造血干细胞（HSCs）每天为血液系统提供约2800亿个细胞，这得益于它们自我更新和多谱系分化的能力。由于HSCs具有长期重建潜力，造血干细胞移植（HSCT）已成为多种血液和免疫疾病的有效治疗方法。因此，明确HSCs在稳态及应激条件下自我更新能力背后的调控机制显得尤为重要。近期研究表明，包括久坐不动的生活方式、烟草使用、酒精摄入、饮食代谢物、空气污染物等因素，在损害HSCs自我更新能力中发挥关键作用，并成为异基因HSCT后重建失败和移植物抗宿主病（GvHD）的风险因素。然而，这些环境因素在调控造血作用中的具体角色及机制仍大多未知。微塑料（MPs），定义为长度小于5毫米的塑料纤维、颗粒或薄膜，源自塑料废物的分解或为特殊用途而特意制造，是全球生态系统中一类新型环境污染物。人类不可避免地通过饮食、吸入或皮肤接触摄入MPs，有几项研究在人的粪便、肺组织和血液中检测到了MPs。微塑料暴露可引发消化系统、呼吸系统和生殖系统的氧化应激和炎症，同时干扰肠道微生物群和代谢产物。最近的几项研究指出，MPs破坏肠道微生物群、代谢和炎症的平衡，最终导致造血损伤。尽管如此，团队仍然缺乏对MPs在HSC自我更新及接受HSCT患者临床结局中作用和机制的全面理解。肠道微生物群已被证明是代谢、免疫系统、炎症、衰老和神经精神疾病的重要调节器。此外，受体的微生物群密度、生物多样性和物种组成与HSCT后的治疗相关死亡、感染和器官衰竭有关。事实上，之前的研究已经揭示肠道微生物群及其代谢产物可以保护造血系统免受电离辐射的伤害，并在造血系统应激状态下发现了一个微生物群-巨噬细胞-铁轴。然而，微生物群影响造血的具体机制尚待阐明，关于环境污染物与HSCs中肠道微生物组之间关系的更多证据也是必要的。
针对以上临床和科学问题，2024年3月29日，浙江大学医学院/良渚实验室钱鹏旭研究员、黄河教授团队在《Cell Discovery》期刊（IF = 33.5）发表了题为“Microplastics dampen the self-renewal of hematopoietic stem cells by disrupting the gut microbiota-hypoxanthine-Wnt axis” 的研究论文。
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该研究揭示微塑料通过破坏肠道微生物群-次黄嘌呤-Wnt信号轴来抑制造血干细胞的自我更新，揭示微塑料在造血干细胞中的有害作用和机制，提供预防微塑料造血损伤的潜在策略，并为临床实践中选择合适的造血干细胞移植供体提供科学依据。
1. 动物模型建立与处理：小鼠模型，通过口腔灌胃给予不同剂量的微塑料（PS），持续五周，同时设立对照组，以纯净水灌胃；部分实验中也通过尾静脉注射微塑料，为期四周。通过这些模型观察微塑料对小鼠造血系统的损害。
2. 微生物组分析：受试小鼠粪便样本， 16S rDNA V4区域扩增子测序。3. 代谢组学分析：对小鼠粪便样本进行非靶向代谢组分析，以评估微塑料摄入后代谢物的变化，特别是关注次黄嘌呤等关键代谢物的水平。4. 细胞和分子生物学实验：分离骨髓中的HSCs，通过流式细胞术评估HSCs的数量和状态；利用ELISA技术测定骨髓和肠道微生物培养上清液中的次黄嘌呤和WNT10A蛋白水平；进行RNA测序（RNA-seq）以分析长期摄入微塑料后HSCs的转录组变化。5. 细胞功能恢复实验：通过口服给小鼠补充Rikenellaceae或次黄嘌呤水，观察并验证这些干预措施是否能够逆转微塑料引起的HSCs缺陷。同时，进行体外细胞培养实验，评估HSCs的克隆形成能力。6. 临床样本分析：收集接受异基因造血干细胞移植（HSCT）的患者粪便和血液样本，分析其中微塑料含量、肠道微生物群落结构及次黄嘌呤水平，评估这些因素与移植成功率的关系。7. 组织学与形态学分析：对小鼠肠道组织进行组织学染色和透射电子显微镜（TEM）分析，评估微塑料对肠道结构的影响。
