实验方案&设计
主要内容&结果
研究结果1: 严重急性肺炎导致脑部神经系统疾病
为了避免外源性病原体的干扰，本研究建立了LPS诱导的急性肺炎模型来研究小鼠的神经系统疾病（图1A)。结果发现，在LPS处理后第30天，小鼠的体重、肺内血氧饱和度和细胞因子水平均逐渐恢复正常（图1B到F）。为了测试这些小鼠是否患有神经系统疾病，测试从肺炎中恢复的小鼠的行为。发现与未处理LPS的小鼠相比，LPS处理恢复后的小鼠表现出类似焦虑的行为（图1G到K)，认知能力和短期记忆受损（图1L到N)，空间记忆能力下降（图1O和P），对行为和运动功能有长期影响。此外，对恢复小鼠海马中小胶质细胞和星形胶质细胞中Aβ蛋白的免疫荧光证实了这些细胞的功能改变（图1Q到T)。小胶质细胞分支长度和数量的减少表明小胶质细胞处于活化状态（图1U和V)。值得注意的是，肺炎后小鼠脑组织中的炎症标志物下降，但它们仍然高于基线（图1W到Y)。这些数据表明，脑功能缺陷是从重症肺炎中恢复的小鼠的共同特征。
图1 严重急性肺炎会导致大脑神经系统疾病
研究结果2：急性肺炎期间的小鼠大脑中检测到细菌存在
为了探究大脑稳态的改变是否是由肺微生物组的影响引起的，本研究收集全脑和肺组织，匀浆化并在LPS处理后的不同时间点接种在LB板上（图2A)，然后进行CFU测量（图2B到E)。在LPS处理之前，未在小鼠的大脑中检测到菌落。出乎意料的是，却在LPS处理后的第1天就观察到脑组织中出现细菌菌落，第7天出现增加，然后在肺炎后30天内逐渐减少，但并未完全消除（图2B和C)。肺炎缓解全期肺组织中细菌CFU无明显变化（图2D和E)。
为了确认脑组织中细菌的存在，研究者将小鼠肺和脑组织样本送（Genesky Biotechnologies Inc, Shanghai,上海天昊生物）进行微生物16S扩增子测序检测（V3-V4区）。结果发现，在门和科分类水平上，大脑和肺中菌群物种之间的相对丰度相似（图2H和I)，表明大脑中新出现的细菌可能起源于肺部（图2J)。此外，粪便微生物群和脑微生物群的组成存在显著差异，这表明大脑中的微生物不太可能来自肠道。这一系列实验表明，肺炎后起源于肺部的细菌可以侵入大脑。
通过抗生素鸡尾酒处理消除小鼠体内细菌，然后再以LPS诱导肺炎（图2K)。结果证实接受抗生素处理的小鼠的脑组织没有任何细菌（图2L)。当LPS处理后30天肺部炎症消退时，无菌小鼠的脑部炎症也恢复到基线（图2M 和N)。大脑海马体的免疫荧光图像显示小胶质细胞和星形胶质细胞中的Aβ蛋白含量没有明显增加（图2O到R），表明这些细胞没有功能失调。这些结果表明，大脑的改变与入侵的细菌有关。
图2 在急性肺炎期间在大脑中观察到细菌
研究结果3：急性肺炎期细菌从肺部转移到大脑，与肺和脑通透性增加有关
为了确定细菌从肺转移到大脑的机制，研究者分析了高分子量荧光素异硫氰酸酯偶联葡聚糖（FITC-DXT）在肺炎后小鼠中的扩散，在LPS诱导的肺炎小鼠模型中，研究者发现早在注射2小时后，就观察到DXT在脑组织中的积累（图3A~D），并且发现BBB通透性的程度与肺炎反应的程度有关。此外，LPS的剂量也与行为障碍相关。
接下来，研究者在肺炎后 1 天检查了肺和脑中的血管内皮屏障和上皮屏障。LPS处理后第1天，PV1在肺和脑中的表达显著增加（图3E至J），表明血管屏障被破坏。在LPS处理后第30天，肺和脑中的PV1表达恢复到基线水平（图3E至J），表明当时血管屏障是封闭的。接下来研究者检测了紧密连接蛋白闭锁小带-1（ZO-1）。观察到 LPS 处理后第1天和第30天 ZO-1 水平下降，表明肺和大脑中上皮屏障的紧密连接功能障碍长期存在（图3E至J)。肠道微生物群的生物量明显高于肺微生物群。为了进一步证明大脑中新出现的细菌不是来自肠道微生物组，团队在肺炎后第1天检查了肠道通透性。结果显示肠道通透性没有明显变化，这些结果证实了本研究假设，即肺血屏障和血脑屏障在肺炎期间都是渗漏的，允许内源性细菌从肺转移到大脑。
图3 重症急性肺炎可导致脑和肺通透性改变
研究结果4：脑组织单细胞测序细胞类型和聚类，以及关键通路基因和可能靶点
为了进一步表征患有神经系统疾病的小鼠的大脑微环境，肺炎恢复的小鼠的脑组织进行了单细胞RNA测序，对细胞进行聚类。这些簇被分成七个“元簇”，包括星形胶质细胞、小胶质细胞、少突胶质细胞、T 细胞、单核细胞、神经元和粒细胞 （图4A和B）。此外，脑组织有明显的单核细胞浸润，提示神经炎症。KEGG分析中观察到与沙门氏菌感染途径的关联。此外，如火山图所示，与细菌感染途径相关的基因（Rhog、Il1a、Arf1等）的表达显著上调（图4E)。这些数据进一步证实了细菌存在于大脑中。研究者通过流式细胞术验证，小鼠大脑中LPS相关受体CD14的表达在第30天显著增加（图4G和H），表明存在对脑组织中细菌的炎症免疫反应。此外，与LPS信号通路相关的基因（Myd88、Ticam2、Ly96、Tlr4、Nfkb1等）均上调（图4I和J)。与细菌感染途径相关的基因（Jun、H2-DMa、Cd14、Il1a、Ctsd、Fcgr3、Fcer1g、Fos等）表达增加主要分布在小胶质细胞和星形胶质细胞中，这是介导神经炎症的两种主要细胞类型（图4J）。
图4 脑组织单细胞类型和聚类
图5 星形胶质细胞和小胶质细胞功能障碍
研究结果4：雷帕霉素可挽救脑稳态和神经系统疾病
雷帕霉素（RAPA）广泛用于选择性mTOR抑制。在之前的研究中，研究者证明了血小板衍生细胞外囊泡 （PEV）可以作为选择性靶向各种炎症细胞和组织的通用方法 (图6C)。
图6 RAPA-PEVs的表征和脑部积累分析
图7 RAPA-PEVs的治疗效果
研究意义与展望
【Schizophrenia Bulletin】抗精神病药物所致便秘患者血清代谢谱变化及其与肠道微生物群的关系
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【Nat Commun】陆军军医大学唐波团队多组学分析发现，脆弱拟杆菌抑制 FXR 信号导致肝内胆汁排泄中断造成妊娠胆汁淤积症
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【Sci Adv】重型抑郁症肠道菌群联合代谢图谱揭示抑郁症发病机制与进展
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【Nature Medicine】聚焦肠道微生物和癌症的关系以及个性化干预方案！
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