股骨头坏死，又称股骨头缺血性坏死，由于股骨头血供中断或受损，引起骨细胞及骨髓成分死亡及随后的修复，导致股骨头结构改变，股骨头塌陷，主要表现为患侧髋部疼痛、无法活动。据统计，我国的股骨头坏死患者有750～1000万左右，每年新增病例高达30万，多见于30～50岁人群，约有半数累及双侧股骨头。股骨头坏死常见原因可分为创伤性和非创伤性，非创伤性股骨头坏死患者累积已达812万，男性患病率（1.02%）显著高于女性（0.51%），北方居民患病率（0.85%）高于南方居民（0.61%），城镇居民高于农村居民，糖皮质激素、酒精、高血脂、肥胖、高危职业（潜水员）、吸烟、糖尿病等均为非创伤性骨坏死的风险因素。股骨头坏死患者如果在早期没有及时有效的治疗，80%的患者在20年内会出现股骨头塌陷和终末期退行性关节疾病，最终需要全髋关节置换术。临床上，部分患者因长期使用激素治疗而多发于股骨头坏死，全身糖皮质激素（GC）诱导的成骨抑制和骨细胞凋亡促进发病进而造成激素性股骨头坏死 。有文献报道，GC破坏骨骼血管生成并诱导内皮损伤，从而减少股骨头的血液供应，最后导致骨细胞死亡和骨结构破坏。但是，GC诱导参与股骨头坏死的发展具体机制过程和机制不明。肠道微生物群(GM)是维持动物和人类健康的重要共生伙伴。GM的组成和多样性可被多种宿主内在因素(例如年龄、宿主健康状况和遗传等)和宿主外在因素(例如生活方式、药物使用和饮食等)改变，可扰乱宿主的生理稳态并导致各种疾病。最近的证据也显示了骨稳态和GM之间的联系，然而，目前没有证据揭示GM在GC诱导的骨坏死发展中的作用。
针对以上科学和临床问题，中南大学湘雅医院骨科谢辉教授团队的研究成果，在国际顶级期刊《Science Advances》（IF = 11.7）上发表成果，研究发现糖皮质激素可诱导宿主肠道有益细菌产生变化，并通过被细胞外囊泡内吞、包裹、通讯、转移至靶器官诱发促进股骨头发病和坏死，揭示“肠-骨轴”调控模式具体途径、方法和路径机制。
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外泌体（Exosomes）又被称为细胞外囊泡（EV，Extracellular vesicles），几乎可以被所有细胞分泌，并且可以从人体中不同体液（包括唾液、尿液、血浆、汗液、泪液、乳液等）中分泌和被检测到。外泌体包括细菌、真菌、蛋白质、脂质、miRNA 和其他RNA等分子物质，同时能够将这些生物信号和Biomarker从一种细胞或组织传送到另一种细胞或组织，是细胞间和器官内相互交流的重要组成中转站。![]()
外泌体将其分子载体转移到受体细胞以调节细胞、组织、器官功能。外泌体与细胞的功能性通信可能涉及几种类型的相互作用，包括:1）在细胞外空间释放外泌体内容物;2）外泌体与受体细胞表面结合外泌体质膜融合;3）通过外泌体与靶细胞对接形成的连接蛋白通道直接转运产物;4通过内吞作用摄取。![]()
EVs通过包裹、内吞、释放细菌，并使细菌能够通过向宿主细胞运送分子物质来调节宿主功能，从而与宿主细胞进行交流。到目前为止，关于GM是否可以通过转移特定的细菌源性EVs来影响股骨头的骨稳态还缺乏证据。1.1 构建小鼠模型（接受GC治疗vs不接受）模拟临床环境中GC诱导的ONFH（每周的前3天给3个月大的小鼠大腿肌肉注射甲泼尼龙（MPS）(20 mg/kg/d)，持续处理3周，DMSO处理的小鼠作为健康对照）。1.2 健康和治疗小鼠共养实验，评估健康小鼠GM对ONFH的影响。小鼠粪便样本16S rRNA绝对定量测序分析：用于评估GC诱导的ONFH小鼠模型肠道微生物特征的变化以及小鼠共养是否可以恢复GC导致的肠道乳杆菌减少。【Genesky Biotechnologies, Inc., Shanghai, China；上海天昊生物科技有限公司完成，天昊生物Accu16S 细菌绝对定量测序技术通过对样本质量检测、目的区域预扩增添加spike-in DNA、文库构建与质检、样本上机测序实现：1）避免相对定量因人工“抽平数据”带来的假阳性结果；2）无需传统qPCR方法针对单个基因定量繁琐步骤；3）更精确和灵敏检测低丰度所有菌种的拷贝数量变化；】目标菌群qRT-PCR：检测粪便样本中特定微生物的DNA水平，包括Lactobacillus animalis的16S rRNA基因序列。