胆固醇稳态主要由体内组织器官肝脏和小肠协调通过膳食胆固醇吸收、合成（肝脏）和清除和排泄（小肠）并维持平衡的状态。胆固醇稳态紊乱可能促进和导致多种疾病如心血管疾病（CVD）发生发展。胆固醇稳态紊乱可导致血液中胆固醇水平的升高，特别是低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），加速导致动脉粥样硬化的发展，并被认为是心血管疾病（CVD）的重要危险因素。CVD心血管事件是人类公共卫生面临的重大健康和挑战，CVD心血管事件引起死亡占全球死亡人数的30%以上。更多的研究表明，胆固醇稳态紊乱在多种疾病包括心血管疾病、动脉粥样硬化性、肥胖症、糖尿病、癌症等发展中起着关键作用。降低胆固醇水平能够改善相关疾病进展，特别是降低循环中的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）可以显著降低心血管事件和各种疾病的风险。人体胆固醇70%来源于体内合成（内源性），30%来源于食物摄取（外源性）。胆固醇稳态取决于胆固醇的生物合成、摄取、外排、运输、储存、利用、排泄。胆固醇吸收的增加会抑制内源胆固醇的合成，而外源胆固醇摄入不足会激活内源胆固醇的合成。肝脏是内源胆固醇合成的主要器官，小肠是外源胆固醇吸收的场所，两者如何作用协调平衡维护胆固醇水平以及胆固醇稳态机制需要探讨，肝脏胆固醇合成和肠道胆固醇吸收之间是否存在独立于胆固醇的调节通路更不清楚。
针对以上临床和科学问题，2024年3月18日，清华大学生命科学学院王一国团队与南方医科大学南方医院张惠杰团队在国际顶级期刊《Cell》杂志（IF=64.5）在线发表了题为“A gut-derived hormone regulates cholesterol metabolism”的研究论文，首次发现并命名一种肠道激素Cholesin（肠抑脂素），揭示Cholesin调控机体胆固醇稳态的作用和机制，为治疗高胆固醇血症和动脉粥样硬化、心血管疾病、退行性疾病和癌症等提供科学依据和潜在的治疗策略和通用药物干预靶点。
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1） 通过构建小鼠模型比较不同饮食喂养后的小鼠血浆蛋白图谱，发现肠道激素Cholesin；2） 通过人群和小鼠模型探索Cholesin与血浆胆固醇水平之间的关联，并分析Cholesin在胆固醇代谢中的作用；3） 通过CRISPR/Cas9技术结合GST pulldown发现Cholesin的受体GPR146，并深入分析关联的信号通路；4） 探究Cholesin单用或与他汀类药物联用是否能对抗动脉粥样硬化；1. Cholesin是胆固醇诱导的新型肠道激素，并在小肠和结肠组织中高表达
为确定参与介导肠道胆固醇吸收和肝脏胆固醇合成的调节因子，对禁食16小时后喂食RD（常规饮食）或WD（西方饮食） 1小时的小鼠的血浆蛋白进行分析。在WD喂养后，在23 kDa左右出现了一个增强的条带，通过质谱（MS）测序，将其命名为“Cholesin”。 通过MS分析对纯化的Cholesin确定其氨基酸序列。通过对继续喂养小鼠研究血浆cholesin水平变化，发现在小鼠中血浆cholesin水平迅速升高，并在WD喂养1小时后达到约1200pM的峰值。同时发现人群个体中血浆cholesin水平显著升高。综上所述，这些结果表明cholesin是高胆固醇饮食后分泌，因此胆固醇是可能的诱导剂。为确定喂养后哪些组织分泌cholesin，在蛋白水平上对cholesin进行了组织分布分析。cholesin在小肠和结肠中高度表达，在胃中中度表达。基于这些结果，构建肠道特异性敲除cholesin（IKO）的小鼠。在野生型（WT）小鼠中，WD喂养后血浆Cholesin水平从约500 pM显著增加到约1200pM。在IKO小鼠中，WD诱导的Cholesin水平约为400pM。为进一步证实胆固醇在促进Cholesin分泌中的作用，通过灌胃给小鼠胆固醇。与WD喂养观察到的效果相似，胆固醇给药显著增加了WT小鼠从450到1,500 pM的Cholesin分泌。然而，IKO小鼠中的Cholesin水平约为400pM。WT和IKO小鼠的肠道胆固醇水平相当。总之这些证据表明Cholesin是一种肠道衍生激素，对胆固醇吸收作出反应。![]()
图1. 高胆固醇饮食喂养促进Cholesin 分泌
2. NPC1L1介导的胆固醇摄取促进Cholesin的分泌，通过外泌体运输、发挥功能