为了评估微塑料（MPs）对造血系统的影响，团队选择广泛应用的商业化微塑料，如聚苯乙烯（PS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）和聚乙烯（PE）。建立了短期（1周）和长期（5周）两种不同剂量的微塑料投喂小鼠模型，并以水作为对照（图1a）。三组小鼠的体重没有显著差异（图1b）。值得注意的是，仅在长期灌胃组（PSH组）的小鼠外周血中，团队观察到白细胞（WBCs）、粒细胞、淋巴细胞和单核细胞数量明显减少（图1c-f）。随后，团队评估了微塑料对造血干细胞（HSCs）的影响，发现长期摄入微塑料显著减少了具有最高自我更新潜能的长期HSCs（LT-HSCs）以及多潜能祖细胞3/4（MPP3/4）的频率和绝对数量（图1g-i）。此外，长期摄入微塑料的小鼠中，LT-HSCs、ST-HSCs、MPP2和MPP3/4细胞的凋亡率显著增加（图1j）。细胞周期分析显示，在PSH组小鼠中，LT-HSCs、ST-HSCs、MPP2和MPP3/4细胞从G0期转向G1期（图1k, l）。另外，团队发现PSH组的集落数量和总细胞数明显较少，相比于对照组，集落形成单位（CFUs）减少了23%（图1m）。相比之下，短期摄入PS对HSCs的数量、凋亡率及其细胞周期状态没有任何影响。![]()
总的来说，这些发现表明，微塑料按时间和剂量依赖的方式抑制了造血系统。
2. 长期摄入微塑料（MPs）削弱造血干细胞（HSCs）的重建能力
受损的造血干细胞的一个显著特征是重建能力的下降。为了测试HSCs的体内再生能力，团队进行了限制定量稀释和竞争性再殖试验（LDA），将来自对照组（Ctrl）或经微塑料处理组（PSH）的不同数量的供体骨髓细胞（CD45.2）与受体骨髓细胞（CD45.1）一起移植到遭受致死剂量辐射的小鼠中（图1n）。结果显示，PSH组的HSCs相比于对照组，其竞争性再殖单位数量减少了4.5倍（图1o）。随后，团队进行了初次和二次移植实验，以评估HSCs的长期重建能力（图1p）。移植后16周，团队观察到PSH组的整体重建率与对照组相比明显降低（图1q）。此外，接受PSH骨髓细胞移植的小鼠，其来源于供体的长期HSCs和MPP2细胞的比例和绝对数量均显著减少，与对照组相比（图1r-t）。在二次移植中，PSH组的供体植入效率显著低于对照组（图1u）。同时，在初次和二次受体小鼠中，来源于供体的T细胞和B细胞数量显著减少，而髓系细胞未受影响（补充图S4h-m）。因此，长期摄入微塑料与HSCs数量减少、高凋亡率、细胞周期异常以及移植物重建能力下降有关。3. 微塑料通过破坏肠道结构、渗透性和微生物群来损害造血干细胞（HSCs）
国外文献报告指出微塑料（MPs）损害造血稳态，但MPs是否直接或间接影响造血系统尚不清楚。研究团队从C57BL/6J小鼠中分离出骨髓细胞，并用不同浓度的MPs进行培养，意外发现极高浓度的MPs并未抑制细胞活力，反而在培养7天后轻微增加了总细胞数量。研究团队每周静脉注射0.1μg/100μL的MPs给小鼠持续4周，以评估MPs对造血系统的直接影响。结果显示，MPs进入血液并未影响血液中细胞比例或骨髓中HSCs的总数，细胞凋亡率、细胞周期和HSCs形成集落的能力也没有因静脉注射MPs而改变，表明长期体内或体外接触MPs并未损害造血系统，提示MPs的体内作用可能是间接机制。
鉴于MPs主要沉积在肠道组织中，研究者怀疑MPs破坏肠道系统。通过HE染色发现，特别是在PSH组中，小肠绒毛结构受到严重破坏。透射电子显微镜（TEM）分析显示，PSH组小肠上皮细胞的微绒毛长度显著缩短，微绒毛间的间隙变宽，FITC-葡聚糖渗漏试验表明PSH组的肠道渗透性增加，证明MPs改变了肠道结构和渗透性。
为了确认长期摄入MPs是否改变肠道微生物群，通过对照组、PSL组和PSH组小鼠的粪便进行了16S rDNA测序。结果显示，PS暴露改变了微生物群组成，三组间OTUs存在差异，PCoA和UniFrac分析表明摄入MPs小鼠的细菌群落与对照组有显著区别。基于上述发现，研究者假设肠道因MP摄入导致的改变可能会损害造血系统。通过粪菌移植（FMT）实验，将抗生素预处理的野生型C57BL/6小鼠用对照组或PSH组的粪便材料重建肠道微生物群，结果显示，接受PSH组粪菌的小鼠，其HSPCs的比例和绝对数量减少，LT-HSCs的凋亡率增加，G0期缩短。
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图2 长期摄入微塑料会破坏小鼠的肠道微生物群并损害造血系统
综合以上数据，研究揭示了微塑料通过影响肠道结构和微生物群，进而导致造血系统恶化的机制。
4. 理研菌科(Rikenellaceae)和次黄嘌呤介导微塑料引起HSC缺陷
