基于以上问题，2024年3月28日，华北理工大学孙良丹教授团队最新研究成果，“Cutaneous calcium/calmodulin-dependent protein kinase II-γ–positive sympathetic nerves secreting norepinephrine dictate psoriasis”发表在国际知名学术期刊《Advanced Science》（IF=15.10），该研究解析了皮肤CaMK2γ交感神经在银屑病发病中的作用机制。
方案设计
（1）结合RNA-seq数据库分析结果，利用荧光定量PCR、Western blot、免疫组化、流式细胞分析技术等检测易感基因CAMK2G在银屑病中的表达水平，从临床样本及动物模型，不同层次解析皮肤组织中易感基因CAMK2G在银屑病中的表达模式；
（2）构建CAMK2G基因敲除的Camk2g-/-小鼠，利用咪喹莫特(Imiquimod，IMQ)对WT和KO小鼠诱导银屑病样表型，建立基于易感基因缺失的银屑病小鼠模型，观察小鼠表型的改变（病理、炎症反应），确定CAMK2G功能丧失与银屑病表型的关联；
（3）利用药物（6-羟基多巴胺）处理去除小鼠皮肤交感神经的方法，确定皮肤交感神经细胞中CAMK2G调控银屑病表型的机制；
（4）在CAMK2G通路中构建多个靶点的激活和抑制，鉴定其在银屑病的病情加重的作用机制。
主要内容&结果
1. 皮肤组织CAMK2γ表达激活和表型验证
与对照组相比，IMQ诱导的银屑病小鼠皮肤中易感基因CAMK2G的转录水平均上调（图1A），该基因的蛋白产物CaMK2γ在IMQ诱导的银屑病小鼠皮肤和银屑病患者皮损组织中显著激活（图1b，c，d），小鼠皮肤组织和人类皮肤样品的CaMK2γ和交感神经标志物TH免疫荧光检测显示，皮肤CaMK2𝛾 主要在真皮交感神经纤维中表达（图1e），为了确定银屑病中CAMK2G表达的增加是否与交感神经系统（SNS）激活有关，团队应用管约束诱导的急性应激模型，发现急性应激确实增加皮肤CAMK2G的转录（图1f），此外，团队发现急性应激加重了IMQ诱导的银屑病样表现的严重程度，反映出背部皮肤厚度增加、红斑加重和结垢（图1g，h）。IMQ诱导-管约束条件显著增加了CaMK2𝛾和TH及其磷酸化水平，反映交感神经激活（图1i）。
图1 皮肤CaMK2𝛾 主要在交感神经中表达，并在急性应激和IMQ应用时被强烈激活
2. Camk2g缺失减轻银屑病样表型和皮肤炎症
为了研究CaMK2𝛾 在银屑病中的作用机制，团队构建了Camk2g缺失小鼠Camk2g-/-）和WT小鼠的IMQ诱导的银屑病小鼠模型。与经IMQ诱导的WT小鼠相比，经IMQ诱导的Camk2g-/-小鼠表现出明显减弱的银屑病样表现，如背部皮肤厚度减少、红斑减轻和结垢（图2a，b），使用特异性抗体标记单核细胞和中性粒细胞，这是小鼠背部皮肤银屑病病变中典型的炎症浸润细胞，结果显示Camk2g-/-中IMQ诱导的炎症浸润明显少于WT小鼠（图2c），取IMQ诱导的WT和Camk2g-/-小鼠皮肤组织，进行RNA测序，鉴定差异表达的基因并进行功能富集，包括与细胞因子-细胞因子受体相互作用和IL-17信号通路相关的基因（图2d，e）。qPCR显示，在IMQ处理的Camk2g-/-小鼠的皮肤中，已知在银屑病病变中比在健康皮肤中表达更强的促炎基因（Il17a、Il17f、Il6、Il22、Il1b和Tnfa）的表达显著减少（图2f）。
进一步表明，Camk2g缺失减轻了IMQ诱导的小鼠银屑病皮肤炎症。值得注意的是，团队对Camk2g-/-小鼠应用IMQ诱导及管约束处理，发现急性应激不会加重Camk2g缺陷小鼠IMQ诱导的银屑病表型和炎症浸润（图2g，h）。这进一步表明SNS在银屑病中的调节依赖于CaMK2𝛾.
