心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）全球范围内导致死亡的主要原因之一，其发病机制复杂，涉及多种因素，其中包括遗传、环境、生活方式以及肠道微生物组的改变。近年来，肠道微生物组与人体健康之间的关系成为研究热点。尤其是在心血管领域，越来越多的证据表明肠道微生物通过影响脂质代谢、炎症反应、血压调节等途径，影响着CVD的发展。但由于缺乏与诊断性生物标志物相匹配的多组学数据，使得对CVD发生发展的潜在机制的理解受到了阻碍。
弗雷明汉心脏研究（FHS，Framingham Heart Study），是一项关于心血管疾病流行病学的观察性队列研究，该研究始于1948年，至今仍在继续。多项研究显示，肠道微生物的多样性和组成变化与糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪肝病等代谢性疾病，以及动脉粥样硬化性心血管疾病、急性冠脉综合征和缺血性心脏病等有直接关联。一些患有CVD的个体中，其肠道微生物群落的多样性和特定菌种的丰度发生显著变化。近年来，越来越多的临床队列研究基于代谢组学和宏基因组学特征来揭示肠道菌群、肠道菌群代谢物与心血管发生风险的关系。荷兰LifeLines-DEEP队列研究和英国-美国PREDICT1研究均发现，肠道微生物组成与血液脂质水平密切相关，表明肠道微生物可能是调控血脂的一个重要因素。中国4D-SZ研究通过统计模型进一步确认了肠道微生物与血液代谢物之间存在因果关系的多个链接。此外，特定肠道细菌如多型拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）和某些双歧杆菌（Bifidobacterium）、肠球菌（Enterococcus）、乳酸杆菌（Lactobacillus）菌种已被发现可能参与胆固醇代谢过程，但这一领域仍有许多未知空间尚待探索。在此次研究之前，团队曾使用FHS参与者粪便样本的16S rRNA测序来识别与CVD风险因素、CVD相关药物和饮食信息相关的类群。为了更全面描述与心血管健康相关的肠道环境，本研究对FHS参与者的粪便样本进行了鸟枪法宏基因组和与之配对的非靶向代谢组学分析，结合分子网络和蛋白质语言模型，寻找与颤杆菌属胆固醇代谢途径相关的潜在基因，并深入探索肠道微生物如何通过其代谢活动影响心血管健康的作用机制。
2024年4月2日，麻省理工学院和哈佛大学布罗德研究所的Ramnik J. Xavier团队在【Cell】杂志（IF：64.5），发表题为“Gut microbiome and metabolome profiling in Framingham heart study reveals cholesterolmetabolizing bacteria”研究成果，发现了颤杆菌属（Oscillibacter）的肠道细菌能够代谢肠道中的胆固醇，有助于降低胆固醇以及心血管疾病风险。本研究揭示了与CVD有关的微生物途径，将肠道微生物、微生物代谢途径和CVD标志物之间的关联与颤杆菌属（Oscillibacter）细菌的胆固醇代谢能力联系起来，证明了颤杆菌属或可作为心血管疾病患者肠道微生物干预的潜在靶点，为针对性地研究肠道微生物组的变化如何影响健康和疾病提供了新思路。
![]()
![]()
针对1429个FHS参与者人体测量(如体重指数[BMI])、血液测量(如血浆胆固醇和甘油三酯)、相关处方药(如他汀类药物和胰岛素)以及多代临床CVD和糖尿病诊断。尽管没有被诊断为临床CVD或糖尿病或在样本采集时服用任何相关药物，但仍有相当一部分个体表现出CVD风险标志物(315例空腹血糖>100 mg/dL, 174例甘油三酯>150 mg/dL, 434例胆固醇>200 mg/dL)。收集粪便样本进行宏基因组和代谢组学数据，构建了一个包含超过 300万个基因和687个物种水平集合——宏基因组物种泛基因组(metagenomic species pangenomes，MSPs)。基于PCoA的光谱显示Alistipes菌属和Oscillibacter菌属α-多样性和富集度高的受试者血浆甘油三酯和葡萄糖较低，而血浆HDL较高。表明了肠道微生物群在心血管健康中发挥着重要作用。
基于899份匹配的粪便样本的非靶向代谢组学数据与人类代谢组数据库(HMDB)匹配分析，总体代谢组谱与MSP谱显著相关(p < 0.05)。与微生物组ɑ-多样性相关性最强的主要代谢组类是脂肪酰基、类固醇及其衍生物、甘油脂类和丙烯醇脂类。与其他样本相比，富含Alistipes和Oscillibacter菌属的样本的未知峰值更高，这表明在这些参与者中观察到的肠道微生物组和低血脂水平之间存在着一个巨大的未表征代谢组空间，这可能与肠道微生物组之间的联系有关。如图1。![]()
![]()
Figure 1. Overview of FHS datasets.