组织切片与染色：使用4%多聚甲醛固定、EDTA脱钙、苏木精和伊红（H&E）或DAPI染色等技术制备股骨头组织切片。免疫荧光标记：使用针对L. animalis-EVs的抗体检测胞外囊泡在股骨头的运输和分布。L. animalis-EVs摄入实验：使用DiO标记的L. animalis-EVs与不同类型的细胞共孵育观察EVs的摄取情况。血管成管试验：使用生长因子减少的Matrigel评估L. animalis-EVs和L. reuteri-EVs对内皮细胞血管生成的直接影响。通过对L. animalis-EVs进行蛋白提取和酶解，随后使用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行蛋白质鉴定和定量。利用MaxQuant软件处理MS/MS数据，进行GO和KEGG途径富集分析，以理解差异表达蛋白质的功能。1. 与健康小鼠共养可防止GC处理过的同笼小鼠出现ONFH
研究表明，共养小鼠可通过粪食作用将GM转移给同笼小鼠导致表型相互转移。为了确定GM的交换是否会影响小鼠股骨头的骨稳态，研究者对接受MPS处理的小鼠与对照小鼠进行分析(图1)。
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图1 与健康小鼠共养可预防GC处理过的同笼小鼠出现ONFH
μCT分析显示，用MPS处理会导致小鼠股骨头出现大面积低密度区(坏死性病变)和显著的骨丢失 (图1B)，以及骨小梁体积分数(Tb. BV/TV)、小梁厚度(Tb. Th)和小梁数量(Tb. N)显著降低和小梁分离 (Tb. Sp)的显著增加(图1C-F)。MPS处理的ONFH小鼠与DMSO处理的正常小鼠共养，使得处理小鼠股骨头骨小梁微结构的显著改善。
苏木精-伊红(H&E)染色显示，在大多数MPS处理的小鼠的股骨头中，骨小梁和骨髓结构等被严重破坏(图1G)。与非共养的MPS处理的小鼠相比，与DMSO处理的对照小鼠共养的MPS处理的小鼠显示出更轻微的骨小梁和骨髓损伤，以及股骨头中更少数量的空骨细胞陷窝。然而，在与MPS处理的小鼠共养的DMSO处理的小鼠的股骨头中没有发生有害的组织学变化(图1G)。
基于μCT的微血管造影和内皮细胞标记蛋白CD31的免疫组织化学染色显示，与年龄匹配的对照小鼠共养显著缓解了MPS诱导的股骨头血管减少，如血管的μCT重建图像(图1H)、血管体积(图1I)和CD31染色的内皮细胞数量(图1J和K)的增加所示。骨钙素的免疫染色（OCN，成骨活性的标记物）显示，在MPS注射后，小鼠股骨头中OCN阳性成骨细胞显著减少，而当MPS处理的小鼠与对照处理小鼠共养时，成骨细胞数量的减少并不显著(图1L和M)。TUNEL染色显示，MPS引起的小鼠股骨头和骨髓内细胞凋亡显著增加，但该作用因与对照小鼠共住显著抑制(图1N和O)。
上述发现表明，与健康小鼠共养对股骨头的保护作用与刺激血管生成，以及与成骨反应和/或预防GC诱导的凋亡细胞死亡有关。
通过每周口服一次来自健康小鼠的GM，来研究是否会对股骨头产生类似的有益作用(图2A)。正如预期的那样，股骨头的μCT图像和松质骨微结构参数显示，通过移植来自对照处理的健康小鼠的GM，使得由MPS诱导的骨质破坏产生显著逆转(图2B-D)。
总的来说，这些发现表明来自健康小鼠的GM含有能够通过促进血管生成、增强成骨和/或抑制细胞凋亡来对抗GC诱导的ONFH的微生物。![]()
图2 来自正常小鼠的GM缓解由GC诱导的ONFH
3. 与健康小鼠共养减缓了GC诱导的Lactobacillus animalis菌的损失
