根际微生物群落与植物根系之间发生的相互作用，包括益生菌和病原类型，对植物生理性能产生显著影响。因此，针对根际微生物群的靶向调控，未来将成为可持续作物生产的有效策略。化肥的过度使用和单一作物的强化应用破坏了土壤微生物生态系统的平衡，导致有益微生物种群的中断，并加剧了作物病害的流行。根际微生物群移植（RMT）是植物病害管理的另一个有力工具。以往的研究表明，来自抗性供体的RMT可以正向调节土壤中的保护性微生物群，并有助于抑制枯萎病。
核心微生物组由那些持久、高度丰富、适应性强的微生物物种组成，这些物种具有广泛的生态位、高效的协同互动能力和对不同栖息地的耐受性等特点，它们与宿主植物在多样化的环境中保持着紧密联系。核心微生物组的发现和推断来源于“组学”数据的相关性分析，因此需要更为准确反映微生物群落结构的绝对丰度这一关键数据来筛选“核心微生物组”。
以往的研究主要集中在在无菌土壤条件下引入单一核心菌株。然而，自然环境中包含着复杂的原生微生物群落。这些天然微生物群可以显著地提升注入引入菌株的有效性和行为。与传统的逐个菌株的方法相反，合成群落（SynComs）已经作为一种有效工具崭露头角，它能在非无菌环境中提升植物健康并赋予其抗性。通过精心设计的微生物组合，SynComs能够模拟自然界的复杂相互作用，从而更全面地支持植物生长，抵御病害，并提高作物产量。这种方法超越了单一菌株的局限，利用多种微生物间的协同效应来增强植物的适应性和抵抗力。SynComs由核心微生物组成，它们共同努力以实现特定的功能，如疾病控制、耐盐性和改善植物生长。SynComs通常是基于这些微生物的相互作用而设计和构建的。鉴于在非无菌环境中（特别是在根际）代谢物的高度复杂性，代谢物交换可能驱动植物微生物群落中的物种相互作用，如交叉摄食产生的协同作用。菌群中的协同相互作用在促进植物生长和缓解胁迫方面显示出了良好的潜力。然而，利用健康根际核心微生物群优化构建syncom及其在促进植物生长和健康方面的有效性仍存在一些争议。
针对以上问题，2024年6月5日，南京农业大学沈其荣院士和凌宁教授团队的科研人员在《Microbiome》（IF=15.5，一区Top）上发表题为“Synthetic community derived from grafted watermelon rhizosphere provides protection for ungrafted watermelon against Fusarium oxysporum via microbial synergistic effects”的研究论文，本研究发现合成微生物群落SynCom显著促进了未嫁接西瓜的生长并增强了其抗病性，假单胞菌在其中起到了关键作用。本研究利用天昊生物Accu16S®细菌绝对定量测序专利技术（V4-V5区），对不同肥力梯度土壤中的细菌群落进行绝对定量分析，发现这些SynCom微生物在9种不同肥力梯度的土壤中都有分布。
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1. 田间实验设计与土壤样品采集：
在中国南京蔬菜花卉科学研究所进行田间试验，选择黄棕壤土质，将西瓜种植区划分为两部分，一部分是连续种植的非嫁接西瓜，另一部分是连续种植的嫁接西瓜（葫芦砧木）。每部分有两块地，采用随机区块设计。自2014年起每年春季和秋季进行种植，每块地移植16株幼苗，连续种植8年直到2022年。在2022年10月西瓜开花期，从连续种植非嫁接西瓜和嫁接西瓜的地块中选取生长相似的植株，每块地选7株，共收集28株样本。样本在冰上安全运输至实验室，用无菌水洗涤根部并离心分离根际土壤，最后将样本储存于-80°C下。使用先前描述的方法稍作修改，从嫁接西瓜根际土壤中分离出相关细菌，进行16S rDNA全长测序，并保存在30%甘油中于-80°C。