细胞的生长和增殖与细胞的合成代谢密切相关。抗药也与代谢适应同时发生，并可被自噬阻碍。雷帕霉素复合物1（mTORC1）的作用靶点是响应细胞内和细胞外信号的代谢调节的中心支柱。其激活与增强蛋白翻译和减少自噬有关。mTORC1被招募到溶酶体表面以解除其抑制。然而，肿瘤细胞也表现出对细胞外基质ECM脱离诱导的细胞死亡的抵抗。肿瘤细胞如何在坚硬的基质上获得生长优势，同时抵抗基质脱离时的细胞死亡仍是一个谜。最近的研究表明，溶酶体上的mTORC1可以被运输并激活在黏附斑（FAs）周围——这是连接细胞外基质（ECM）与细胞内部的整合素为基础的机械信号传导中心。然而，目前仍缺乏证据表明基质的物理性质是否可以传递给mTORC1通路。
针对以上问题，北京大学基础医学院吴聪颖课题组在【Advanced Science】（IF=14.30）在线发表文章“mTORC1 mediates biphasic mechano-response to orchestrate adhesion-dependent cell growth and anoikis resistance”, 本研究发现了mTORC1通路在刚性基质或基质脱离条件下的机械调控现象及其潜在机制。
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1. 细胞培养构建：小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），NIH3T3细胞，人胚肾293T（HEK 293T）细胞和HeLa细胞，MDA-MB-231细胞和人视网膜色素上皮（HRPE）细胞，A2780细胞，HepG2细胞。2. CRISPR/Cas9介导的FTO基因敲除：通过CRISPR-Cas9系统构建了FTO基因敲除细胞。3. mRNAseq测序以及分析结果：使用Trizol试剂提取总RNA，使用polyT磁珠纯化mRNA，进行Illumina测序，使用DESeq2进行差异表达分析，使用KEGG和MsigDB对差异表达基因集合进行富集分析。4. MeRIP-qPCR验证表达结果：具有特定处理的细胞的总RNA使用Trizol进行提取，然后富集mRNA。使用结合了m6A捕获抗体的磁珠富集含有m6A的靶片段，并使用切割酶混合物切割m6A区域两端的RNA序列。之后释放富集的RNA，进行纯化并洗脱。MeRIP后进行qPCR以量化目标基因中预测的m6A位点的变化。MeRIP-qPCR实验及其后续的数据分析由Genesky Biotechnologies Inc. (Shanghai, China)【上海天昊生物科技有限公司】提供支持。5. 小鼠与肿瘤异种移植模型：6周龄的雌性BALB/c裸鼠，分别将3×106个A2780细胞注射入左侧和右侧腹侧。然后，将5×106个A2780细胞注射到腹腔内以建立恶性腹水的小鼠模型。随后监测动物的肿瘤生长情况。四周后，动物被安乐死。收集左侧和右侧腹侧的肿瘤，并进行消化以提取RNA用于qPCR。使用DPBS冲洗小鼠的腹腔，并将腹水细胞离心收集，用于涂片和免疫荧光染色，或者提取RNA用于qPCR。1. mTORC1 激活介导细胞在刚性培养条件下的生长增加
为探索赋予刚性基质生长优势的主要参与者基因，使用RNA-Seq发现并富集了在刚性基质上调的特征基因。mTORC1信号通路在MsigDB和KEGG数据库中均被富集。使用雷帕霉素抑制mTORC1，雷帕霉素降低了细胞生长。
接下来探讨刚性基质或增强的细胞收缩性是否通过S6 的磷酸化来激活 mTORC1 活性。在刚性培养条件下，检测到 phos-S6 水平显著增加，而总 S6 水平没有明显变化，相反，当软凝胶上的细胞用 Rho 激活剂 II 处理以增强收缩性时，mTORC1 活性恢复到与刚性培养细胞相似的水平。这些观察结果表明，mTORC1 活化可能是对基质刚性或细胞骨架收缩的一种广泛响应。
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2. 软基质通过调节m6A RNA的甲基化来降低mTOR蛋白的丰度
除了在软基质上 mTORC1 活化水平较低（图 1），蛋白质丰度降低可能是由于蛋白质合成受限和/或降解增强所致。一方面，为了检测细胞收缩减少是否阻碍了 mTOR 蛋白的合成，用 MG132 抑制蛋白酶体降解，表明在低力条件下 mTOR 蛋白合成可能受到阻碍，导致总 mTOR 水平下降。另一方面，用环己酰亚胺（CHX）抑制翻译延伸，没有观察到明显的 mTOR 降解差异。综合来看，在软基质或收缩力降低的情况下，mTOR 水平的下降是由于蛋白质合成受抑制而不是降解增强所致。通过定量 PCR（qPCR）检测发现，博司他丁处理后 mTOR mRNA 水平降低，当使用放线菌素 D 阻断 RNA 合成并监测mRNA 稳定时，发现在博司他丁处理下 mTOR mRNA 的降解速度显著加快。这些结果表明，在抑制收缩力的条件下，mTOR mRNA 水平的降低可能是由于 mTOR mRNA 稳定性的下降所致。mTOR 转录本包含几个长外显子，这些外显子可以由 m6A 机制调控，讨论m6A 修饰是否可能介导 mTOR mRNA 和蛋白丰度的机械调控。在线软件 SRAMP 预测了 mTOR mRNA 的 3′UTR 区域中有五个高度可信的 m6A 修饰位点。基于这一预测，使用基因特异性的 m6A RNA 免疫沉淀-qPCR (MeRIP-qPCR) 分析了这些潜在修饰位点上的 m6A 水平。所有五个位点在博司他丁处理后均显示出 m6A 修饰水平升高。综合来看，在不同刚性或细胞收缩力条件下，敏感的 m6A 变化可能介导 mTOR 蛋白丰度的变化。![]()
