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【Arch Toxicol】南京医科大学第一附属医院傅赞团队成果，细胞衰老基因通过遗传和表观遗传方式调控导致结直肠癌进展

文摘 2024-10-10 22:32 江苏

导读

结直肠癌是全球第二大常见且第三大致命的恶性肿瘤。在中国，2022年结直肠癌占所有新发癌症病例的12.2%（约56万例），仅次于占病例数17.9%的肺癌。结直肠癌的发病机制显著与遗传和表观遗传改变有关，这些改变进一步受到环境因素的影响。近年来，多项全基因组关联研究已经鉴定了超过200个与结直肠癌发展相关的遗传风险变异。然而，这些变异及其相关基因对于解释多效性和结直肠癌的遗传关联是不够的。因此，需要进一步研究遗传变异与结直肠癌之间的关联，以揭示未被发现的潜在致病基因。

DNA甲基化受潜在遗传变异显著影响，决定基因组结构和功能。甲基化定量性状位点（meQTLs）为遗传学与表观遗传学之间提供了重要的功能性联系。它们有助于解读全基因组关联研究中存在的风险等位基因，并发现新的疾病相关候选基因。因此，基于遗传和表观遗传背景识别更多与结直肠癌风险相关的位点至关重要。

细胞衰老是指在生物体发育或成熟阶段永久停止细胞周期的现象，是一种新认识的癌症标志物。处于暂时和可逆衰老状态的肿瘤细胞可以逃脱衰老并重新进入细胞周期，导致更具侵袭性的肿瘤复发。最近的研究表明，细胞衰老过程是结直肠癌的重要致病机制。几项研究表明，DNMT1抑制剂可以触发p16启动子的去甲基化及类似衰老的表型。然而，细胞衰老基因（CSGs）中的遗传变异研究以及DNA甲基化的调控机制仍然不清楚。

针对以上科学问题，南京医科大学第一附属医院（江苏省人民医院）傅赞教授团队【沈恒阳为第一作者】和南京医科大学公共卫生学院黎书炜教授团队的最新研究成果“Cellular senescence gene TACC3 associated with colorectal cancer risk via genetic and DNA methylated alteration”发表在《Arch Toxicol》杂志。

本研究旨在识别结直肠癌中DNA甲基化修饰的细胞衰老基因（DMCSGs）及其易感变异，团队整合了人群研究、测序数据、生物学实验和多个数据库，以探讨遗传变异和DNA甲基化对细胞衰老基因的调控机制，以及衰老基因在结直肠癌进展中的潜在作用。这些发现为细胞衰老基因遗传变异在结直肠癌的发展和进展中的作用提供了见解。

方案设计&流程

1. 人群样本基因分型筛选易感基因

纳入了1150名结直肠癌患者和1342名无癌对照者，利用Illumina Human Omni ZhongHua BeadChip芯片对DMCSGs的遗传变异进行基因分型。‍

2. 临床组织样本全转录组RNA测序分析‍

总共52对结直肠癌组织样本和相邻正常组织进行了RNA抽提质控完成全转录组测序分析。【miRNA测序采用small RNA标准建库试剂盒构建small RNA-seq文库；Total RNA测序采用rRNA去除链特异性标准建库试剂盒构建Total RNA-seq测序文库，两种文库构建测序分析和ceRNA调控网络分析均由Genesky Biotechnologies Inc., Shanghai, China上海天昊生物科技有限公司完成】

3. 候选基因的筛选鉴定‍

CellAge数据库中提取细胞衰老基因（CSGs），并利用TCGA结直肠癌队列对CSGs进行了差异表达分析，采用FDR P value< 0.05 和 |logFC| > 1 作为标准来识别差异表达基因。团队评估了DNA甲基转移酶（DNMT）家族成员DNMT1、DNMT3A和DNMT3B与差异表达基因（DEGs）之间的相关性。确定的DNA甲基化修饰的细胞衰老基因（DMCSGs）进一步分析。RNA测序数据和Gene Expression Omnibus（GEO）（GSE39582）数据集用于验证DMCSGs的表达特征。

4. 候选基因分型和遗传变异的选择

利用Illumina Human Omni ZhongHua BeadChip芯片对DMCSGs的遗传变异进行基因分型。遗传变异的质量控制：(a)位于DMCSGs上下游2kb范围内的变异；(b)次要等位基因频率（MAF）≥0.05；(c)基因分型率≥95%；(d)哈迪-温伯格平衡（HWE）≥0.05。