已有文章明确报道，胆固醇吸收是通过NPC1L1作用于肠上皮细胞的顶端表面发生，团队推测胆固醇吸收诱导的Cholesin可能在肠上皮细胞中表达并通过NPC1L1介导。为了发现Cholesin表达具体部位，通过构建Cholesin-GFP敲除小鼠，并将其与Apoa1-mCherry敲除小鼠杂交（Apoa1是肠细胞的标志蛋白）。观察到Cholesin-GFP与APOA1-mCherry共定位，这表明Cholesin在肠上皮细胞中表达。通过观察不同胆固醇水平对人结直肠癌细胞（HCT116细胞）中Cholesin分泌的影响，检验胆固醇是否直接影响Cholesin的分泌。随着胆固醇浓度的增加，培养基中Cholesin水平呈剂量依赖性增加。此外，HCT116细胞中NPC1L1的敲除破坏了胆固醇的吸收和Cholesin的分泌。以上结果表明，NPC1L1介导的胆固醇摄取刺激Cholesin的分泌。![]()
图2. NPC1L1介导的胆固醇摄取增强Cholesin的分泌
为证实小鼠的Cholesin分泌需要NPC1L1依赖的胆固醇摄取，采用了两种方法：使用NPC1L1抑制剂（Ezetimibe）和NPC1L1的KO进行处理。值得注意的是，Ezetimibe处理和Npc1l1 KO都有效地阻断了肠道胆固醇吸收和Cholesin分泌。这些全面的体外和体内结果有力地支持了阻断NPC1L1抑制胆固醇诱导的Cholesin分泌的结论。有研究报道许多蛋白质是通过与外泌体蛋白质或脂质结合而分泌发挥作用。为研究胆固醇如何刺激Cholesin分泌，用各种阻断分泌途径的化学物质处理细胞。使用GW4869（已知的外泌体抑制剂）观察外泌体生成，发现抑制外泌体后显著减少Cholesin的分泌。对释放的外泌体进行的免疫印迹（IB）分析证实，Cholesin确实在外泌体中富集。这些结果强烈表明Cholesin是通过外泌体分泌和进行长距离运输和执行靶向下游机制和发挥功能。然而，需要进一步的研究来揭示胆固醇刺激外泌体释放的机制，以及Cholesin将自身锚定在外泌体上的过程。3. 基因遗传位点rs1007765次等位基因型样本增加Cholesin的表达，进而降低血浆胆固醇水平
已有文献报道，Cholesin位于人类7号染色体（Chr7）的p22区域，这与不同人群队列中的高胆固醇血症密切相关。rs10236293和rs1007765，位于Cholesin基因3’末端附近，与血浆胆固醇水平显著相关。为建立Cholesin和血浆胆固醇水平之间的相关性，对600人的血浆Cholesin和胆固醇水平进行了测量。血浆胆固醇水平与总胆固醇（TC）水平（p < 0.0001）和LDL-C水平（p < 0.0001）呈负相关，而与HDL胆固醇（HDL-C）水平无显著相关（p=0.1875）。此外，血浆Cholesin水平与TG水平呈负相关（p=0.0438）。这些数据为Cholesin和血浆胆固醇水平之间的关系提供了证据。进一步研究两个已鉴定的SNP（rs10236293和rs1007765）是否影响血浆Cholesin和胆固醇水平。在多个细胞系的两个SNP中都定位于顺式调节元件（CREs）。两种CRE都表现出对DNase I的过敏，以及H3K4me3和H3K27ac等表观遗传修饰的富集，这表明染色质开放构象激活基因表达。对基因表达数据的进一步挖掘表明，这两个SNP都位于增强子区域。对人类数据的分析显示，携带任何一种SNP的个体都表现出血浆Cholesin水平升高，血浆TC和LDL-C水平降低。与Cholesin表达和胆固醇水平相关的两个SNP非常接近（<200 bp），并且处于完全连锁不平衡状态（在英国和中国南方汉族人群中的r2=1）。为确定哪个SNPs影响Cholesin水平，团队通过敲除HEK293T细胞中CRE1中rs10236293或CRE2中rs1007765的侧翼序列。发现CRE2缺失而不是CRE1缺失，显著降低了Cholesin的表达。这表明rs1007765而不是rs10236293可能会影响Cholesin的表达。重要的是，CRE2缺失特异性地降低了Cholesin的表达，而不影响其他邻近基因。为直接评估哪个SNP调控Cholesin的表达，将CRE片段放置在一个mini-CMV（巨细胞病毒）启动子前，以检测其对下游Cholesin的转录调控作用。含有rs1007765的CRE2片段而不是CRE1，增加了Cholesin的表达。此外，rs1007765的C等位基因比G等位基因的Cholesin表达增强更强。通过敲除rs1007765的C等位基因，进一步证实了这一结论。在HCT116细胞中也得到了类似的结果，表明rs1007765在上调来自不同组织的细胞中的Cholesin表达中发挥了保守作用。![]()
