重度抑郁障碍（major depressive disorder，MDD）是全生命周期发病的最常见的重性精神疾病, 世界卫生组织预测2030年其将跃居全球人类疾病总负担首位，MDD的高患病率、复发率、致残率和自杀率给患者、家庭和社会带来了沉重负担。然而，MDD发病机制尚未阐明，诊断依然依赖临床表象，无法实现早期诊断和精准靶向干预。因此，筛选确定诊疗生物学标记物并验证其功能是突破卡脖子临床难题并阐明科学问题的关键一步。
环状RNA（circular RNA, circRNA）主要是mRNA前体经过反向剪接形成的共价闭合单链调控RNA分子，前期研究发现环状RNA通过吸附microRNA或RNA结合蛋白参与抑郁发生。
2021年，东南大学张志珺教授课题组也已发现外周血circFKBP8或circMBNL1作为生物标记物在MDD诊疗中的潜在临床价值【Shi Y, Song R, Wang Z, Zhang H, Zhu J, Yue Y, Zhao Y, Zhang Z. Potential clinical value of circular RNAs as peripheral biomarkers for the diagnosis and treatment of major depressive disorder. EBioMedicine. 2021 Apr;66:103337. doi: 10.1016/j.ebiom.2021.103337. Epub 2021 Apr 13. PMID: 33862583; PMCID: PMC8054154.】
近年的研究揭示了越来越多的circRNA能通过其开放阅读框和有效的核糖体结合元件直接翻译蛋白质，然而该机制是否参与精神类疾病致病机制目前尚未见正式报道。
针对以上临床和科学问题，2024年6月30号，东南大学及中科院深圳先进技术研究院/深圳理工大学张志珺教授、王玉田院士、孔岩副教授团队以“circFKBP8(5S,6)-encoded protein as a novel endogenous regulator in major depressive disorder by inhibiting glucocorticoid receptor nucleus translocation”为题在【Science Bulletin】（IF= 18.8）在线发表研究论文，东南大学焦娇博士、徐丹丹博士生、曹育嘉博士生、孔岩副教授作为本研究文章第一作者。
该研究创新性发现环状RNA-circFKBP8(5S,6)可通过编码新蛋白质cFKBP8调控糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor, GR）核转位参与抑郁发生，揭示了环状RNA做为抑郁障碍诊断生物标志物和分子干预靶标的十分重要的价值。
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1.高通量RNA测序分析筛选确定了具有翻译潜能的环状RNA
在前期探索队列研究中发现的MDD患者和健康组间共88个显著差异表达的环状RNA【Shi Y, Song R, Wang Z, Zhang H, Zhu J, Yue Y, Zhao Y, Zhang Z. Potential clinical value of circular RNAs as peripheral biomarkers for the diagnosis and treatment of major depressive disorder. EBioMedicine. 2021 Apr;66:103337. doi: 10.1016/j.ebiom.2021.103337. Epub 2021 Apr 13. PMID: 33862583; PMCID: PMC8054154.】，与已发表文献中多聚核糖体结合的环状RNA联合分析筛选出4种具有翻译潜能的环状RNA。构建终止密码子前插入3×Flag标签的环状RNA过表达载体并结合Western印迹检测发现，仅circFKBP8(5S,6)具有翻译潜能。该环状RNA是FK506结合蛋白8 （FK506-binding protein 8, FKBP8）基因截短的5号和6号外显子反向剪接产物。进化保守性分析显示circFKBP8(5S,6)在灵长类保守，而在啮齿类无同源环状RNA。使用针对该环状RNA特异反向剪接位点的特异引物进行RT-qPCR发现circFKBP8(5S,6)在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系中显著高表达，且抵抗RNA酶降解，加入转录抑制剂放线菌素D后，其半衰期显著高于FKBP8 mRNA。核质组分分离后，RT-qPCR结果显示circFKBP8(5S,6)主要分布在SH-SY5Y细胞的细胞质并得到荧光原位杂交进一步证实。
circFKBP8(5S,6)预测的开放阅读框开始于反向剪接位点下游80个核苷酸位置， 翻译越过反向剪接位点后终止于UGA终止密码子，产生一个127个氨基酸的蛋白质肽段，被命名为circFKBP8(5S,6)编码蛋白（cFKBP8）。该蛋白肽段序列显示，其N端104个氨基酸与FKBP蛋白序列相同，而C端23个氨基酸是独特的。HEK293细胞过表达circFKBP8(5S,6)后其编码蛋白可被能识别FKBP8蛋白N端104个氨基酸的商业化抗体检测到。将蛋白电泳凝胶目标位置蛋白条带切胶后进行液相色谱-质谱（LC-MS）分析确认了cFKBP8存在独特蛋白序列，证实circFKBP8(5S,6)可编码蛋白质。
