结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，遗传因素在其发生发展中发挥重要作用。通过最近的全基因组关联研究（GWAS），已发现大约150种常见的单核苷酸多态性（SNP）与结直肠癌的风险相关。事实上，大约90%的遗传变异位于非编码区或基因间区，包括3’非翻译区（3’UTR），5’非翻译区（5’UTR），内含子和非编码RNAs。然而，非编码变异区域中的易感基因和调节表观遗传信号转导的明确证据仍有待确定。以往研究表明，异常的miRNA表达有助于癌症的发展并调节对结直肠癌治疗的敏感性，包括miR-21-5p和miR-140-3p。其中，基因的3’非翻译区（3'UTRs）富含miRNA的结合位点及N6-腺苷酸甲基化（m6A）修饰位点。该区域遗传变异是否改变miRNA的靶向结合和m6A动态修饰水平，进而影响结直肠癌的发病风险尚不清楚。此外，成熟多聚腺苷酸化mRNA的3'UTR含有N6-甲基腺苷（m6A），它调节mRNA转录组转换，表明3'UTR中的变体可能会获得或失去与癌症相关的m6A位点。最近的一项研究报告称，PIK3CB中的错位变异通过抑制PIK3CB m6A 水平从而显著增加了PIK3CB mRNA的蛋白质表达水平。然而，m6A相关变异与结直肠癌之间的关联及其生物学效应仍然未知。
针对以上问题，南京医科大学王美林教授团队在《Cancer Research》（IF=12.5）上发表题为“Genetic Modulation of BET1L Confers Colorectal Cancer Susceptibility by Reducing miRNA Binding and m6 A Modification”的研究论文，本研究揭示了BET1L基因3’UTR遗传变异通过影响miR-140-3p与BET1L的结合及m6A修饰水平，参与结直肠癌易感的分子机制。
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本研究中团队通过多组学手段方法整合全转录组数据、遗传变异结果联合分析以及系统严谨功能实验验证发现miR-140-3p/BET1L轴导致结直肠癌机制，为结直肠癌临床和患者精准治疗提供科学参考和依据。1、队列样本和临床资料
南京（855名患者和1201名无癌对照）、北京（983名患者和935名无癌对照）和杭州（1046名患者和1184名无癌对照）的三个独立研究中心的汉族人群中招募了组织病理学诊断为结直肠癌的患者。在发现阶段，从招募结直肠癌患者同一时期同一地区的社区非感染性疾病体格检查中选择无癌对照。
52对肿瘤组织和邻近非肿瘤组织（NATs）进行了RNA测序（RNA-seq）分析，24对肿瘤组织和邻近非肿瘤组织进行了miRNA测序分析。在这些样本中，25对肿瘤组织和邻近非肿瘤组织用于进行基于串联质谱标签（TMT）的全局蛋白质组学分析。【miRNA测序采用small RNA标准建库试剂盒构建small RNA-seq文库；Total RNA测序采用rRNA去除链特异性标准建库试剂盒构建Total RNA-seq测序文库；全转录组测序联合分析由Genesky Biotechnologies Inc., Shanghai, China上海天昊生物科技有限公司完成】。内部测序数据与GEO数据库12个微阵列数据集以及其他17个微阵列数据库共同进行后续分析。miRNA在肿瘤与正常样本之间绝对倍数变化差值（FC）>1.50，P值<0.05且call rate>0.8，则被认为是每个数据集中的DEMs。此外，在至少四个GEO数据库中改变方向一致的DEMs被视为GEO数据库中的候选miRNA。最终，所有候选DEMs的交集被选作进一步分析的对象。使用Illumina Human Omni ZhongHua Bead Chips进行了基因分型。
使用类似ELISA的比色法和斑点印迹实验测定整体mRNA中m6A水平的变化。使用甲基化RNA免疫沉淀MeRIP - qPCR检测每个样本中m6A的富集程度，并将m6A富集度归一化到输入样品的富集度。同时进行系列的体内外功能实验验证。
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图1 用于识别与结直肠癌风险相关的miRNA和遗传变异的工作流程示意图
使用miRNA-seq、TCGA、GEO和其他阵列数据库的组合整合分析miRNA表达谱。首先，与NAT相比，在24个结直肠癌组织中鉴定出199个DEM。其次，发现241个miRNA在从TCGA数据库获得的结直肠癌组织中差异表达。在重叠四个数据库中显着异常表达的miRNA后，团队确定了 13个与结直肠癌相关的DEM，这些DEM被选中进行下一步分析。用于确认受miRNA影响的易感基因和变异的策略流程图如图1D所示，团队应用了四种可用的算法来获得候选miRNA的72868个潜在结合区，在执行SNP选择标准后，确定了279个变异，并在加性遗传模型的发现阶段评估了它们与结直肠癌易感性的关联。![]()
图2 rs11245997的A等位基因降低miR-140-3p与BET1L 3’UTR的结合，并减少m6A位点修饰的富集
团队基于eQTL分析研究了组织样本中rs11245997基因型是否改变了BET1L mRNA的表达。显性遗传模型结果显示rs11245997基因型与BET1L表达之间存在很强的相关性，并且miR-140-3p在不同rs11245997基因型的患者中表达相似。通过注释位于BET1L 3’UTR中的rs11245997变体的功能变化，预测rs11245997变体的G>A变化会破坏miR-140-3p结合亲和力。此外，在含有rs11245997 A等位基因的结直肠组织中，m6A RNA水平显著降低。这些结果表明，rs11245997可能破坏BET1L 3’UTR中miR-140-3p的结合效率，导致METTL14和WTAP（m6A甲基转移酶）与miR-140-3p竞争结合并随后上调BET1L的表达水平。![]()