通过对肠道微生物群与心血管健康相关血液测量关联研究发现，FHS参与者的肠道微生物组与血液甘油三酯、糖化血红蛋白、胆固醇、肝酶ALT和收缩压显著相关(PERMANOVA检验，Padj < 0.1)。确定了129对个体MSP与血液测量之间的显著关联(Padj < 0.1)。与多种CVD危险因素相关的MSP包括F. plautii (msp_130)和C. bolteae。两种MSP均与较高的血浆甘油三酯和葡萄糖水平有关，F. plautii也与较高的血浆胆固醇有关。Oscillibacter菌属的丰度与较低的血浆甘油三酯水平有关。而Alistipes obesi与血浆胆固醇和甘油三酯呈负相关。如图2。
![]()
Figure 2. Significant associations between MSP abundances and CVD-relevant blood measurements.3. 粪便代谢组揭示了血液测量和血脂(包括类固醇和衍生物)之间的联系
根据分子网络原理定义了2,368个LC-MS峰共丰度簇，共有1,375个群集至少有一个与心血管健康相关的峰值（P＜0.05）。与粪便代谢物相关最多的血液测量是血浆高密度脂蛋白（3005）、血浆甘油三酯（1706）、血浆胆固醇（467）和血清CRP（1672）。初级胆汁酸（CDCA、GDCA和TDCA）与血浆甘油三酯呈正相关；次级胆汁酸异丙胆酸isoalloLCA（抗炎和抗菌）与血浆甘油三酯呈负相关。烯醇酮脂类和脂肪酰基与血液指标相关峰最多，而类固醇及其衍生物与血浆甘油三脂相关。短链脂肪酸丁酸酯和丙酸酯在内的一组代谢物与HDL水平呈正相关；粪便胆固醇与血浆TG、胆固醇等指标正相关，粪固醇相反，胆固醇酯与升高的LDL和降低的HDL相关，这与最近一项临床试验的结果一致。这些代谢物可能是由上述心血管健康相关微生物贡献的。如图3。
![]()
Figure 3. Significant associations between metabolites and CVD-relevant blood measurements.为了阐述心血管健康中肠道微生物和粪便代谢物之间的显著关联，观察了与>5 MSPs相关的两组已知代谢物。一组与Oscillibacter(也包括Alistipes)相关，另一组与R. gnavus(也包括C. bolteae, F. plautii（msp_13）Blautia obeum)相关。Oscillibacter和R. gnavus集群之间的差异表明，健康个体的肠道环境谱由炎症分子和特异性MSP的丰度定义。与健康对照组相比，免疫紊乱患者肠道中富集的代谢物表明这种光谱的极端炎症。
进一步分析了与cvd血液测量值相关的msp_130（F. plautii）。F. plautii将黄酮类化合物降解为酚酸，具有抗氧化和抗炎的特性，可能对人体健康有益。通过进一步分析msp_130与酚酸的相关性发现，F. plautii (msp_130)与苯基丙酸(QI21021)、二羟基苯基丙酸(QI12828、QI49585)、二羟基苯基乙酸(QI19271)呈负相关，与羟基苯基丙酸(QI19217)、羟基苯基乙酸(QI4944、QI20809)呈正相关。这种复杂的相关性一定程度上解释了F. plauti与血液指标的相关性和其代谢特征的不对应。通过进一步挖掘未知的代谢物与MSP之间的相关性，发现了13398对正相关和2626对负相关，Ruminococcus bicirculans 与Eubacterium siraeum 和血浆甘油三酯正相关 ，这两种MSP又与未知代谢物peaks (QI29995 和 QI28613)强相关。msp_120与一个未知峰(QI16816，与甘油酰胆碱相匹配)呈正相关。青少年双歧杆菌相关峰QI29637是一个胆汁酸衍生物，与其他预测的胆汁酸具有相似性；大多数峰，特别是未知峰，只与少数msp密切相关。如图4。![]()
![]()
