遗传学是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等；而表观遗传学则是指基于非基因序列改变所致基因表达水平变化，如DNA甲基化和染色质构象变化等。所以表观遗传学绝对占据分子生物学科研界的半壁江山，尤其是最新的一些热点研究方向，如ceRNA转录后调控机制、m6A RNA甲基化修饰、Hi-C染色质构象等，以及今天小编给大家分享染色质可及性调控。
图1 染色质结构图：DNA 缠绕在核小体周围，形成染色质纤维，然后再形成染色体
01 什么是染色质可及性以及研究意义？
染色质可及性又称染色质开放程度，反映了染色质的转录活性状态，是研究基因表达调控的重要方向，在表观遗传图谱绘制、细胞分化和发育及各类疾病的发生发展研究中具有重要的作用。
真核细胞染色质被紧密地包装成一系列核小体组蛋白八聚体，每个组成的核心被147 bp的DNA缠绕近两圈，然后被包含特定限制性核酸内切酶识别位点的DNA 序列分隔开。大多数基因组中的染色质都紧紧盘绕在细胞核内，但也有一些区域经染色质重塑后呈现出松散的状态，这部分无核小体的裸露DNA区域被称为开放染色质或染色质可接近区域。
真核生物转录调控过程是大量的顺式调控元件与反式作用因子相互作用的结果，具有调控功能的顺反元件通过结合染色质开放区域参与到真核生物转录调控的过程中以控制转录活性。比如，转录因子一旦结合到开放的染色质区域，就会招募其他蛋白，使附近的基因开始转录。
染色质开放程度不是静止的，是具有时空特异性，动态变化的，因此，高效精确地定位基因组上的开放染色质位点、搞清核小体位置的动态变化，为成功地发掘基因组调控元件，乃至揭示基因表达调控机制提供重要线索和有效手段。
目前常用的检测方法有以下3种：
DNase-seq：利用限制性内切酶（DNase I）优先切割核小体被取代的DNA序列，对生成的片段进行测序，被用于检测特定转录因子的结合位点。能够被DNase切割的位点也被称为DHS，即DNase超敏感位点（DNase hypersensitive sites）。
MNase-seq：和DNase-seq原理类似，探测区域互补，MNase-seq使用的酶是限制性外切酶。
ATAC-seq：Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing，改造的Tn5转座酶，不具有切割能力，通过Tn5转座酶，将易接近转座酶核染色质区域序列复制出来。
03 ATACseq对样本的要求?
1）新鲜细胞或新鲜组织制备的细胞悬液：500~50000个，细胞活性>80%；
2） 以往冻存组织：可提取细胞核进行ATACseq实验；
研究背景：
老年性黄斑变性（AMD）是60岁以上人群中最常见的不可逆视力损害，患者随着全球人口老龄化逐年增加。该病的早期特征会出现玻璃膜疣，视网膜色素上皮（RPE）色素异常，进行性感光功能障碍等。
1. 现代医学技术对于占90%AMD病例的萎缩干性AMD，没有任何有效的治疗方法。
2. 目前，GWAS分析已经鉴定出至少34个AMD基因风险位点，然而，这些基因变异只解释了AMD病例的一部分。
3. 吸烟和肥胖等变量在AMD发病中也起着非常重要的作用。该研究对较少报道的干性AMD进行全基因组染色质可及性（ATAC-seq）研究，观察与AMD发病和发展相关的染色质可及性情况。
研究内容及结果：
1. 研究材料
去世14小时内的眼球，8个正常眼球（来自5名健康捐献者）；3个早期干性AMD眼球、5个晚期干性AMD眼球（来自5名AMD患者）；分离视网膜和视网膜色素上皮，然后在黄斑部和周边区域穿孔（直径6mm）获得视网膜或视网膜色素上皮组织；
图3 眼球解剖示意图
2. 测序方案
ATACseq：illumina Hiseq2500：2 x 50bp
RNAseq：AMD2病人的视网膜、色素上皮；RIN>7，poly A富集，illumina Miseq；
GEO数据：GSE29801 ，包括正常、早期AMD、晚期AMD的表达数据；
DHSseq：ENCODE project下载，125份细胞或组织的DNase-seq数据
3. 研究结果
3.1 染色质可及性图谱
图4 正常眼睛的全基因组染色质开放情况
在所有视网膜样本中识别出78795个高置信度开放染色质区域（peak），在所有RPE样本中识别出49217个峰。视网膜中的染色质可及性总体上高于视网膜色素上皮，这可能反映了视网膜中细胞类型相对于视网膜色素上皮的显示出更高的多样性。