为了探索来自健康小鼠的GM对GC诱导的ONFH保护作用的微生物，研究者收集了来自MPS或对照处理雄性小鼠的粪便样品，进行16S rRNA绝对定量扩增子测序，以评估这些小鼠肠道微生物的变化。结果显示，MPS处理导致粪便微生物群中观察到的OTUs数量和多样性指数(Chao1和ACE)呈下降趋势，但在与对照处理的小鼠共养的MPS处理小鼠粪便中，群落丰度的下降被逆转（图3A）。与对照处理的健康小鼠或MPS处理的小鼠共养导致其大多数同笼小鼠中粪便总细菌的绝对丰度增加(图3B)，这表明共养导致的GM转移改变了对照小鼠和MPS处理的小鼠中的总微生物丰度。在属水平上，与对照处理的小鼠相比，用MPS处理导致乳酸杆菌属（Lactobacillus）的相对和绝对丰度减少。但是通过对照处理后，由MPS诱导的乳酸杆菌绝对丰度的损失被显著减少(图3B-C)，表明共养可能导致乳酸杆菌属中的细菌从健康对照小鼠转移到MPS处理的同笼小鼠中。在物种水平上，与对照处理相比，MPS处理的小鼠的粪便微生物群中的动物乳杆菌（L. animalis）和肠乳杆菌（Lactobacillus intestinalis）减少(图3D)。然而，与非共养MPS处理的小鼠相比，L. animalis的相对和绝对丰度仅在一些共养MPS处理的小鼠中增加，并且在共养和非共养对照处理的小鼠中相当(图3D)。然后，研究者在使用qRT-PCR来比较对照和MPS处理的小鼠粪便微生物群中L. animalis的丰度时发现，在诱导后1周，MPS诱导L. animalis的丰度显著降低，并且在处理后2周和3周，L. animalis维持在非常低的水平(图3E)，这进一步表明GC施用后L. animalis的生长和/或存活受到抑制。
这些结果表明，L. animalis可能是介导来自健康小鼠的GM对GC诱导ONFH的骨保护作用的关键有益微生物。
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图3与健康小鼠共养缓解了GC诱导L. animalis的损失，移植L. animalis可防止GC诱导的ONFH
4. 用L. animalis移植可防止GC诱导的ONFH
研究者通过口服法持续6周，每周移植一次L. animalis，看是否能够保护小鼠免于GC诱导的ONFH(图3F-P)。经口服L. animalis后，健康小鼠表现出显著更高的血管和成骨细胞丰度以及股骨头中更低数量的凋亡细胞(图3M-P)。这些发现表明，在正常或GC诱导的骨坏死条件下，L. animalis可以促进血管形成增加骨生成，抑制细胞凋亡并改善股骨头的骨小梁微结构。5. 肠道L. animalis外囊泡（EVs）对血管生成、成骨和凋亡的直接作用
接下来，研究者从L. animalis的培养基(CM)中分离出EVs，并研究这些EVs(L. animalis -EVs)对血管生成、成骨和凋亡的直接作用。通过透射电子显微镜(图4A)和粒径分析(图4B)发现，L. animalis-EVs为直径为118.8-49.5nm的杯状结构，纳米粒子追踪分析还显示，来自不同批次的100 μg L. animalis-EVs中的囊泡数量在(3.7-4.6) × 1010个(图4C)。L. animalis-EVs用亲脂性染料DiO(绿色)或DiI(红色)标记，并与人微血管内皮细胞(HMECs)、小鼠长骨骨细胞-Y4 (MLO-Y4)、小鼠前成骨细胞MC3T3-E1细胞和小鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)一起孵育3小时，DiO-或DiI-标记的L. animalis-EVs可以被这些细胞吸收并在核周区域积累，这表明L. animalis-EVs可能直接调节它们的功能（图4D）。
成管试验显示，MPS显著削弱了HMECs在CM上形成毛细血管样网络结构的能力，如HMECs在光学显微镜下的图像所示，并且与载体处理的对照细胞相比，MPS处理的细胞中的总环数和总管长度的值低得多(图4E-G)。此外，在MPS处理的内皮细胞中，L. animalis-EVs还在对照处理的正常内皮细胞中表现出显著的促血管生成作用，如HMECs的管形成图像(图4H)和与对照细胞相比总环数和总管长度值显著增加(图4I-J)所示。