研究不同肥力土壤混合比例下微生物群落组成，以确定核心微生物。将高肥力和低肥力土壤按九种不同比例混合，所有分离的细菌等量接种到各处理中，在暗处培养90天后提取DNA，进行16S rRNA绝对定量测序和相关性分析【Genesky Biotechnologies, Inc., Shanghai, China；上海天昊生物科技有限公司完成】。使用“Shannon-Wiener”指数分析生态位宽度，反映物种在不同肥力土壤中的分布广泛性和均匀性，计算得到的结果用于区分广域物种和专一物种。基于细菌在不同肥力土壤中的分布和适应性，选择核心细菌，构建由16个核心菌种组成的合成群落，并评估其在非无菌环境下提高植物健康的效果，特别是在生物胁迫下的作用。通过体外共培养实验和细菌代谢组学分析，筛选出与假单胞菌有协同效应的7个合成群落成员，从而简化初始合成群落为包含这8个选定细菌物种的简化合成群落。
为探索嫁接植株根际微生物群的抑病潜力，开发有效的抑病SynCom，建立了嫁接西瓜根际394株菌的文库。经过一系列实验，最后筛选了16个核心微生物，包括如下菌种：
墨西哥假黄单胞菌 Q1 (Pseudoxanthomonas mexicana)；土壤伪红球菌 Q2(Pseudorhodoferax aquiterrae)；大田根瘤菌 Q3 (Rhizobium daejeonense)；溶壁菌属 Q4 (Lysobacter panacisoli)土壤黄杆菌 Q5 (Sphingopyxis soli)；铜绿假单胞菌 Q6 (Pseudomonas aeruginosa)；突尼斯固氮螺菌 Q7 (Ensifer numidicus)；孔州诺卡氏菌 Q8 (Nocardioides kongjuensis)；树木微杆菌 Q9 (Microbacterium arborescens)；布干达肠杆菌 Q10 (Enterobacter bugandensis)黏液色杆菌 Q11 (Achromobacter mucicolens)；吉林奥利维杆菌 Q12 (Olivibacter jilunii)中间气单胞菌 Q13 (Aeromonas media)；伊纳亚博塞氏菌 Q14 (Bosea eneae)球节杆菌属 Q15 (Arthrobacter sp.)；坑氏不动杆菌 Q16 (Acinetobacter pittii)。为了进一步评价核心微生物对未嫁接西瓜植株健康的影响，将这16个核心菌株组合构建了一个合成群落，以下简称SynCom。
本实验设计了4个在温室条件下不同的处理组，未嫁接的西瓜植株分别接种无菌水（CK）、SynCom（SBC）、尖孢镰刀菌（FON）以及SynCom和尖孢镰刀菌（SBC+FON）。结果显示，SBC组的生长明显优于CK组和FON组，身高和鲜重值显著高于CK组，干重比CK组高29%（图1）。SBC+FON组的株高、鲜重和根重显著高于FON组（图1a–d）。此外，与FON组相比，SBC+FON组赋予未嫁接西瓜植株显著的抗病性（图1g，h）。具体而言，SBC+FON组的疾病指数（减少55.6%）和尖孢镰刀菌丰度（减少8.4%）显著低于FON组（图1g–j）。当将SBC+FON组与FON组进行比较时，相对对照效果达到68.0%（图1k）。此外，在接种了SynCom的条件下，有11株菌株（靶向asv）能够成功地定植根系(图。S7；补充方法1.9和2.1)。而SynCom的其他五个成员没有显示，因为它们低于过滤标准（图S8）。总的来说，接种SynCom可以增强植物生长和抗病性。
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图1合成群落促进西瓜植株的生长并缓解病害