Figure 4. Associations between FHS gut microbiome and metabolome5. Oscillibacter MSPs与粪便胆固醇及其衍生物密切相关
肠道固醇代谢（ismA）酶负责将胆固醇转化为胆甾烯酮，并将粪甾酮转化为粪固醇，而ismA与下降的血浆胆固醇相关。发现180个MSPs与粪便胆固醇呈负相关(Padj < 0.05)，包括4个编码ismA基因同源物的MSPs（ismA编码器）。与我们之前的报告一致，在大约一半的样本中，IsmA编码器的存在与胆甾烯酮（cholestenone）和粪甾醇（coprostanol）的增加有关。在与粪便胆固醇相关的MSPs中，Oscillibacter注释的MSPs显著富集。这些Oscillibacter菌属非常普遍且丰度很高，在ismA-样本中，其中几种MSPs与粪便胆固醇水平显著降低(以及粪便胆甾酮或粪甾醇升高)相关。
构建了胆固醇分子网络，共239个峰获得了84个MS/MS图谱，56个可以在HMDB中被预测（41个类固醇和类固醇衍生物，9个异戊醇丙烯醇脂类，4个非金属化合物和1个酚）。为了纠正IsmA 编码器对胆固醇衍生物的潜在影响，重新检查了在ismA样品中节点和Oscillibacter菌丰度之间的相关性。发现ismA样品中与已验证胆固醇峰连接的大多数峰与Oscillibacter的相关性更强；ismA-样本中与Oscillibacter最为相关的是胆甾烯酮在其他两个队列中也得到验证。其他显著的峰值包括: 粪甾醇、链甾醇、羟固醇、β-谷甾醇，以及许多与胆固醇大量增加相关的峰都和Oscillibacter显著相关。如图5。![]()
![]()
Figure 5. Oscillibacter spp. are strongly associated with stool cholesterol and its derivatives.
6. 使用蛋白质语言模型进行结构相似性搜索，确定了涉及胆固醇代谢的潜在Oscillibacter菌基因。
利用蛋白质序列嵌入(PROtein Sequence Embedding, PROSE)对Oscillibacter菌组装和Oscillibacter菌分离株(由41,934个蛋白质组成)的基因组构建深度学习模型，利用三级结构信息并通过序列比较改进功能蛋白查询。进行蛋白比对发现，随着国际酶委会编号（EC）级数增加，灵敏度越高。寻找人类和微生物胆固醇途径中蛋白质的功能类似物，发现了在结构上与胆固醇-a-葡萄糖基转移酶(CgT)、IsmA和转运蛋白(TSPO)相似的蛋白质。
对每个蛋白家族使用一个代表(IsmA为RJX3347_02204, CgT为RJX3347_02251, TSPO为RJX3347_01966)，通过序列相似性在Oscillibacter MSPs中搜索一致的匹配数(一致性>50% ，覆盖率>50%)。在多个颤杆菌属基因组中检测到与胆固醇代谢相关的预测蛋白，表明胆固醇代谢可能是这一不同支系中许多成员的共有属性，与它们与粪便胆固醇水平的关联一致。比较来自D. welbionis J115、RJX3347和RJX3711的IsmA和CgT查询以及两个假定的胆固醇代谢蛋白的三维结构性质，发现Oscillibacter IsmA的3个位点RJX3347_02204、RJX3711_01178和J115_02546与E. coprostanoligenes IsmA (ECOP170)折叠相似，叠加后均方根偏差(RMSD)较低；结构蛋白比对也证实了HSD活性所需的seryl-lys催化三联体的保守性。将预测的RJX3347_02251候选序列与预测的CgT结构进行叠加，在335个截短的原子对之间RMSD为0.971 A。如图6。![]()
Figure 6. Functional potential of Oscillibacter in cholesterol metabolism.