为了确定哪些特定细菌对MPs介导的HSC损伤起主要作用，团队对细菌OTUs进行了无偏聚类分析（图3a）。结果显示，在微塑料处理后，Rikenellaceae是丰度最高的细菌（图3b）。线性判别分析（LDA）表明，与对照组相比，PSH小鼠中有五种菌科（如Bacteroidales等）富集，而三种菌科（Rikenellaceae、Burkholderiaceae、Eubacteriaceae）减少（图3c）。火山图进一步标记Rikenellaceae为PSH小鼠中最显著减少的代表性菌群（图3d）。这些结果促使团队推测和相关文献报道，Rikenellaceae作为微塑料处理小鼠肠道菌群中减少的最丰富菌群，可能对造血系统具有保护作用。为了验证这一假设，团队每周三次，连续四周通过口服灌胃的方式向对照组和PSH组小鼠接种Rikenellaceae，使用强化梭菌作为对照（图3e）。结果显示，接种Rikenellaceae的PSH小鼠在HSC的比例和数量上都显示出明显的恢复（图3f-h）。Rikenellaceae的输入显著逆转了由微塑料引起的LT-HSC凋亡率上升和G0期细胞减少（图3i, j）。最后，团队从四个组别中分离HSC并在体外培养8天，发现微塑料导致的集落数量和大小减少通过Rikenellaceae治疗得以挽救（图3k）。![]()
图3 理研菌科(Rikenellaceae) 在摄入微塑料的小鼠中显著减少，并参与造血
考虑到微塑料引起代谢物变化的报道，团队接下来对对照组和PSH组的粪便样本进行了非靶向代谢组学分析，以评估哪些代谢物介导了微塑料对HSC的不良影响（图4a）。PCA分析和火山图显示了PSH组与对照组之间不同的代谢物轮廓（图4b, c），其中，嘌呤衍生物次黄嘌呤和黄嘌呤在PSH组长期灌胃微塑料后相对于对照组显著降低（图4d）。此外，团队发现Rikenellaceae的相对丰度与次黄嘌呤之间存在正相关性（图4e），这与团队16s rDNA测序数据（图3b-d）及先前研究一致。另外，团队发现聚苯乙烯（PS）的存在导致Rikenellaceae上清液及骨髓中次黄嘌呤浓度下降（图4f, g），但在PSH小鼠中，经Rikenellaceae处理后，骨髓中次黄嘌呤的减少得到有效逆转（图4g），暗示次黄嘌呤可能是肠道中Rikenellaceae的代谢产物。
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图4 次黄嘌呤的补充可改善MPs对HSC的影响
在代谢物评估之后，团队将C57BL/6小鼠暴露于PS微塑料5周，随后给予含次黄嘌呤的饮用水（图4h）。流式细胞术显示，经次黄嘌呤处理的PSH小鼠其骨髓中的HSPCs频率和绝对数量得到恢复（图4i, j），伴随凋亡率下降和静息状态增加的恢复（图4k, l）。同时，团队从小鼠骨髓中分离出自对照、PS、HPX-对照和HPX-PS组的HSC，并测量了集落形成能力。微塑料导致的集落数量和大小减少通过次黄嘌呤的施用完全得到挽救（图4m）。综上所述，团队的研究表明，Rikenellaceae或次黄嘌呤的补充能缓解微塑料对HSC的不良影响。5. 长期摄入微塑料失活HSCs中的HPRT-Wnt信号通路
为了进一步解析长期摄入微塑料后HSC缺陷的潜在下游机制，团队从小鼠中分离出LT-HSCs并进行了RNA测序（RNA-seq）以识别转录组变化（图5a）。值得注意的是，PCA图显示PSH组与对照组之间存在显著差异（图5b）。团队观察到次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）表达轻微减少（图5c），这是一种催化次黄嘌呤和鸟嘌呤转化为嘌呤核苷酸的酶。次黄嘌呤的部分缺乏和HPRT的部分缺失提示嘌呤补救途径受损，这之前已被关联到神经疾病、恶性肿瘤及HSC功能障碍。KEGG分析鉴定出“Wnt信号通路”是PS处理HSCs中最富集的下调通路之一（图5d），与先前研究一致，表明HPRT的缺失协同失调了Wnt信号通路。经典Wnt级联也被证明是HSCs的关键调控因子。暴露于微塑料后，与Wnt信号通路相关的基因，如Fzd4、Wnt10a和Wnt10b，其mRNA水平显著降低（图5e）。![]()
图5 微塑料模型中的HSC缺陷与Wnt信号通路中的缺陷有关
