气候变化导致了不对称的季节变暖，特别是在高海拔地区，冬季温度比夏季升高的幅度更大。青藏高原作为一个典型的例子，经历了显著的冬季增温，超过了夏季温度的增加。该地区土壤有机碳储量约为30~40Gt，占全球土壤有机碳储量的2 %~3 %。土壤增温实验和全球数据的证据表明，增温条件下土壤有机碳分解速率增加。土壤微生物活动在陆地碳循环中起着至关重要的作用，因为土壤微生物通过其代谢活动驱动全球元素循环。然而，大多数研究都集中在对称的全年增温，而不对称的冬季增温对土壤微生物活性的具体影响尚不清楚。
针对以上问题，2024年10月14日，南京农业大学沈其荣院士、凌宁教授团队在《PNAS》（IF=9.6）上发表题为“Asymmetric winter warming reduces microbial carbon use efficiency and growth more than symmetric year-round warming in alpine soils”的研究论文，本研究发现了无论是全年对称变暖还是不对称冬季变暖，都会减少微生物的生长速率和碳使用效率，但是不对称冬季变暖的影响更为显著。
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1. 实验地点与土壤采样
实验始于2011年，在青海省海北国家高寒草地生态系统野外研究站进行，该地海拔3200米，具有大陆性季风气候特征，年均温为-1.7℃，年降水量为485毫米。土壤类型为黏质壤土的马特-灰化土。
实验设计包括三种温度处理：自然环境、对称全年增温（比自然环境高出2℃）、非对称冬季增温（非生长季节比自然环境高出2.5至2.8℃，而生长季节则高出0.5至0.8℃）。非生长季节开始于7天平均气温连续5天低于0℃，生长季节开始于气温连续5天高于0℃。使用随机区组设计建立实验地块，每个地块大小为2.2×1.8米，其中自然环境对照和对称全年增温处理各有六个重复地块，而非对称冬季增温处理有五个重复地块。每个增温地块都安装了两个中波加热器，而自然环境对照地块则装有两个不工作的加热器。在生长季节结束时（2020年8月）从每个地块采集土壤样本（深度0至10厘米），每块地采集三个样本并混合。样品被迅速运往实验室，并通过2毫米筛子筛选。土壤微宇宙实验设计包括使用18O标记水和常规（未标记）水进行培养。总共收集了51个土壤样品，其中包括0小时时点的17个土壤样品（6个自然环境，6个对称全年增温，5个非对称冬季增温）和48小时培养后的34个土壤样品（6个自然环境，6个对称全年增温，5个非对称冬季增温，两种水添加类型各一组）。本研究使用荧光定量qPCR 和16S相对测序结合分析绝对定量微生物组成/群落/结构/丰度。qPCR 用于定量所有土壤DNA样本中的细菌16S rRNA基因拷贝数。通过使用通用细菌引物515F（5′-GTG CCA GCM GCC GCG G-3′）和907R（5′-CCG TCA ATT CMT TTR AGT TT-3′）进行PCR扩增的16S rRNA基因片段的10倍系列稀释来构建绝对定量的标准曲线。使用与qPCR相同的引物（515F/907R），选取DNA进行16S rRNA高通量测序分析。测序使用Illumina MiSeq平台（双端测序，每次读取长度为250 bp）【16S rRNA扩增子相对定量测序和环境因子、菌群群落结果相关性分析由Genesky Biotechnologies Inc., Shanghai, China上海天昊生物科技有限公司完成】。数据使用USEARCH软件进行分析。16S rRNA基因序列使用RDP classifier（V18）以0.8的阈值进行分类注释。使用之前描述的方法估算了每个zOTU的EAF-18O富集情况。简要流程如下：根据每个分级中每个zOTU的相对丰度，对其16S序列在CsCl缓冲液中的浮力密度进行加权计算。然后，分别计算每个zOTU在未标记和标记样本中的DNA分子量，以估算由于同位素掺入导致的浮力密度变化。所有计算中，使用Bootstrap重抽样方法（999次迭代）生成每个分类单元EAF值的95%置信区间（CI）。