3. SynCom接种后根际细菌群落特征的变化以及SynCom触发的西瓜根际群落功能响应
为阐明SynCom保护作用的潜在作用机制，比较了4个处理组的根际微生物群落组成和宏基因组。观察到FON组的微生物多样性明显低于其他处理组（图2a）；然而，SBC+FON组的多样性与CK和SBC组相当，表明SynCom接种可使微生物多样性正常化，以应对病原菌侵染。使用Bray–Curtis距离的PCoA显示SBC+FON和FON组的微生物群之间存在显著差异（图2b）。属水平注释显示，接种syncom后，假单胞菌、肠杆菌、螺红溴杆菌和链霉菌成员的相对丰度增加（图2c）。这16株目标ASVs所属菌株的相对丰度总和在SBC和SBC+FON组别中高于CK和FON组别（图2d）。并且这16株菌对应的ASVs的相对丰度总和与病原体丰度呈现显著负相关（图2e）。SBC组和SBC+FON组的微生物网络分别比CK组和FON组复杂得多，节点和边缘数量更多，模块化程度更高（图S9a-f），并且网络稳定性更高。接种SynCom也在一定程度上提高了群落的积极凝聚力，有可能促进群落微生物合作，从而促进抗病能力(图。S10)。
使用宏基因组学来观察由SynCom触发的根际群落的功能特性。结果表明，SBC和SBC+FON组的微生物组的功能组成与CK和FON组的微生物组有显著差异（图S11a-c）。为进一步表征微生物的功能，将所有基因注释到KEGG数据库中。将报告基因特征算法与KEGG代谢网络、通路注释和相对基因丰度（TPM）相结合，发现CK和SBC组之间以及FON和SBC+FON组之间的KEGG通路丰度存在显著差异。值得注意的是，SBC和SBC+FON组的相同的途径被富集，包括双组分系统、生物膜的形成等。（图2f)。syncom处理组（SBC和SBC+FON）也显著增加了参与RNA加工、修饰和细胞运动的模块的丰度(图。S11d)。接种SynCom显著增加了根际假单胞菌的丰度（图2c）并展现出了有效定植植物根系的能力（图S7）。相关性分析揭示了假单胞菌（ASV 37）的相对丰度与根际病原体丰度之间存在显著的负相关关系（图S12）。此外，宏基因组学分析显示，在接受合成群落（SynCom）处理的组别中，假单胞菌生物膜合成途径显著富集。因此确定假单胞菌在增强植物健康方面起着核心作用。之后观察合成群落（SynCom）接种在假单胞菌生物膜形成途径中引发的基因层面的变化。宏基因组分析揭示，在SBC和SBC+FON组别中，与CK和FON组别相比，假单胞菌生物膜形成途径中有总计16个显著富集的基因（图2g）。大多与c-di-GMP信号通路、Gac/Rsm通路和Psl多糖的生物合成有关，显著促进了细菌的运动和生物膜的形成。进一步鉴定了这些显著富集基因的物种分类起源。流向图显示，这些富集的基因主要来源于合成群落（SynCom）的成员（图2h-i）。综上结果表明，假单胞菌在西瓜植株的病害抑制和促进生长过程中起着关键作用，而SynCom的其他成员驱动了假单胞菌生物膜形成途径的富集。![]()
图2接种SynCom的植物根际微生物群落组成和功能形态的变化
基于上述扩增子和宏基因组学分析，推测SynCom成员与假单胞菌之间的协同作用有助于假单胞菌在根际系统内的生长和定植，最终促进植物生长。为进一步验证这一假说，采用体外共培养系统来评估SynCom菌株对假单胞菌的协同效应。
