结直肠癌（CRC）是一种恶性程度高的消化道肿瘤，近年来其发病率一直在上升，大多数CRC患者由于诊断晚期而无法接受手术治疗。基于CRC标志物及其相关信号通路开发的新型靶向药物和免疫疗法取得令人鼓舞的治疗效果。然而，肿瘤高度异质性和缺乏早期检测限制了CRC治疗的有效性。癌症中早期频繁发生的DNA甲基化变化被认为是开发强大的诊断、预后和预测生物标志物的有希望的靶点。筛查、识别、验证准确的甲基化生物标志物将提高CRC治疗的有效性。神经球蛋白（NGB）是血红蛋白家族的一个成员，最初在人类和小鼠的大脑中被发现。NGB在神经系统疾病和神经系统肿瘤中的作用已有广泛报道。然而，其在非神经系统肿瘤中的功能，如结直肠癌、乳腺癌、肝癌和肺癌，仍有待详细探索。目前尚无关于NGB在CRC中涉及表观遗传调控的报道。
针对以上问题，重庆医科大学附属第一医院肿瘤科/重庆大学肿瘤医院向廷秀教授团队在《Clinical Epigenetics》杂志发表题为“”的文章，本研究通过甲基化靶向【Methyltarget方法】技术结合蛋白质组学、功能实验方法等证实NGB作为肿瘤抑制因子的角色，发现NGB启动子甲基化而影响基因表达和蛋白下调， 进而通过靶向NGB-GPR35轴抑制肿瘤炎症和肿瘤血管生成，这些结论为CRC的病理机制提供了新的见解，NGB-GPR35轴有可能作为CRC药物靶点。
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文献回顾：收集和分析与NGB、CRC、肿瘤抑制因子、GPR35和血管生成相关的文献。实验材料准备：获取CRC细胞系、CRC组织样本、裸鼠模型、NGB表达质粒等。RNA提取与质检：从CRC细胞和组织中提取总RNA。RT-PCR和qRT-PCR：逆转录RNA并定量分析NGB的表达水平。DNA甲基化检测和分析：使用Methyltarget多重基因甲基化技术检测分析NGB启动子的单点/区域/基因/单倍体型/甲基化差异水平【由Genesky Biotechnology Inc., Shanghai, China上海天昊生物科技有限公司完成】。细胞系构建：将NGB表达质粒转染到CRC细胞中，构建稳定表达NGB的细胞系。细胞功能实验验证：CCK8实验：评估NGB对细胞增殖的影响。Transwell实验：评估NGB对细胞迁移和侵袭的影响。裸鼠异种移植模型：将稳定表达NGB的CRC细胞移植到裸鼠中，评估NGB在体内的抗肿瘤活性。组织学和免疫组化分析：分析肿瘤生长、血管生成和细胞增殖情况。iTRAQ蛋白质组学分析：分析NGB过表达后CRC细胞中差异表达的蛋白质揭示可能的调控通路。临床样本验证：在大规模临床样本中验证NGB作为CRC生物标志物的潜力。1. 神经球蛋白在结直肠癌中低表达，由启动子区域的甲基化负调控引起
通过UALCAN数据库分析显示，与相邻正常组织相比，CRC样本中NGB的表达水平较低，同时NGB的甲基化状态较高，免疫组化染色进一步证实了在结肠肿瘤组织中NGB蛋白的水平低于正常结肠组织（图 1A）。人类蛋白质图谱（Human Protein Atlas, HPA）数据库也显示了类似的趋势，其中近一半的CRC组织表现出弱或阴性的NGB表达，而几乎所有正常结肠组织均显示中等强度的表达。
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图1 NGB在结直肠癌（CRC）中由于启动子甲基化而下调
尽管NGB的表达水平与CRC患者的生存无显著相关，但高表达的NGB可能有助于保护患者免受复发。与正常结肠细胞相比，CRC细胞系具有较高的甲基化状态，而使用去甲基化剂5-氮杂胞苷（5-aza-2'-deoxycytidine, Aza）处理后，NGB的mRNA表达可以恢复，其启动子区的甲基化水平显著下降。这些结果表明NGB是一个由于启动子区域高甲基化而呈现下调的基因，并且与CRC中的肝转移负相关。