茜素红S (ARS)染色表明，MPS处理显著抑制了BMSCs在成骨分化下的矿化结节形成。用L. animalis-EVs孵育不仅显著阻断了MPS诱导的对BMSC成骨分化的负面影响，而且还诱导了在载体处理的正常组中BMSC矿化的进一步增加(图4K-L)，表明L. animalis-EVs可以直接刺激BMSC成骨。
CCK-8分析显示，与L. animalis-EVs或L. reuteri-EVs的共处理完全阻断了MPS诱导的HMECs、MLO-Y4、MC3T3-E1和BMSCs存活/生长的降低(图4M-P)。L. animalis-EVs对HMECs、MLO-Y4和MC3T3-E1的保护作用与L. reuteri-EVs的相当 (图4M-O)。在MPS处理的BMSCs中，L. animalis-EVs对细胞存活/生长的积极作用显著高于L. reuteri-EVs (图4P)。TUNEL染色表明，L. animalis-EVs和L. reuteri-EVs都可以显著减弱MPS诱导的这些细胞的，表明对凋亡的直接抑制有助于它们对GC诱导的细胞死亡的保护作用。在MPS处理的MLO-Y4和BMSCs中，L. animalis-EVs的抗细胞凋亡作用远高于L. reuteri-EVs (图4Q-R)。
上述结果表明，L. animalis-EVs可以进入内皮细胞和骨细胞直接增强内皮血管生成，增加BMSC成骨并防止GC诱导的凋亡细胞死亡。此外，动物乳杆菌EVs还可以刺激内皮细胞和骨细胞分泌促血管生成因子。
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图4 L. animalis-EVs直接促进血管生成、增加成骨并减少细胞凋亡
6. L. animalis-EVs进入股骨头并减轻GC诱导的股骨头坏死
为了研究L. animalis-EVs处理是否可以在GC诱导的ONFH小鼠中诱导骨受益，研究者首先评估了这些细菌EVs在胃内给药后是否可以转运到GC诱导的小鼠的股骨头。离体荧光成像显示，在通过口服途径用DiR碘化物标记的L. animalis-EVs治疗3小时的小鼠的许多组织中存在荧光信号，其中肝、脾、肺、胃肠、肾和骨显示出比其他组织高得多的荧光强度(图5A-B)，这表明L. animalis-EVs在口服给药后主要积聚在这些部位。在给药后3小时，股骨头显示出大面积的红色荧光信号，表明大量的L. animalis-EVs可以进入股骨头。给药24小时后，上述具有高水平L. animalis-EVs积累的大多数组织中的荧光强度显著降低(图5A-B)。处理72小时后，在用DiR标记的L. animalis-EVs口服处理的小鼠中，大多数组织显示出低荧光强度(图5A-B)，这表明在给药72小时后，大多数L. animalis-EVs被受体小鼠代谢和利用。然后，通过在股骨头的小梁骨和骨髓中存在绿色荧光信号来证实股骨头内细胞对L. animalis-EVs的摄取，所述绿色荧光信号来自通过经口服接受DiO-标记的L. animalis-EVs达3小时的小鼠，而非来自对照处理的小鼠(图5C)。研究者还使用L. animalis-EVs免疫兔子，并获得含有靶向L. animalis-EVs的特异性抗体的血清，以进一步确定每周一次口服给予L. animalis-EVs或其载体(PBS)达3周的载体或MPS处理的小鼠的股骨头中这些EVs的存在和丰度(图5D)。如图5 (E和F)所示，在对照载体处理的对照小鼠的股骨头中观察到一定量的荧光(图5E-F)。MPS处理导致股骨头中荧光信号的显著丧失，但是在口服施用L. animalis-EVs的MPS处理的小鼠中荧光显著增加(图5E-F)，这表明L. animalis-EVs可以在生理条件下运输到宿主股骨头，并且通过口服途径外源性施用L. animalis-EVs可以挽救MPS诱导的这些EVs的减少。