如果某个zOTU的EAF值下限95%置信区间大于0，则认为该zOTU发生了同位素掺入，即为正在生长的微生物。通过应用指数增长模型确定了每个重复样本的每个分类单元的平均毛增长率（gi，单位：天^-1）。平均毛增长率用于估算每个zOTU每天每克干土中新产生的16S rRNA基因拷贝数（Ni，绝对增长率，单位：16S rRNA基因拷贝数·克^-1土壤·天^-1）。通过汇总被识别为正在生长的每个细菌分类单元内的zOTU特定增长率，计算出正在生长的细菌分类单元的累积绝对种群增长率（EAF-18O的95%CI > 0）。与环境条件相比，冬季不对称增温显著增加了117%的微生物呼吸速率。相比之下，对称的全年变暖对这一速率没有实质性的影响。长期增温降低了微生物生长速率和CUE。不对称的冬季增温对这些参数的影响比对称的全年增温更明显。其中，相对于环境条件，全年对称增温使微生物生长速率降低了31%，使微生物CUE降低了22%。此外，与全年对称增温相比，冬季不对称增温进一步降低了27%的微生物生长速率，并降低了59%的微生物CUE。与环境条件相比，全年对称增温使微生物生物量碳（MBC）降低了17%，而冬季不对称增温对MBC没有显著影响。非对称性冬季增温土壤MBC周转时间约为198天，显著长于对照土壤的108天。相反，对称的常年增温土壤中MBC的周转时间与环境土壤相似。
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图1 微生物代谢对增温的响应
为了评估微生物对C、N和P的限制，团队根据相对比例的酶活性计算了向量长度和角度。长期增温增加了微生物C限制值（向量长度较长），与环境条件相比，全年对称增温增加了1.8%的限制值，冬季非对称增温增加了4.1%。所有数据点的向量夹角均在45°以上，表明微生物群落中存在较强的P限制。冬季不对称增温导致土壤微生物P限制比全年对称增温增加7.2%。
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图2响应增温的微生物资源获取策略
基于qSIP结果，团队将有效地将18O掺入DNA[18O过剩原子分数（EAF-18O）的95% CI > 0]中的零半径操作分类单元（Operational Taxonomic Units，zOTUs）鉴定为生长细菌物种（即处于繁殖状态的物种）。值得注意的是，这种方法可能无法准确地检测出生长缓慢的细菌，因为这些分类单元可能具有95% CIs重叠为零。增温处理导致生长细菌种类的比例和数量均下降，其中不对称冬季增温导致的减少比对称全年增温更显著。在环境样品中，在3172个zOTUs中，有2821个（89%）被鉴定为生长物种。在全年对称增温条件下，共发现3233个zOTUs，其中796个（25%）为生长型物种。在冬季不对称增温条件下，共鉴定出3151个zOTUs，其中508个（16%）为生长型物种。除拟杆菌门（Bacteroidetes）外，所有（亚）门在升温过程中生长细菌种类的比例和数量均表现出一致的下降趋势。在冬季不对称增温期间，拟杆菌门（Bacteroidetes）所代表的生长细菌物种的比例和数量均高于环境和全年对称增温处理。
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图3环境（A）、全年增温（B）和冬季增温（C）土壤中EAF-18O的类群特异性变化
团队通过对识别为生长的zOTUs的增长率求和来计算累积绝对人口增长率。值得注意的是，这种方式可能会排除生长缓慢的zOTUs，但更准确地得到参与C利用的活跃生长的zOTUs。与环境条件相比，增温处理导致细菌群落的累积生长率降低。与环境条件相比，全年对称增温使人口绝对增长率（对数转换）下降10%，冬季非对称增温使人口绝对增长率下降12%。除拟杆菌门（Bacteroidetes）外，所有（亚）门的累积增长率在增温后均有所下降。对生长类群进行系统发育信号测试，以评估环境条件、对称全年升温和不对称冬季升温处理下细菌生长速率的系统发育保守性水平。Pagel’s λ和Blomberg’s K指标均表明所有处理（P < 0 . 05）均具有显著的系统发育信号。Pagel’s λ值从环境条件下的0.997下降到冬季不对称增温下的0.648，表明系统发育保守性降低。