在CRC组织中，NGB因启动子甲基化而下调，并且异位表达NGB能够抑制癌细胞增殖、抑制细胞凋亡并引起细胞周期停滞。在裸鼠异种移植瘤模型中，NGB延缓了肿瘤生长并抑制了肿瘤内血管内皮细胞的浸润。血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）是促进血管内皮细胞生长的关键生长因子，对于肿瘤血管生成至关重要。NGB的抑癌作用似乎是通过抑制GPR35/血管生成轴介导的。因此，当前的发现表明NGB不仅可能作为新的预测生物标志物，而且可能是评估CRC转移风险的有效标记物。
NGB启动子的甲基化位点位于77,736,853到77,736,735之间，由天昊生物Methyltarget技术进行检测，能够区分肿瘤与相邻组织（图2A）。通过MSP（甲基化特异性PCR）检测到结直肠癌组织中的NGB甲基化率为95.3%（61/64）（图2B）。这些结果表明，NGB由于启动子的高甲基化而频繁地被下调，并且与结直肠癌的肝转移呈负相关。
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图2 Methyltarget结果展示结直肠癌组织中NGB的甲基化状态2. 神经球蛋白抑制结直肠癌进展和肿瘤生长的作用机制
神经球蛋白（Neuroglobin, NGB）通过影响肿瘤炎症来抑制结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）的发展和肿瘤生长。研究发现NGB过表达显著抑制了HCT116和Caco2细胞的增殖（图3B），并导致对照组中形成的克隆数量更少、体积更小（图3C）。流式细胞术分析显示，NGB过表达导致细胞周期在G2/M阶段积累（图3D）。Annexin V-FITC/PI染色评价了NGB对CRC细胞凋亡的影响，结果表明在NGB过表达的Caco2和HCT116细胞中，Annexin V和PI双阳性细胞的比例高于对照组（图3E）。这些结果表明NGB通过引起G2/M期细胞周期停滞和诱导细胞凋亡来抑制CRC细胞的增殖。
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图3 NGB抑制癌细胞增殖，并在体内和体外抑制肿瘤生长
Transwell实验评估了NGB对肿瘤细胞转移的影响，结果显示NGB过表达组细胞穿过膜的数量少于对照组细胞（图3F、G）。通过Western Blot评估了调节细胞间粘附的蛋白质，数据显示在NGB过表达组中，E-钙黏蛋白水平升高，N-钙黏蛋白和波形蛋白水平降低。这些数据证明了NGB能够抑制CRC细胞的迁移和侵袭。
带有或不带有NGB过表达的HCT116细胞分别被植入裸鼠两侧皮下。经过20天观察后，取出移植瘤进行进一步分析。NGB过表达组的肿瘤生长明显受阻，肿瘤体积和重量受限（图3H–J）。这些数据表明NGB可能通过抑制炎症细胞浸润和肿瘤内皮形成来抑制裸鼠体内的肿瘤发生和生长。
团队进一步研究了NGB过表达引起的变化，并通过iTARQ蛋白质组学分析鉴定出278个差异表达蛋白（DEPs）此外，DEPs的折叠变化阈值鉴定出23个下调蛋白和17个上调蛋白（图4A），其中约37.5%（15/40）与细胞间粘附、侵袭、肿瘤血管形成和肿瘤微环境（TME）有关。基因集富集分析（GSEA）揭示，与对照组相比，NGB在上皮-间质转化（EMT）途径、调控内皮细胞血液管形成和VEGFA VEGFR2（VEGF受体2）信号通路中呈负富集。