图5 视网膜组织和视网膜色素上皮细胞共有峰及特异峰
视网膜和RPE共有39394个Peak峰（42.0%），38625个（41.1%）是视网膜特异性峰，15844个（16.9%）是RPE特异性峰（图5），在视网膜和RPE共有的绝大多数峰（81.7%）也存在于其他组织中。
3. 2 AMD患者视网膜组织及视网膜色素上皮细胞ATACseq数据分析
通过比较健康和AMD样本中每个峰的信号，发现72689个峰（92.3%）降低了AMD患者的染色质可及性。在所有AMD患者RPE样品中，91.6%的峰显示AMD相对于正常样品的强度降低。
排除潜在的遗传和环境差异的影响，从AMD状态不对称的眼睛分析，发现与患病程度较轻的眼睛相比，较严重的眼睛黄斑视网膜及视网膜色素上皮细胞均有大量峰值的强度降低。对于双眼处于同一疾病阶段的供体，其黄斑视网膜及视网膜色素上皮细胞的染色质可及性轮廓高度对称。
3. 3 早期和晚期AMD ATACseq数据分析
将早期AMD的视网膜样本与健康对照组的视网膜样本进行比较时，观察到3个峰值强度显著降低。然而，通过比较晚期AMD视网膜样本和早期AMD视网膜样本，观察到939个峰值，其强度显著降低，提示视网膜染色质可及性变化主要发生在疾病晚期。将早期AMD的RPE样本与健康对照组的RPE样本进行比较时，观察到5458个显著降低的峰，但是当相同的早期样本与晚期AMD的RPE样本进行比较时，只观察到2个显著降低的峰。所以AMD的发生可能有以下机制：
3.4 ATACseq与RNAseq的联合分析
3.4 基因富集分析
视网膜中的DAR相关基因更可能调节视网膜层的分层和感光细胞的存活，而RPE中的DAR相关基因更可能调节炎症反应和凋亡，这是AMD的重要生物学过程。
3. 5 功能研究：香烟烟雾对染色质可及性的影响
将iPSC衍生RPE细胞暴露于香烟烟雾提取物中，并在烟雾处理前后进行ATAC-Seq分析。处理后RPE细胞染色质可及性整体下降。更重要的是，当比较吸烟处理过的iPSC衍生RPE细胞和AMD患者RPE细胞时，发现染色质可及性的变化高度相关（R=0.36，P<10-20）。
这些结果表明，在RPE细胞中吸烟会导致染色质可及性的广泛降低，这与AMD中的情况非常相似。
3. 6 功能研究:HDAC11过度表达导致染色质可及性降低
通过RNA-seq找到在AMD发展过程中可以引起染色质可及性变化的差异表达基因。在所有组蛋白脱乙酰酶（HDAC）基因中，发现AMD和对照组之间有三个基因（HDAC10、HDAC11、SIRT1）显著差异表达。然而，HDAC11在RPE中的表达在疾病早期显著增加（图d），并且主要局限于RPE细胞的细胞核（图e）。并观察到HDAC11高表达细胞的染色质可及性相对于转染空载体的细胞普遍降低（图f）。HDAC11过度表达引起的变化与AMD患者RPE的变化非常一致（图g）。这些结果说明HDAC11的过度表达可能是AMD进展中染色质可及性降低的部分原因。
研究结论：
老年性黄斑变性（AMD）是老年人视力下降的重要原因，表观遗传改变在多大程度上调节AMD的进展尚不清楚。
1. 该研究使用ATAC-Seq对AMD患者和对照组的视网膜和视网膜色素上皮细胞（RPE）的染色质可及性进行了全局性分析，染色质可及性的整体下降发生在早期AMD的RPE和晚期疾病的视网膜中，这表明RPE的功能障碍导致疾病的发生。
2. 光感受器和RPE特异性转录因子的足迹在差异可及区域（DARs）中富集，与DARs相关的基因在AMD中表达改变。
3. 吸烟对RPE细胞的处理再现了AMD患者染色质可及性的变化，为AMD的已知危险因素与AMD病理学之间提供了表观遗传学联系。
4. HDAC11的过度表达是导致染色质可及性下降的部分原因，提示HDAC11可能是AMD潜在的新治疗靶点。
参考文献：Wang J, Zibetti C, Shang P，et al. ATAC-Seq analysis reveals a widespread decrease of chromatin accessibility in age-related macular degeneration. Nat Commun. 2018 Apr 10;9(1):1364
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