图3 BET1L在结直肠癌组织中上调
团队发现，BET1L在组织中广泛表达。与NAT相比，BET1L在结直肠肿瘤中的mRNA和蛋白质水平表达均显著增加。晚期病理分期（III 期和 IV 期）和Dukes分期（C期和D期）的患者可能表现出更高的BET1L mRNA表达。团队还发现BET1L高组患者总生存率降低。发现BET1L表达作为总生存期的预测因子表现出良好的效果。然后，团队定义了来自GSE132465的scRNA-seq数据的细胞子集，并将所有细胞分为九个主要分区和两种组织类型。在结直肠癌组织的上皮细胞中也观察到更高水平的BET1L表达。团队观察到结直肠肿瘤中miR-140-3p表达下调，并且观察到BET1L和miR-140-3p表达之间存在显著的负相关。与组织中的表达模式一致，BET1L的mRNA和蛋白表达在结直肠癌细胞中被miR-140-3p模拟物降低，并被miR-140-3p抑制剂诱导。![]()
图4 BET1L敲除抑制结直肠癌细胞增殖和肿瘤发生
团队建立了稳定表达BET1L的结肠癌细胞，转染/不转染miR-140-3p模拟物，以评估miR-140-3p/BET1L轴的效果。BET1L的过表达促进了细胞增殖、侵袭和迁移和细胞凋亡。miR-140-3p至少部分挽救了低表达BET1L的结肠癌细胞的增殖和转移。相反，使用CRISPR/Cas9编辑系统生成的BET1L敲除HCT116细胞显示细胞增殖、侵袭和迁移显著降低。此外，在小鼠模型中，团队观察到移植的BET1L敲除细胞的异种移植小鼠的肿瘤体积较小，肿瘤重量较低。在缺乏BET1L表达的结直肠肿瘤异种移植物中，Ki67染色显着降低。团队还使用ApcMin/þ小鼠作为原位小鼠模型来评估BET1L敲除对小鼠结直肠组织的影响。通过ApcMin/þ小鼠的尾静脉注射结肠癌细胞后，MRI分析显示粘膜结肠表面增厚且呈颗粒状。然而，团队没有检测到BET1L/-1和BET1L/-2组小鼠结肠组织的显着改变，表明BET1L敲除对结直肠组织有肿瘤抑制作用。
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图5 BET1L通过调节HSD17B7、CYP27B1和COMT与类固醇生物合成相关
团队分析了BET1L敲除细胞中的转录组数据，以描绘由BET1L引起的生物途径改变，并鉴定了1826个失调基因，这些途径在整个Reactome、KEGG、GO和/或其他途径数据库中富集了各种代谢途径。发现类固醇生物合成途径是最丰富的生物过程，有12个核心富集基因。团队还使用来自内部数据库和TCGA数据库的转录组来全面验证结直肠肿瘤和正常组织之间这12个基因表达的差异，只有4个基因（HSD17B7、CYP27B1、COMMT和SQLE）在这些数据集中一致地差异表达。在评估了这4个基因的表达与BET1L之间的相关性后，团队排除了SQLE，因为它与BET1L呈负相关。使用RT-PCR、Western blotting和CCLE数据库，团队证实BET1L的内源水平与结直肠癌细胞系中的HSD17B7、CYP27B1和COMT呈正相关。此外，类固醇生物合成途径中的这三个关键基因在BET1L敲除细胞中以低水平表达，在BET1L过表达后在细胞中以高水平表达。基于这些发现，BET1L敲除通过抑制HSD17B7、CYP27B1和COMT的表达改变了类固醇生物合成途径的调节。在本研究中，团队通过多组学手段方法整合全转录组数据、遗传变异结果联合分析以及系统严谨功能实验验证，确定了基因BET1L中的遗传变异rs11245997与亚洲血统个体的结直肠癌易感性之间存在显着关联，BET1L表达并与结直肠癌患者的不良预后有关。miR-140-3p/BET1L轴具体生物学机制为： BET1L 3’UTR遗传变异位点rs11245997 G>A降低了miR-140-3p结合效率、亲和力，导致METTL14和WTAP（m6A甲基转移酶）与miR-140-3p竞争结合并减少了m6A位点修饰的富集导致BET1L的表达水平上调。
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通过转录组数据比对Reactome、KEGG、GO和/或其他途径数据库，发现12个核心富集基因主要为类固醇生物合成途径，通过二次内部数据库和TCGA数据库的全面验证3个核心基因HSD17B7、CYP27B1和COMT的表达改变了类固醇生物合成途径诱导肠癌肿瘤发生。
展望未来，深入探索miR-140-3p/BET1L轴调控机制及其作为潜在治疗靶点的可能性将是重要方向。建议后续研究应聚焦于BET1L如何影响免疫应答的具体路径，以及开发针对BET1L的治疗策略，以期改善结肠癌患者的治疗效果和预后，为结直肠癌临床和患者精准治疗提供更多科学参考和依据。
王美林，男，江苏南通人，南京医科大学教授、博士生导师。教育部国家重大人才工程特聘教授，国家优秀青年科学基金获得者，主要从事环境暴露致复杂疾病的人群及机制研究。曾在美国Wake Forest大学和Duke大学从事博士后和访问学者工作。近年来研究成果先后发表在《Nat Commun》、《Cell Rep Med》、《Genome Med》、《Nucleic Acids Res》、《Environ Int》和《Environ Sci Technol》等期刊上。获国家自然科学基金优青项目1项，主持国家自然科学基金面上4项、青年基金项目1项，江苏省杰青项目1项，作为主要成员参与国家重点研发计划2项、国家自然科学基金重点项目2项。获教育部高校自然科学二等奖、中华医学科技奖二等奖、江苏省科学技术奖一等奖、教育部霍英东青年教师奖等奖励。Driving innovation for better life