5. 遗传变异的功能分析

利用RegulomeDB、HaploReg、基因型-组织表达（GTEx）、Pancan-meQTL和CancerSplicingQTL数据库预测潜在的功能变异。GTEx数据库用于表达数量性状位点（eQTL）分析和剪接数量性状位点（sQTLs）分析，而Pancan-MeQTL数据库则用于进行meQTL分析。团队还使用RNAfold工具对遗传变异进行功能注释和可视化。

6. 细胞培养和敲低TACC3功能验证

人结直肠癌细胞系HCT116、SW620、DLD-1和SW480，采用siRNAs及其相应的对照转染细胞。通过RT-qPCR测量敲低效率，并确认目标基因相对于对照组的表达显著减少。

7. 5-氮杂胞苷（5-Aza）处理细胞并检测基因表达

生长良好的结直肠癌细胞被置于六孔板中，细胞培养基中的5-氮杂胞苷浓度分别为2.5、5和10 μM。以含有5 μM DMSO的细胞培养基作为对照组，连续培养72小时后，从细胞中提取RNA，并通过RT-qPCR检测目标基因的表达水平。

8. 双荧光素酶报告基因测定功能表达

为了功能验证，团队在pGL4.23-Basic荧光素酶报告载体上游构建了包含rs4558926位点的多个重复序列和miniCMV。将24孔板中生长至30%汇合度的结直肠细胞转染报告质粒，48小时后，使用双荧光素酶报告系统试剂盒测定萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶的活性水平。

9. β-半乳糖苷酶测定细胞衰老状态

使用β-半乳糖苷酶染色试剂盒评估细胞的衰老状态。

10. 高低TACC3患者间的免疫景观分析和突变图谱

应用ESTIMATE算法推断免疫相关评分，如免疫评分、间质评分和ESTIMATE评分，以及肿瘤纯度。单样本GSEA（ssGSEA）辅助分析了高表达和低表达TACC3组中16种不同的浸润免疫细胞类型和13种免疫功能。

主要内容&结果

1. 鉴定结直肠癌中的七种衰老基因

研究通过筛选和分析确定了七个衰老基因（DMCSGs），包括TACC3，并验证了它们在结直肠癌中的表达模式，发现TACC3与多个癌症相关基因表达显著相关。

图1 DNA甲基化相关细胞衰老基因（DMCSG）的鉴定。

2. 衰老基因DMCSG 基因变异与结直肠癌风险之间的关联

研究鉴定了与结直肠癌风险相关的DMCSGs遗传变异，筛选出27个标签变异，并通过多种模型分析了rs4558926基因型与结直肠癌风险的关系。结果显示CG基因型相比于CC基因型显著增加了患癌风险。

图2 rs4558926对TACC3基因转录、甲基化的影响

3. 功能性 rs4558926 调节基因转录、DNA 甲基化和可变剪接

rs4558926位于TACC3下游1.2 kb处，其G等位基因增加TACC3表达，影响RNA二级结构和剪接，并降低TACC3启动子区域的甲基化水平。

4. 敲低TACC3可抑制结直肠癌细胞的增殖能力和衰老

TACC3在结直肠癌中高表达，特别是在MSI-H患者中。敲低TACC3可减少HCT116和DLD-1细胞增殖和克隆形成能力，并减缓细胞衰老。

图3 TACC3 的下调抑制了结直肠癌细胞的增殖和细胞衰老

5. 不同TACC3表达组之间发现免疫浸润和肿瘤突变负荷存在差异

高TACC3表达与结直肠癌中的免疫抑制环境相关，表现为免疫细胞浸润减少、免疫检查点基因表达变化及较高肿瘤突变负荷。

图4 TACC3高表达患者与低表达患者免疫特征有明显差异

研究意义&总结

该研究通过系统分析，rs4558926 被鉴定为结直肠癌的风险变异。宿主基因 TACC3 的表达受 rs4558926 和相关的 DNA 甲基化水平调控。 此外，团队研究了 rs4558926 与结直肠癌的关系，并揭示了 TACC3 增强结直肠癌细胞的增殖并诱导细胞衰老。生物信息学分析表明，TACC3 高表达的结直肠癌患者表现出较低的免疫浸润、较高的肿瘤突变负荷和较高的 MSI-H 比例。

展望未来，深入探索TACC3调控机制及其作为潜在治疗靶点的可能性将是重要方向。建议后续研究应聚焦于TACC3如何影响免疫应答的具体路径，以及开发针对TACC3的治疗策略，以期改善结肠癌患者的治疗效果和预后。

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