GSEA显示NGB与调控通路之间的负相关性与异种移植模型中观察到的NGB抑制内皮细胞迁移一致。考虑到肿瘤血管生成是TME中肿瘤侵袭和迁移的营养来源，进行了内皮管形成实验来评估血管生成。结果显示，与对照组相比，在NGB-OE培养基中，HUVEC-C细胞的分支和管形成较小（图4B）。用NGB-OE细胞条件培养基（CM）培养后，HUVEC-C的细胞活力和迁移能力降低。免疫荧光（IF）分析显示，在NGB转染后48小时，CD31在HCT116和Caco2细胞中下调（图4C）。Western blot分析显示，在HCT116和Caco2细胞中，随着NGB-OE，肿瘤血管生成通路的激活因子下调。这些数据证明，NGB过表达抑制了HCT116和Caco2细胞中的肿瘤血管生成通路。
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图4 NGB过度表达抑制结直肠癌细胞的肿瘤血管生成能力
通过质谱分析，团队发现G蛋白偶联受体35（GPR35）作为新生血管化的重要调节因子，与NGB呈负相关，因此成为下游探索的理想候选者。NGB过表达在HCT116和Caco2细胞中降低了GPR35的转录和翻译水平。免疫沉淀（IP）实验使用抗NGB抗体证实GPR35是NGB的相互作用蛋白。免疫荧光（IF）实验显示NGB过表达下调了HCT116和Caco2细胞中的GPR35。在用环己酰亚胺处理的HCT116细胞中，NGB破坏了GPR35的蛋白稳定性。这些结果表明NGB和GPR35相互结合，且NGB促进GPR35蛋白的降解，从而很可能减少其半衰期。
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图5 NGB通过促进GPR35的降解来下调其表达
5. 异位表达GPR35逆转NGB诱导的结直肠癌细胞肿瘤血管生成抑制
GPR35是肿瘤微环境（TME）中新血管生成的上游因子。然而，控制GPR35的上游因素尚待报道。本研究提供证据表明，脑红蛋白（Neuroglobin, NGB）与GPR35相互作用并诱导其降解（见图5）。为了检验NGB介导的GPR35下调对肿瘤新生血管生成的影响，团队在HCT116细胞中进行了救援实验。在稳定过表达NGB的HCT116细胞中，GPR35的mRNA和蛋白质表达得到了救援（见图6A、B）。如图6B第2条所示，GPR35的恢复增加了VEGFR2和pErk1/2的蛋白水平。相比之下，尽管在第4条中GPR35得到了救援，NGB过表达组的VEGFR2蛋白水平仍然保持降低。在NGB缺失的组中，GPR35的恢复激活了肿瘤新生血管生成。然而，在NGB过表达培养基组中，分支和管形成仍然受到抑制（见图6C）。此外，NGB过表达降低的侵袭和迁移能力通过GPR35重新表达得到了救援（见图6D）。综上所述，这些结果表明NGB可能通过下调GPR35/新生血管生成轴来抑制肿瘤转移。图6 NGB过度表达抑制肿瘤血管生成和细胞转移，这些效应可以通过重新表达GPR35来逆转
1. 本研究首次系统地探讨了神经球蛋白（NGB）在结直肠癌（CRC）中的作用，证实了NGB作为肿瘤抑制因子的角色，为CRC的病理机制提供了新的见解。2. 通过多种和组学实验技术，本研究揭示了NGB通过影响GPR35的稳定性来抑制肿瘤血管生成的机制，这一发现为CRC的治疗提供了新的靶点和策略。3. 本研究为开发基于NGB的CRC个性化治疗策略奠定了基础，有助于提高CRC患者的治疗效果和生活质量。4. 后续研究可以更加系统结合基因组学、转录组学、蛋白质组学和表观遗传学等多组学数据，可以更全面地理解NGB在CRC中的作用和调控网络。
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