7. Oscillibacter菌通过多种途径代谢胆固醇
首先研究了Oscillibacter菌属摄取外源性荧光标记胆固醇的能力，发现颤杆菌属可以有效摄取胆固醇。对细菌分离培养物进行了非靶向代谢组学分析。在细菌暴露后的废培养基 (与未用过的YCFAC培养基相比) 中的胆固醇降低对所有三种Oscillibacter分离株(低于J115的检测限，RJX3347的变化0.01%，RJX3711的变化0.01%)比B. taiotaomicron(变化2%)要显著得多。与B. taiotaomicron相比，Oscillibacter颗粒中预测的类固醇总体上有所增加，当胆固醇添加到介质中时，该表型更显著。注释参考标准的增加最多的峰包括胆甾烯酮、胆甾酮、7α-羟基胆固醇和糖基化胆固醇，其分裂模式与胆固醇α-D-葡萄糖苷或其非对映异构体α-甘露醇胆固醇相匹配。此外，在J115和RJX3347的微球中只发现了糖基化胆固醇，与分离株基因组中检测到的CgT基因J115_17675和RJX3347_02251一致，而不是RJX3711。另外，通过在培养基中添加了13C标记的胆固醇来对胆固醇进行追踪，证实了与B. thetaiotaomicron相比，Oscillibacter颗粒中预测的类固醇有显著地增加。另外，与内部文库229种不同的脂类(其中69种是固醇)相匹配，发现了14个峰。全部都是类固醇，包括胆固醇、胆甾烯酮和胆固醇α-D-葡萄糖苷。如图7。
![]()
![]()
Figure 7. Oscillibacter spp. J115, RJX3347, and RJX3711 metabolize cholesterol via multiple pathways.
本研究不仅揭示了肠道微生物特别是Oscillibacter在维持脂质稳态和促进心血管健康中的潜在益处，还强调了进一步研究微生物代谢途径及其对宿主影响的重要性，为基于微生物组的CVD预防和治疗策略提供了科学依据。为未来针对Oscillibacter的更详细机制研究、其他菌种的培养与功能验证，以及潜在疗法的开发提供了新方向。![]()
尽管本研究中检测到Oscillibacter菌株能代谢胆固醇，但对于该属其他菌种是否具有相似能力，还需额外的体外培养和功能实验加以验证，以扩展对整个属的功能认识。同时，也需要进一步的简化模型和实验来详细描绘这些微生物如何具体影响宿主的脂质代谢，特别是胆固醇转化为其他产物（如粪甾醇）的详细机制。由于大多数FHS参与者在样本采集时并未诊断出心血管疾病，未来需要对这些人群进行长期随访，以追踪心血管代谢状态的变化，从而更准确地评估肠道微生物与CVD风险的长期关联，以期开发针对肠道微生物胆固醇代谢的干预措施，如定制益生菌或合成生物学策略，作为未来心血管疾病的有效防治手段。参考文献[1] Li C, Stražar M, Mohamed AMT, Pacheco JA, Walker RL, Lebar T, Zhao S, Lockart J, Dame A, Thurimella K, Jeanfavre S, Brown EM, Ang QY, Berdy B, Sergio D, Invernizzi R, Tinoco A, Pishchany G, Vasan RS, Balskus E, Huttenhower C, Vlamakis H, Clish C, Shaw SY, Plichta DR, Xavier RJ. Gut microbiome and metabolome profiling in Framingham heart study reveals cholesterol-metabolizing bacteria. Cell. 2024 Apr 11;187(8):1834-1852.e19. doi: 10.1016/j.cell.2024.03.014. Epub 2024 Apr 2. PMID: 38569543; PMCID: PMC11071153.Driving innovation for better life！