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图5 L. animalis-EVs进入股骨头并减轻GC诱导的股骨头坏死然后，研究者想确定在GC诱导的早期阶段每周一次口服L. animalis-EVs持续6周是否足以减弱GC诱导的ONFH(图5D-P)。结果表明，L. animalis-EVs可以通过增加血管丰度、增加成骨活性和减少细胞凋亡来改善骨微结构和预防GC诱导的ONFH。
接下来，研究者测试了L. animalis-EVs及L. animalis对GC诱导ONFH的小鼠股骨头微结构的影响。μCT分析显示，L. animalis-EVs和L. animalis都不能显著逆转已经由MPS诱导股骨头坏死的小鼠的骨小梁损伤和骨丢失，这表明在股骨头坏死的晚期用L. animalis-EVs和L. animalis治疗不能诱导对股骨头骨的明显益处。7. L. animalis-EVs和L. animalis的蛋白质组学分析
应用无标记蛋白质组分析来表征和定量L. animalis-EVs和L. animalis中的蛋白质。在L. animalis-EVs和L. animalis中总共鉴定了1136种蛋白质，其中340种蛋白质被定量(图6A)。总的来说，与L. animalis相比，L. animalis-EVs中有74种蛋白质高得多，140种蛋白质低得多(图6B)。相对于L. animalis，L. animalis-EVs中前10个最丰富的蛋白质显示在图6C中。进行GO注释以根据其亚细胞定位对相对于L. animalis高度富集于L. animalis-EVs中的蛋白质进行分类。如图6D所示，其中25.68%来自细胞质，18.92%被注释为细胞质膜蛋白。47.30%的蛋白质的亚细胞定位未知，其余的蛋白质来自细胞壁(6.75%)或胞外(1.35%)(图6D)。对上调蛋白的GO生物过程富集分析表明，L. animalis-EVs富含参与中性氨基酸、有机酸跨膜、L-氨基酸等转运的蛋白 (图6E)，支持了EVs作为细胞间重要的细胞物质转运体的观点。L. animalis-EVs还富含与核苷二磷酸磷酸化、核苷酸磷酸化或核苷二磷酸代谢过程相关的蛋白质(图6E)，表明L. animalis-EVs在细胞代谢中的功能作用。KEGG途径富集分析显示，与L. animalis相比，L. animalis-EVs中上调的蛋白质涉及核苷酸结合寡聚化结构域(NOD)样受体信号途径、磷酸转移酶系统、b-内酰胺抗性或三磷酸腺苷结合盒(ABC)转运蛋白(图6F)。![]()
图6 L. animalis-EVs和L. animalis的蛋白质组学分析
1） 本研究通过16S rRNA绝对定量测序技术分析发现不同小鼠模型肠道微生物特征的变化，发现Lactobacillus animalis菌相对、绝对丰度均减少。2） 通过小鼠共养实验发现来自健康小鼠的微生物菌群L. animalis可以促进血管形成增加骨生成，抑制细胞凋亡并改善股骨头的骨小梁微结构。3） 通过体外功能培养基实验发现并分离出EVs，揭示肠道菌群L. animalis被细胞外囊泡（EVs）包裹、通讯、转移至股骨头器官；通过口服途径外源性L. animalis-EVs可挽救MPS诱导的这些EVs的减少。总之，本研究发现L. animalis通过被细胞外囊泡EVs内吞、包裹、通讯、转移至靶器官通过增加血管丰度、增加成骨活性和减少细胞凋亡来改善骨微结构和预防GC诱导的股骨头坏死，详细揭示肠道菌EVs介导的“肠-骨轴”调控模式具体途径、方法和路径机制。为下一步精准靶向调节肠道微生物组来预防和治疗此类疾病提供了新的见解和潜在治疗策略。
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