNP数据库验证这些SNP位点是否影响miRNA-mRNA结合。【MirSNP (http://bioinfo.bjmu.edu.cn/mirsnp/search/)是一个存档超过410,000个人类SNPs在预测的 miRNA-mRNA结合位点的数据库】通过表达量性状位点分析（eQTL）分析评估这些SNP是否会导致宿主基因的mRNA表达变化。根据识别的多miRTSs和相应的基因，可以在数据库中搜索并根据显著的eQTL结果来确定显著的配对。为了进一步分析已识别的相应基因的生物学功能，并协助选择后续分子实验的潜在位点，团队使用了数据库注释、可视化和综合发现集成数据库查询工具(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)进行了GO和KEGG基因富集分析。此外，还在Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes (STRING)数据库(https://string-db.org/)中进行了蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析，以探索已识别基因的潜在相互作用。在本研究中，使用了STRING 10.5在线工具来构建所需的置信度(组合分数)>0.4的PPI网络。AEI实验用于识别控制两个等位基因转录本之间基因表达的顺式调控SNP。为了验证候选SNP位点能否通过影响miRNA结合调控宿主基因表达，研究在由一个具有目标SNP杂合基因型的受试者的外周血混合样本中进行了AEI实验，样本包含1份基因组DNA和2份cDNA，使用实时荧光定量PCR后结合毛细管电泳来定量目标基因的SNP等位基因特异性转录本。计算两个等位基因之间cDNA定量的比率，然后根据同一受试者的DNA定量比率进行标准化。此外，为了深入探索已鉴定的基因对的功能链接，团队使用双荧光素酶报告基因检测来检测位于IKZF3基因3'-UTR中的rs907091 SNP是否通过miRNAs调节IKZF3的表达。【首先，团队从IKZF3基因的3'-UTR中克隆了SNP周围的601 bp区域，并通过PCR扩增两个分别对每个等位基因纯合的个体的基因组DNA生成代表rs907091的T和C等位基因的插入片段。然后，将目标片段连接到双荧光素酶报告质粒载体PmirGLO（Promega, Wisconsin, USA）中。最后，连接好的载体在37°C培养16小时后转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，通过抗生素抗性选择阳性克隆，并通过PCR扩增和质粒的限制性消化进一步确认。在转染前通过DNA测序验证了质粒的构建序列。在无抗生素的DMEM中补充10% FBS的条件下，293T细胞在96孔兼容板中于37°C和5% CO2中培养，用于瞬时转染报告基因检测。使用LipofectamineTM 2000转染试剂（Invitrogen, CA, USA）将质粒和miRNAs转染到293T细胞中。将荧光素酶值标准化为海肾荧光素酶值以调整转染效率。所有实验重复三次，每个等位基因包括五个生物学重复。】该研究从亚洲GWAS下载的数据中筛选出11,186个显著SNP（P＜5E-8）进行功能注释，并在MirSNP数据库中发现了253个重叠SNP以用于后续eQTL分析。通过eQTL数据库，确定了114对SNP-宿主基因配对，这些基因大多位于HLA区域，涉及RA等自身免疫疾病。其中，28个宿主基因富集于多种免疫相关以及自身免疫疾病相关通路中。进一步的PPI分析显示，候选的宿主基因形成了一个复杂的调控网络，主要包括HLA区域基因和三个小型网络基因（IKZF3、GSDMB、ORMDL3）（见图1）。
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图1 eQTL分析的28个基因的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）分析
此外，根据调控多态性在miRNA靶点位点（poly-miRTSs）中，识别出了32对SNP位于它们的eQTL基因的3'UTR中的配对，这些配对来自上述的114对，对应于32个独特的SNP和5个基因。其中HLA-DPB1是最常观察到的目标eQTL基因（27个SNP），而rs907091是唯一一个位于非HLA区域的poly-miRTS（17条染色体）。团队最终选择了rs907091和IKZF3这对进行功能验证，原因如下：rs907091在IKZF3的3'UTR中的物理位置，LCLs中显著的顺式eQTL（eQTL效应值：62.12），显著的GWAS关联（P=3.9E-08），IKZF3与自身免疫疾病（例如系统性红斑狼疮）相关的已知功能，以及相应的miRNAs（miR-326和miR-330-5p）同时被TargetScan、miRanda、PITA和miRTarBase预测。在32对具有miRNA靶位点调控的SNP位点中，研究选择了IKZF3基因miRNA结合区的rs907091位点进行功能验证。AEI实验结果表明，rs907091位点的C等位基因表达量比T等位基因表达量高约18%，表明该位点存在等位基因表达不平衡现象。双荧光素酶报告基因实验显示，miR-326或miR-330-5p刺激后，C等位基因的荧光素酶活性显著高于T等位基因（P＜0.05）（见图2）。![]()
图2 IKZF3基因3'非翻译区中rs907091位点的双荧光素酶报告基因检测
该项研究探讨了poly-miRTSs与宿主基因间关联的潜在作用机制，发现IKZF3基因miRNA结合区的rs907091位点是RA的潜在功能性遗传位点。在miR-326和miR-330-5p的调控作用下，rs907091 C＞T变异可能通过上调 IKZF3 的表达参与RA的发生发展（图3）。该研究为包括RA在内的复杂人类疾病的分子功能遗传机制提供了新的见解。![]()
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