图3. Cholesin调节人体血浆胆固醇水平的遗传机制
总的来说，这些结果表明rs1007765而不是rs10236293，增加了Cholesin的表达并降低人类的血浆胆固醇水平。4.功能实验表明Cholesin缺乏导致血浆胆固醇水平升高，增加肝脏胆固醇合成和VLDL分泌
血浆Cholesin升高与胆固醇水平降低相关，而RD或WD小鼠的雄性和雌性小鼠血浆胆固醇水平均显著升高（20%），血浆TG水平也略有升高。相应地，Cholesin IKO小鼠肝脏胆固醇含量增加，而体重、脂肪质量、食物和水摄入量、呼吸交换比（RER）、运动和血糖水平不受影响。快速蛋白液相色谱（FPLC）分析血浆脂蛋白显示，Cholesin IKO小鼠的HDL-C、LDL-C和VLDL-C均升高。以上结果表明Cholesin缺乏导致血浆胆固醇水平升高。![]()
图4. Cholesin缺乏可提高肝脏胆固醇合成和VLDL分泌率在mRNA和蛋白水平上检测了胆固醇合成基因的表达。Cholesin IKO导致RD和WD同时喂养的小鼠肝脏中SREBP2活性和胆固醇生成基因的表达增加。在WD喂养的小鼠中，胆固醇生成基因的表达水平较低，表明肠道胆固醇的吸收抑制了肝脏胆固醇的合成。Cholesin IKO小鼠中，参与脂肪酸合成的基因的表达水平增强。为评估Cholesin是否影响VLDL分泌，使用一种脂蛋白脂肪酶抑制剂，抑制外周VLDL TG的水解，并监测血浆TC和TG水平。RD和WD喂养的雄性和雌性小鼠的TC和TG分泌率均显著提高。在Cholesin IKO小鼠中，VLDL颗粒上的结构蛋白APOB的分泌显著增加。这些结果表明，Cholesin缺乏至少部分通过增加肝脏胆固醇合成和VLDL分泌来提高血浆胆固醇水平。5. GST pull down实验发现Cholesin受体GPR146，Cholesin通过GPR146偶联的GNAI1信号通路抑制cAMP的产生
为确定Cholesin的靶组织，将纯化的GST-Cholelesin与不同小鼠组织的冷冻切片孵育进行结合试验发现其靶向作用受体。在肝脏、脂肪组织、肾脏和骨骼肌中观察到更强的结合信号。通过构建使慢病毒文库筛选Cholesin受体基因，鉴定出的第一个候选基因是GPR146，是一个参与胆固醇合成调控的保守的孤儿GPCR受体。为确定GPR146是否是Cholesin的受体，检测了GPR146-/-小鼠组织中Cholesin的结合。在GPR146-/- 鼠的组织和原代肝细胞中，Cholesin结合完全消除；GST下拉分析和微尺度热电泳（MST）证实，Cholesin与GPR146具有高亲和力结合。基于GPR146的保守性和预测结构，用丙氨酸替换6个氨基酸生成GPR146的突变体（Mut）。与WT GPR146相比，Mut GPR146对胆胆素的亲和力明显降低，不能恢复GPR146-/-原代肝细胞的结合。以上试验证明GPR146是Cholesin的受体。![]()
图5. GPR146是Cholesin受体
进一步研究GPR146在小鼠原代肝细胞中的下游信号通路。Cholesin治疗破坏了GPR146和GNAI1之间的相互作用，而这种作用被GPR146的Cholesin结合缺陷突变体所减弱。与这些结果一致的是，Cholesin治疗降低了WT原代肝细胞的细胞环AMP（cAMP）水平，但没有降低Gpr146-/-原代肝细胞的水平。添加WT GPR146，而不是Mut GPR146，恢复了Cholesin对GPR146/肝细胞cAMP水平的抑制作用。综上所述，Cholesin通过GPR146偶联的GNAI1信号通路抑制cAMP的产生。6. Cholesin以GPR146依赖的方式抑制胆固醇合成
团队研究Cholesin是否通过GPR146抑制小鼠的胆固醇合成。注射Cholesin降低WT（Gpr146fl/fl）小鼠的胆固醇基因表达、肝脏胆固醇含量和血浆TC水平（15%）。此外，Cholesin的给药降低了TG水平，但对体重和食物摄入量没有影响。进一步检测了腺病毒介导的WT和Mut GPR146的表达对GPR146肝脏特异性KO（LKO）小鼠胆固醇合成的影响。GPR146 LKO小鼠显示胆固醇合成、血浆TC水平（15%）和血浆TG水平降低。重要的是，在GPR146 LKO小鼠中，Cholesin对胆固醇合成和血浆TC水平的抑制作用减弱。而添加WT GPR146，而不是Mut GPR146，恢复了Cholesin对TC和TG水平的抑制作用。综上所述，这些结果表明GPR146对Cholesin降低胆固醇合成至关重要。![]()