为更深入地确定核心菌株之间的相互作用，采用上清液实验和代谢组学分析。将每个菌株培养在其他合成群落（SynCom）成员的无菌培养废液（SM）中，以此评估由各SM中的代谢废物或细菌素介导的合成群落成员之间的相互作用。结果显示，墨西哥假黄单胞菌Q1 (P. mexicana Q1)、土壤伪红球菌Q2 (P. aquiterrae Q2)和伊纳亚博塞氏菌Q14 (B. eneae Q14)的上清液强烈促进了大约60%的合成群落菌株的生长（OD600值在废液培养后/新鲜培养基培养前>1）（图3a）。为确定SynCom菌株内相互作用的方向性和模式，构建了基于OD600废/新鲜值的相互作用矩阵。该矩阵主要将菌株之间的相互作用分类为竞争性（-/-，120个相互作用中的34个）或无盐性（0/-或-/0，120个相互作用中的30个）（图3b）。结果发现，有7株菌株促进了铜绿假单胞菌Q6的生长（即与铜绿假单胞菌Q6呈正相互作用（+））。其中，有3株菌株与铜绿假单胞菌Q6发生了相互作用（+/+）（图3b）。为探究代谢促进是否驱动了铜绿假单胞菌Q6 与这七种菌株之间的协同合作，对这八种菌株的上清液（SM）进行了代谢组学分析，揭示了这些SM可变的代谢组学特征（图3c）。此外，通过评估底物消耗谱的重叠情况（图3d），发现铜绿假单胞菌Q6与其他七种菌株的重叠程度较低。将上清液中促进生长的程度（OD600 spent/fresh）与底物消耗谱的两两重叠程度（图3d）相关联，结果显示较小的重叠度与在相应的上清液中更强的生长促进作用相关（R^2=0.28, P<0.001, 图3e）。值得注意的是，铜绿假单胞菌Q6与其他七种菌株的底物消耗重叠度较低，并在体外实验中展示了强烈的协同生长效应（OD600 spent/fresh > 1, 红色点）（R^2=0.84, P=0.003, 图3e）。为探索铜绿假单胞菌Q6与表现出互利关系的三种菌株之间的潜在交叉喂养代谢物，深入研究了这些菌株上清液的代谢组学数据，寻找在这些菌株中富集（或耗尽）的特征。在这些菌株的上清液中鉴定出诸如N-乙酰丝氨酸和赖氨酸-羟脯氨酸（图3f）等化合物，表明这些物种之间存在代谢交叉喂养的可能性。总之，这些结果清楚地表明，菌株间的生长促进主要归因于底物消耗谱的较小重叠。![]()
图3单个SynCom菌株之间的体外相互作用基质和底物消耗特性
进一步检验了由8个细菌菌株组成的精简合成群落（包含铜绿假单胞菌Q6及其对其有协同效应的七种菌株，以下简称SSC8）在未嫁接西瓜植株上的生长促进效果。观察到，与对照组（CK）相比，SSC8组的植株显示出显著增强的生长（图4a）。值得注意的是，SSC8组植株的生长参数，包括植株高度、根重和干重，与初始合成群落（SBC）组相当（图4b-d）。然而，当铜绿假单胞菌Q6与合成群落的其他菌株组合（SSC4D和SSC8D组）时，它们的生长促进效果明显弱于SBC组。这些结果支持了这样一个假设：精简的合成群落可以通过其中微生物之间的协同作用诱导有益效果，从而像初始合成群落一样促进植物健康。
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图4 精简合成群落对植物生长的影响
1、本研究通过创新型细菌绝对定量测序专利技术发现以及构建16种核心细菌组成的SynCom，评估了其在非无菌环境中提高植物健康方面的有效性，发现嫁接西瓜根际合成的合成群落通过微生物协同效应为未嫁接西瓜提供免受尖孢镰刀菌的保护机制。2、合成微生物群落（SynCom）的发现和构建不仅在环境领域有重要的作用以及广阔前景，而且在医学研究领域迫切需要广泛深入地研究和挖掘其重大研究价值，尽早实现商业应用造福人类。3、本研究通过技术创新发现、构建、优化功能SynCom体系，强调核心微生物组通过高效的合作交互协同功能机制维持植物的健康状态，为提高西瓜产量和栽培提供技术、科技保障，助力推进粮食增产、农业增效、农民增收，筑牢“国之大者”的粮食安全体系，确保稳固粮食生产能够呈现风雨安稳如山的底气和定力，助力中国式现代化这艘航船劈波斩浪、行稳致远。
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