图2 基质刚性调控 mTOR 丰度和 m6A 水平
3. FTO 磷酸化将刚性感知与 mTOR 的 m6A 修饰联系起来
通过检测在刚性或软性培养条件下 mTOR 水平和 mTORC1 活性，观察到FTO 敲除（KO）消除了不同刚性条件下 mTOR 蛋白和 phos-S6 水平的差异。用 FTO 抑制剂——美洛芬酸（MA）处理细胞也得到了相同的结果。通过 RIP-qPCR 检测了 mTOR mRNA 与 FTO 的结合，并发现与对照组相比，博司他丁处理的细胞中 mTOR mRNA 与 FTO 的结合较少，表明在低收缩力条件下，mTOR mRNA 与 FTO 的相互作用可能被中断，导致更多的 m6A 修饰无法有效去除。随后，评估了最近报道的 FTO 的 Ser 256 磷酸化，该磷酸化会失活 FTO 并削弱其去甲基化功能。在博司他丁处理的细胞中，FTO 的泛磷酸化丝氨酸水平升高。此外，当引入野生型 FTO（WT FTO）或 S256D 突变体（模拟磷酸化的 FTO）回补 FTO 敲除细胞时，发现只有 WT FTO能够恢复全局去甲基化活性，以及软性培养条件下 mTOR 和 phos-S6 的水平。综合来看，这些结果表明 FTO 的翻译后修饰在机械调控 mTORC1 途径中起重要作用。据报道，m6A 读取蛋白 YTHDF2 介导 m6A 甲基化转录本的降解。一致地，YTHDF2 的敲减延长了 mTOR mRNA 的寿命，恢复了软基质上 mTOR 蛋白的丰度和 mTORC1 的活性。这些结果表明，YTHDF2 可能通过降低基质刚性介导 mTOR mRNA 水平的下调。综上数据发现，mRNA m6A甲基化可以与基质刚度协调，通过FTO磷酸化调节mTORC1通路。4. GSK3β可定位于FA区域并磷酸化FTO以激活mTORC1
从免疫沉淀-质谱（IP-MS）分析中，发现了糖原合成酶激酶-3β（GSK3β）与 FTO 之间的相互作用。使用 CHIR-98014 抑制GSK3β 减少了 FTO 的磷酸化，而通过降低细胞张力激活 GSK3β 则产生了相反的效果。通过共免疫沉淀（Co-IP）在刚性培养的细胞中确认了 FTO 与 GSK3β 之间的结合。为追踪在不同机械条件下 GSK3β 定位的变化，生成了一个稳定表达 GSK3β-AcGFP 的细胞系。观察到 GSK3β 主要分布在胞质中，但在细胞底部显示为斑块状结构，并与黏着斑标记蛋白 paxillin 共定位。当通过施加锰来强制整合素激活时，发现 GSK3β 在黏着斑处的聚集分布逐渐减少，表明黏着斑保留的 GSK3β 可能响应整合素激活和机械刺激。此外，锰增加了 GSK3β 在 Ser9 位点的磷酸化，这表明其激酶活性受到抑制。沉默整合素β1阻碍了mTORC1在FAs的活性，导致phos-GSK3β（Ser9）水平下降，表明GSK3β活性可能受整合素β1负调控。也检测到在刚性基质上培养的细胞中 phos-GSK3β（Ser9）水平升高，支持 GSK3β 活性受到基质刚性增强的抑制。综上所述，这些结果确定了GSK3β在基质硬化诱导的FTO和mTORC1激活中的潜在作用，以及其潜在机制可能与整合素β1有关。
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图3 GSK3β通过与整合素相互作用在FTO磷酸化中起关键作用
1、本研究发现mTORC1 通路的机械激活可能在促进细胞生长和抵抗失巢凋亡方面发挥双重作用。基质刚性增加或细胞张力增强会促进 mTORC1 激活，维持细胞增殖和合成代谢。而 ECM 脱离则会抑制 mTORC1 信号，实际上通过提高自噬来促进细胞存活。2、整合素-GSK3β-FTO-mTOR轴的策略可能会为癌症治疗提供双重打击的机会，特别是在那些具有高度侵袭性的肿瘤中，这些肿瘤往往伴随着ECM硬化以及在转移过程中遭遇的环境变化。进一步的研究将有助于理解肿瘤细胞是如何利用这一机制来适应力学微环境的变化，并可能为靶向治疗提供新的方向。![]()
3、研究结果不仅在体外模型中得到了证实，还在人类乳腺导管原位癌和小鼠恶性腹水样本中观察到了相似的现象，表明这些发现具有重要的临床意义。
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