接下来，团队通过RT-qPCR和酶联免疫吸附测定（ELISA）确定了Wnt信号通路相关基因的表达，发现经Rikenellaceae或次黄嘌呤处理后，Hprt和Wnt信号通路相关基因（如Wnt10a）的表达下降得到了显著恢复（图5f-h）。为了明确WNT10A在HSCs中的功能背景，团队培养了对照和PS处理小鼠的骨髓细胞，并补充了重组WNT10A蛋白，发现这显著增加了HSCs的频率和数量（图5i-j）。然而，当加入Wnt通路抑制剂DKK1时，这些积极作用被逆转（图5k-l）。鉴于之前发现的与IL-17、TNF或NF-kappa B信号通路激活相关的转录组变化（图5d），团队向经微塑料处理的小鼠骨髓细胞中施加IL-17、TNF或NF-kappa B。然而，团队注意到这些干预措施无法纠正HSCs的缺陷，包括总体细胞数量、细胞死亡和生成集落的能力。综上，在微塑料摄入后，HSC造血损伤不可或缺的因素是HPRT-Wnt级联的失活，而非IL-17、TNF或NF-kappa B信号通路的活性变化。6. 健康捐赠者供体的微塑料和肠道微生物群与HSCT患者植入失败相关
为了确定微塑料、肠道微生物群和代谢物之间的关系是否同样适用于人类，团队开展了一项双盲临床研究。收集了14位健康捐赠者的粪便和血液样本，这些捐赠者的CD34+ HSPCs已被移植给急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)或骨髓增生异常综合症(MDS)的患者（图6a）。依据患者在接受HSCT后的植入状况，将患者分为两组：植入成功(GS)和植入失败或植入功能不良(GF/PGF)，这两组在患者的生存时间上存在显著差异（图6b）。通过激光直接红外成像(LDIR)技术，团队在捐赠者的粪便样本中检测到了聚苯乙烯(PS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和聚乙烯(PE)等微塑料，并发现在GF/PGF捐赠者中所有检测到的微塑料所占比例高于GS捐赠者（图6c-f）。![]()
图6 供体的微塑料和肠道微生物群与患者HSCT的结果显著相关
随后，团队对GS和GF/PGF捐赠者的粪便样本中的细菌16S rDNA基因进行了测序分析。PCoA分析显示，GF/PGF捐赠者和GS捐赠者的样本间微生物组组成有显著差异（图6g）。为了分析哪些肠道菌群起关键作用，团队执行了随机森林分析，结果显示Oscillospiraceae和Rikenellaceae是捐赠者粪便中最显著的两类细菌（图6h）与动物模型研究一致，GF/PGF捐赠者的粪便中Rikenellaceae和Oscillospiraceae的丰度显著降低（图6i）。同时，GF/PGF捐赠者粪便中的次黄嘌呤水平也有所下降（图6j）。最后，团队计算了患者生存时间和粪便中微塑料水平、Rikenellaceae或次黄嘌呤水平之间的皮尔逊相关系数，观察到患者生存与Rikenellaceae丰度（r = 0.67）或次黄嘌呤水平（r = 0.7）呈强烈正相关，而与粪便中微塑料水平呈负相关（r = -0.5）（图6k-m）。总之，小鼠中发现的微塑料、Rikenellaceae和次黄嘌呤之间的关联在人类HSCT捐赠者中同样成立，并且与移植成功相关联。该研究揭示了长期摄入微塑料对人体造血系统产生的负面影响，特别是对造血干细胞（HSCs）的损伤，以及这种损伤与肠道结构、肠道微生物群和特定代谢物变化之间的密切联系，为理解微塑料如何通过肠道-微生物-代谢物轴影响全身健康提供全新的视角。通过调节肠道微生物群和特定代谢物可能成为减轻微塑料对造血系统伤害的潜在方案，为未来预防和治疗HSCT等涉及造血系统重建的发展提供方向，更为环境保护和公共卫生政策制定提供强有力的参考指导价值。基于长期摄入微塑料对人体造血系统产生的负面影响，特别是对造血干细胞（HSCs）的损伤的作用，临床医生可以考虑以下几点来进一步提升治疗效果和患者管理：1. 肠道微生态的动态变化：后续项目可通过深入研究肠道微生物群在MPs暴露前后随时间变化的动态，以及这些变化如何与HSC功能的波动相关联。采用时间序列分析，监测摄入MPs后肠道微生物群落的即时响应和长期适应性变化，有助于更全面理解其对机体的影响。2. 人群临床干预研究：鉴于临床研究中发现的关联，可以设计前瞻性临床试验，评估调整肠道微生物群（如通过益生元、益生菌或粪菌移植）和/或补充次黄嘌呤对接受HSCT患者植入成功率和长期生存率的影响。这类研究需要严格控制，以确保安全性和有效性。3. 跨代影响研究：考虑到环境污染物可能对后代健康产生影响，研究微塑料暴露对怀孕母鼠及其后代的造血系统和肠道微生物群的长期影响，探究是否存在跨代传递效应意义重大。Driving innovation for better life！