图6. Cholesin通过GPR146抑制胆固醇的合成
7. Cholesin通过Cholesin-GPR146轴预防高胆固醇血症和动脉粥样硬化
他汀类药物是治疗高胆固醇血症的常用处方药物，通过抑制HMGCR活性和增加LDLR介导的胆固醇摄取来减少胆固醇的合成。但是他汀类药物能够显著增加Hmgcr和其他致胆固醇基因的表达。考虑到Cholesin降低胆固醇生成基因表达的作用，团队研究了Cholesin单独或与瑞舒伐他汀（Ros）联合是否能对Ldlr-/-小鼠的动脉粥样硬化提供保护作用。未经处理的Ldlr-/-小鼠血浆中Cholesin水平略有升高，表明Cholesin水平略有升高并不足以完全抑制血浆胆固醇的升高。Cholesin治疗显著降低了胆固醇生成基因表达和血浆TC水平，也导致动脉粥样硬化病变的显著减少。同样，Ros治疗降低了胆固醇合成、血浆TC水平和动脉粥样硬化病变，但导致胆固醇生成基因表达上调。有趣的是，Cholesin和Ros联合治疗减轻了Ros单独诱导的胆固醇合成的代偿性增加，从而对血浆TC水平和动脉粥样硬化病变有更显著的抑制作用。此外，通过血浆丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）水平评估，Cholesin和Ros联合治疗可减少体重增加（不减少食物摄入量），降低TG水平，减少肝脂质积累，减少炎症反应。![]()
图7. Cholesin可以预防高胆固醇血症和动脉粥样硬化
综上结果表明，Cholesin单独或Cholesin联合他汀类药物对高胆固醇血症和动脉粥样硬化有明显的保护作用。1、本研究团队发现一种肠道分泌的激素Cholesin，并通过系列功能实验证据来支持Cholesin-GPR146轴对高胆固醇血症和动脉粥样硬化的保护作用。本研究发现在NPC1L1的介导参与下肠上皮细胞的胆固醇吸收触发Cholesin的分泌并与GPR146受体结合抑制cAMP/PKA-ERK1/2信号级联，进而下调SREBP2控制的肝脏胆固醇合成。![]()
2、本研究结果为由Cholesin-GPR146轴介导的肠道和肝脏在胆固醇代谢中复杂的相互作用提供了有价值的见解。总之，本研究中发现的Cholesin与GPR146靶向拮抗剂为治疗高胆固醇血症和动脉粥样硬化性心血管疾病提供了新的靶点。基于Cholesin在调节胆固醇代谢中的独特作用，临床医生可以考虑以下几点来进一步提升治疗效果和患者管理：1） 整合Cholesin检测到常规检查中：鉴于Cholesin与血浆胆固醇水平的强相关性，将其检测纳入心血管风险评估的常规生化指标中，有助于早期识别高风险个体，尤其是对现有胆固醇管理策略反应不佳的患者。 2）探索Cholesin与现有疗法的协同作用：鉴于Cholesin对胆固醇合成的独立抑制作用，它可能与现有的降脂药物（如他汀类、依折麦布、PCSK9抑制剂）产生协同效应。临床试验应设计以评估这些组合疗法的安全性和有效性，尤其是在那些因LDLR缺陷对传统疗法反应有限的患者中。3） 个体化治疗策略：利用基因测序技术，识别携带影响Cholesin或GPR146表达的特定遗传变异的患者，以实施更为精准的个体化治疗。例如，针对携带促进Cholesin表达变异的患者，可以优先考虑Cholesin激活剂或类似机制的疗法。4） 生活方式干预与营养指导：鉴于Cholesin受肠道胆固醇吸收影响，建议患者采取低饱和脂肪、高膳食纤维的饮食，以间接促进Cholesin的分泌和功能，同时减少胆固醇吸收，这可能对维持良好的胆固醇水平有益。5） 监测长期治疗的补偿效应：对于长期使用降脂药物的患者，特别是使用抑制胆固醇吸收药物（如依折麦布）的患者，应定期监测胆固醇合成相关基因（如HMGCR）的表达变化，以及Cholesin水平，以评估潜在的补偿机制，并及时调整治疗方案。 6）其他临床和科研合作：随着Cholesin研究的深入，临床医生应持续跟进最新的研究成果，参与相关学术交流和继续教育项目，与科研团队合作，共同推进对Cholesin作用机制的理解和临床应用的探索。综上，通过整合最新科研成果，临床医生能够更好地理解Cholesin在胆固醇代谢中的角色，从而在实践中为患者提供更为精准和有效的治疗方案。Driving innovation for better life！