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图4生长细菌类群的绝对生长速率与系统发育的关系
为了确定细菌生长的密度依赖性，团队进行了人均生长率与初始种群密度的相关性分析，这些初始种群密度来自于zOTUs的未分级DNA样本。这揭示了生态过程在塑造微生物群落中的作用。随着种群密度的增加，资源竞争加剧，潜在地限制了种群的增长，影响了微生物群落的生态过程。团队在细菌分类群中观察到，随着种群规模的增长，人均种群增长率下降，这表明负密度依赖是种群生态学中的普遍现象。全年对称增温（斜率为0.005）和冬季不对称增温土壤（斜率=0.006）的人均收入增长率与初始人口密度的关系明显陡于环境土壤（斜率=0.004 ;斜率差: P < 0.05）。这表明在较温暖的条件下，生长中的物种面临更大的资源限制。
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图5生长细菌的平均生长率和种群密度的关系
本研究使用微生物绝对定量技术发现对称的全年增温和不对称的冬季增温都导致了高寒草地土壤微生物的C限制，降低了微生物生长速率和CUE。不对称的冬季增温比对称的全年增温在减少生长细菌的数量和比例、降低大多数主要细菌类群的生长速率以及加剧对微生物生长的负密度依赖方面具有更明显的效果。![]()
总之，通过此研究了解了不同增温条件如何影响微生物群落中的系统发育信号，并识别影响微生物CUE的特定种群，这将为增强对未来草原土壤生态系统对全球变暖响应预测提供科学根据和参考。
凌宁，湖南株洲人，教授、博士生导师。主要从事土壤微生物与土壤健康相关研究，重点关注土壤微生物在肥料-土壤-植物系统中的行为特征与影响机制、以及根系分泌物介导的植物-微生物过程与机制等方面，研究成果以第一作者或通讯作者在《Nature Communications》，《New Phytologist》，《Molecular Ecology》, 《mSystems》, 《Environ Microbiol》, 《Soil Biol Biochem》等主流刊物上发表文章90余篇，他引3500余次，现H指数为33。2021年入选“2020全球前2%顶尖科学家”榜单（World's Top 2% Scientists 2020）。
沈其荣，中国工程院院士，国家教学名师，现任南京农业大学学术委员会主任和国家有机（类）肥料产业技术创新战略联盟理事长，曾任国家973计划首席科学家、国家863 计划现代农业领域主题专家、国务院学位会农业资源与环境学科评议组召集人、国家自然科学基金委生命学部专家咨询委员、农业部耕地质量建设与管理专家组组长等职务。长期从事有机（类）肥料和土壤微生物研究与推广工作，技术工艺被全国666家企业采用，为中国有机（类）肥料产业发展做出了突出贡献；以施用全元生物有机肥为核心技术的防控土传病害综合技术体系效果显著，为经济作物产业可持续发展提供了技术支撑。以第一完成人获国家技术发明二等奖（2011）、国家科技进步二等奖（2015）、国家教学成果二等奖（2009）、省部一等奖6项；第一完成人获国内外发明专利授权78件，其中51件在企业转化，获得专利直接转让经费3800万元，1件获中国专利金奖，2件获中国专利优秀奖。先后主持国家973计划项目、国家自然科学基金重大和重点项目、公益性农业行业专项等全国性重大与重点项目8项，在Nat Biotechnol,Nat Commun, Sci Adv, ISME J, Microbiome, Plant Cell Environ, EnvironSci Technol, Soil Biol Biochem 等国际学术权威刊物上发表大量论文，2014年以来入选爱思维尔中国高被引学者，2019 以来年入选科睿唯安全球高被引科学家，截止2022年10月20日，Web of Science统计H指数95。先后获得光华工程科技奖、全国创新争先奖、中华农业英才奖、做出突出贡献的中国博士学位获得者等荣誉称号。
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