与mRNA依赖于5’帽子结构不同，环状RNA主要通过内部核糖体进入位点（internal ribosome entry sites, IRES）或N6甲基腺苷酸（m6A）修饰。通过TransCirc数据库分析发现，circFKBP8(5S,6)无m6A修饰位点。通过荧光素酶报告实验检测了3个可能的IRES位点的翻译效率，结果发现IRES3序列可显著增强荧光素酶的活性。circFKBP8(5S,6)编码蛋白主要定位于细胞质。为了进一步检测该蛋白的内源表达情况，构建了针对circFKBP8(5S,6)编码蛋白特有的C端23个氨基酸的抗体，并以过表达circFKBP8(5S,6)或其编码蛋白的细胞作为阳性对照，发现了SH-SY5Y细胞内源表达circFKBP8(5S,6)编码蛋白。免疫荧光检测发现circFKBP8(5S,6)编码蛋白表达在食蟹猴背外侧前额叶皮层（dorsolateral prefrontal cortex, DLPFC）、海马、内嗅皮层和下丘脑等情感环路核心脑区，其中DLPFC表达量最高。与预测一致，在与DLPFC同源的小鼠前边缘（prelimbic, PrL）皮层未检测到该蛋白表达。将食蟹猴DLPFC脑区蛋白电泳并对目标位置蛋白进行LC-MS分析也证实了circFKBP8(5S,6)编码蛋白的独特肽段存在。总之，circFKBP8(5S,6)编码蛋白定位于细胞质并广泛存在于灵长类大脑，特别是DLPFC脑区。![]()
图1 被命名为cFKBP8的127个氨基酸肽段由MDD中差异表达的circFKBP8（5S,6）编码
地塞米松处理SH-SY5Y细胞应激模型中发现circFKBP8(5S,6)显著增加。通过shRNA靶向敲减SH-SY5Y细胞circFKBP8(5S,6)后高通量RNA测序发现54个上调基因和103个下调基因。DisGeNET 疾病相关分析发现差异表达基因显著富集于单相抑郁、焦虑和精神性抑郁。从严格匹配健康对照、慢性稳定型精神分裂症患者和未服药的MDD患者外周血成功分离得到神经元来源的外泌体（neuron-derived exosomes, NDEs）。RT-qPCR结果表明circFKBP8(5S,6)在MDD患者组NDE显著高于其他各组，鉴别诊断健康对照和抑郁症患者的AUC高达 0.94。另外，通过circFKBP8(5S,6)编码蛋白特异抗体对人尸检脑组织进行免疫荧光检测也证实了该蛋白在MDD患者显著增加。以上发现一致表明circFKBP8(5S,6)及其编码蛋白与抑郁障碍密切相关，并具有作为诊断标志物的高潜能。人脑类器官是近年来发展出的含有多种神经细胞并表现出主要皮层结构特点的三维培养体系。为建立该系统，健康对照和自杀未遂MDD患者外周血细胞重编程为诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs）, 进而分化为脑类器官并通过多种神经标志物检测证实构建成功。RT-qPCR结果表明 circFKBP8(5S,6) 在患者脑类器官显著增加。Sanger测序证实扩增产物含有该环状RNA的反向剪接位点。免疫荧光检测表明circFKBP8(5S,6) 编码蛋白也在患者来源脑类器官显著增加。
4. 环状RNA编码新蛋白阻止GR核移位诱导抑郁发生
由于circFKBP8(5S,6) 在小鼠中无同源环状RNA，初步采用病毒介导的过表达研究该环状RNA对抑郁样行为的影响。在小鼠双侧PrL区注射等量的对照病毒和过表达病毒，在2周的短期慢性不可预知温和应激（chronic unpredicted mild stress, CUMS）后，过表达circFKBP8(5S,6) 或其编码蛋白的小鼠即表现出应激易感性增加，而5周全程CUMS应激后，小鼠抑郁样行为更为严重，而过表达ATG突变的翻译缺陷的circFKBP8(5S,6)并无此效应。
为了进一步说明circFKBP8(5S,6)的功能，设计了针对其反向剪接位点的siRNA。该siRNA能特异抑制circFKBP8(5S,6)而不影响FKBP8 mRNA水平。免疫细胞荧光检测发现circFKBP8(5S,6)编码蛋白在SH-SY5Y细胞过表达抑制了地塞米松引起的GR入核，而采用siRNA将其敲减后该效应被逆转。通过分离细胞的核质组分进行Western印迹进一步证实了以上发现。与SH-SY5Y细胞实验结果一致，过表达circFKBP8(5S,6)或其编码蛋白CUMS应激小鼠PrL神经元核定位减少。进而在靶向敲减circFKBP8(5S,6)的MDD患者来源人脑类器官中得到反向证实。以上结果表明circFKBP8(5S,6)对抑郁样行为的影响主要依赖于其翻译成蛋白质的能力。
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图2 cFKBP8阻滞神经元HPA轴负反馈调控关键因子GR核转位导致抑郁发生
【1】本研究综合跨物种的研究体系相互印证了circFKBP8(5S,6)及其编码蛋白cFKBP8是抑郁障碍的诊断生物标记物，并深入阐明circFKBP8(5S,6)翻译蛋白cFKBP8可抑制神经元GR核转位促进小鼠抑郁样行为，揭示了GR功能失调导致下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA）轴紊乱参与抑郁发生的确切分子机制。![]()
circFKBP8(5S,6) 编码蛋白cFKBP8作为一种新的内源调控因子介导GR核转位参与抑郁症发病机制
【2】本研究深入探讨的具有编码蛋白功能的环状RNA正是前期研究基于病例对照极端性状策略结合高通量测序和生物信息学以及多重验证锚定的具有抑郁障碍诊疗潜能的外周血中两个候选circRNAs之一，从临床问题出发，系统深入的机制研究和严谨的闭环验证为MDD诊断标志物开发和药物靶标筛选提供了新思路和新实证，也充分体现了临床研究者坚持不懈的科研精神，为推动精准医学的转化和临床应用提供了新范式。
张志珺，博士（英国Sheffield大学医学院PhD），主任医师，教授，东南大学首席教授，东南大学神经精神医学研究所所长，国家杰出青年基金获得者，享受政府特殊津贴，国家卫生计生突出贡献中青年专家，中国杰出神经内科医师，先后获得国家级科研项目20余项，排名第一的省部级一等奖4项，发表SCI收录论文300余篇，尤其围绕情感认知障碍诊断生物标记物筛选确定和发病机制研究与神经调控干预取得了系列创新成果，获得中国发明专利授权十余项，2014年始连续十次获得“中国高被引学者”，入围全球神经科学top2%影响力学者，全球top2%顶尖科学家榜单等。
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