图2 Camk2g缺乏可减轻IMQ引起的银屑病样表现和皮肤炎症
3. CaMK2𝜸调控𝜸𝜹 T细胞释放IL-17A
在IMQ诱导的WT小鼠的背部皮肤中，IL-17A主要通过真皮𝛾𝛿T细胞产生，很少在表皮𝛾𝛿T和𝛼𝛽T细胞中表达。免疫荧光染色显示，在IMQ处理的小鼠的皮肤组织中，与𝛼𝛽T细胞相比，𝛾𝛿T细胞与交感纤维的距离更接近（图3a）。流式细胞术显示与IMQ处理的WT小鼠小鼠相比，IMQ处理的Camk2g-/-小鼠中真皮IL-17A+ 𝛾𝛿T细胞比例明显减少，但表皮IL-17A+𝛾𝛿T或𝛼𝛽T细胞的数量没有差异（图3b）。因此，皮肤交感神经CaMK2𝛾 可能主要通过真皮调节局部𝛾𝛿T细胞产生IL-17A。
图3 CaMK2𝛾 通过皮肤交感神经激活真皮𝛾𝛿T细胞促进IL-17的产生
4. CaMK2𝜸对IL-17的控制取决于去甲肾上腺素(NE)
IMQ诱导显著上调了小鼠皮肤中的TH磷酸化，交感神经特异性Camk2g缺失减弱了这种作用（图4a）。儿茶酚胺神经递质检测显示，IMQ诱导的Camk2gfl/fl Dat-Cre小鼠的皮肤去甲肾上腺素(NE)水平低于WT小鼠（图4b），Camk2g的基因缺失降低了IMQ处理小鼠的皮肤和血清NE水平。银屑病患者的血清NE水平高于健康对照组，交感神经消融后皮肤NE的减少意味着交感神经对𝛾𝛿T细胞IL-17的产生依赖于NE的分泌（图4c）。在IMQ诱导的小鼠中，皮下注射NE加重了银屑病样表现，消除了WT和Camk2gfl/flDat-Cre小鼠之间的皮肤厚度差异，增加了皮肤中IL-17A+ 𝛾𝛿T细胞的数量，并挽救了Camk2g缺失诱导的这一数量的减少（图4d-f）。因此，CaMK2的作用𝛾 IMQ诱导的皮肤炎症可能与皮肤交感神经分泌NE有关。
qPCR显示，通过RNA干扰敲低CAMK2G抑制了PMA分化的人神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞中的TH转录，6-OHDA诱导会使TH水平进一步降低（图4g）。TH的转录与CAMK2G的转录呈正相关（图4h）。蛋白质印迹显示6-OHDA诱导的损伤减少了CaMK2𝛾 和pTH水平（图4i）。CAMK2G缺失显著降低了活化的pTH水平（图4i）。这些发现表明CaMK2𝛾 通过激活皮肤交感神经中的TH促进皮肤NE分泌，随后上调𝛾𝛿T细胞IL-17A的产生。
图4 CaMK2𝛾对IMQ诱导的𝛾𝛿T细胞IL-17产生的调节依赖于去甲肾上腺素的分泌
5. 皮肤交感神经介导𝛾𝛿T细胞通过AR 𝛽1–NF-𝜅B和AR𝛽1-p38信号释放IL-17A
图5 皮肤交感神经介导𝛾𝛿T细胞通过AR 𝛽1–NF-𝜅B和AR𝛽1-p38信号释放IL-17A
6. 小分子抑制剂阿卡他定筛选，并通过减少炎症可显著抑制银屑病
鉴于CaMK2𝛾在银屑病的发病机制中的重要作用，以及靶向CaMK2𝛾的有效抑制剂尚未报道，团队致力于寻找一种有效的CaMK2𝛾小分子抑制剂用于银屑病的治疗并确定其对银屑病的治疗效果。在筛选的130个小分子化合物中，阿卡他定(Alcaftadine)对CaMK2𝛾 的抑制作用最为显著。
阿卡他定(Alcaftadine)与人和鼠CaMK2𝛾都有很强的结合能力和抑制作用（图6a）。与对照组相比，局部应用Alcaftadine抑制CaMK2𝛾 磷酸化并降低PASI评分（p＜0.001）和IMQ诱导小鼠皮肤损伤中的𝛾𝛿T17细胞（图6b-d）。qPCR显示，给予5 mg/kg Alcaftadine的小鼠皮肤中Il17a、Il17f、Tnfa和Il23a的表达显著降低，但给予2.5 mg/kg小鼠皮肤的Tnfa或Il23a表达没有变化（图6e）。
因此，5 mg/kg−1 Alcaftadine可显著抑制银屑病，这些发现支持了阿卡他定(Alcaftadine)作为银屑病临床药物的潜在安全性。
图6 阿卡他定靶向CaMK2𝛾的小分子抑制剂, 有效地减弱IMQ诱导的小鼠中的炎症表型
研究意义与展望
Driving innovation for bette
