新陈代谢是生命活动的基本特征，包括物质代谢和能量代谢。物质代谢主要是由糖、脂肪、蛋白质经过生物化学作用和反应形成可被消化吸收的分子（葡萄糖、脂肪酸和甘油、氨基酸）后再构成细胞器、细胞、组织、器官物质的过程。能量代谢是葡萄糖、脂肪酸等营养物质的无氧酵解和有氧呼吸中产生能量（ATP）以及小分子代谢物过程。营养物质经过氧化分解伴随能量释放形成个体需要的热能和化学能“能量货币”ATP，ATP经过能量转换为渗透能、机械能、电能、化学能和光能为细胞主动运输、神经传导、肌肉收缩、鞭毛运动提供能量，进而被利用而执行生命活动。因此，能量代谢是维持生命活动的关键过程，更多的文献研究报道能量代谢过程与不孕不育、肿瘤疾病、代谢性疾病、心血管疾病、免疫疾病、神经疾病等密切相关，深入了解能量代谢过程有助于团队了解疾病的发病和更全面地理解生命的奥秘。
ATP作为活细胞内一种特殊的主要能量载体，在细胞核、线粒体、叶绿体以及细胞质基质中广泛存在着，并不断与ADP相互转化而形成ATP系统。相关的文献表明，心肌细胞、骨骼肌细胞和精子中细胞内能量生成高度依赖于ATP的转移和酶穿梭系统。ATP酶穿梭系统，包括腺苷酸激酶（AKs）和肌酸激酶（CKs），被认为能促进ATP从线粒体向细胞其他部分的转移以及将ADP带回线粒体。目前，在脊椎动物中已识别出九种AK（AK1至AK9），它们在细胞定位和底物特异性方面各不相同。这些定位差异提示，通过催化腺苷核苷酸间的双向转磷酸化反应，这些酶可能有助于在不同细胞环境中实现ATP的转移。哺乳动物精子中的ATP主要通过线粒体（MS）的氧化磷酸化和鞭毛纤维鞘（FS）糖酵解在鞭毛中产生。ATP通过供给鞭毛内的细胞骨架结构能量驱动鞭毛保持连续摆动和高速移动。实际临床医生常规精液分析观察到，很多不孕不育患者以及少精或弱精患者的精子无法移动或者移动速率很低。过去半个世纪以来，提出了多种假说来解释哺乳动物精子中ATP转移的机制，包括ATP扩散、酶介导的穿梭和糖酵解。然而，在哺乳动物中，调控鞭毛内ATP转运的分子机制仍不明确。
针对以上科学和临床问题，2024年5月16日，安徽医科大学第一附属医院/国家卫健委配子与生殖道发育异常研究重点实验室曹云霞/吴欢/花荣团队联合上海交通大学医学院附属第一人民医院贺小进/南京医科大学生殖医学与子代健康全国重点实验室刘明兮/张金涛在《SCIENCE CHINA Life Science》（IF = 9.4）杂志发表了题为“Adenylate kinase phosphate energy shuttle underlies energetic communication in flagellar axonemes” 的研究论文。该研究揭示了睾丸优势表达的腺苷酸激酶家族亚组Ⅲ的AK8和AK9调控精子鞭毛的能量转运和运动的功能及机制，为深入理解哺乳动物精子能量代谢、探索男性不育的潜在治疗方法提供了新的视角。
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1.临床样本收集与分析：研究团队从安徽医科大学第一附属医院的原发性不育患者中收集了精子样本，这些患者符合世界卫生组织（WHO）2015年定义的少精或弱精标准。收集样本遵循了伦理审批流程，并获得了患者的书面同意。
2.全外显子组测序分析：为了寻找与不育相关的遗传变异，对130名具有异常精子活力的患者的外显子组进行测序以及分析。采用【Genesky Biotechnologies Inc, Shanghai 上海天昊生物科技有限公司】SureSelectXT Human All Exon Kit 60M富集外显子区域，随后在HiSeq X-TEN平台上进行测序、数据分析包括序列比对、变异调用和注释，并应用严格的标准排除常见变异。
3.形态学分析：对至少200个精子样本进行苏木精-伊红（H&E）染色，依据WHO指南评估形态异常比例。此外，还进行了透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）检查，以观察精子的超微结构。
4.功能分析：利用JC-1染料检测线粒体膜电位（MMP），通过流式细胞术区分高MMP（橙红色荧光）和低MMP（绿色荧光）的精子，以此分析能量状态。
5.动物模型建立：通过CRISPR-Cas9技术建立了AK8/9敲除小鼠模型，并进行了基因型鉴定，以研究这些基因在体内的功能。
为探究这种ATP转移在多种组织和器官中的调节机制，团队研究了CK和AK家族成员的表达模式。对小鼠主要器官的全面转录组学和蛋白质组学分析揭示了这两类酶在不同组织中表达的多样性（图1A和B）。具体来说，根据它们在特定组织中的表达特征，团队鉴定了四个酶亚群。亚群I主要在神经组织中发现，亚群II则分布于多种与消化相关的组织、棕色脂肪组织、颈淋巴结及肾脏中。亚群III，包括AK7、AK8和AK9，特异性地在雄性生殖系统中高度表达；而亚群IV在骨骼肌、心脏、舌和食道中表达水平较高（图1B）。CK家族蛋白在睾丸中的表达显著较低（图1A和B）。AK和CK家族在进化上都是保守的（图1C）。另外，尽管所有AK蛋白都保留有腺苷酸激酶结构域，小鼠的AK5及AK7至AK9蛋白较大，分子质量更高，并且比其他物种中相对应的蛋白含有更多腺苷酸激酶结构域（图1D）。通过qPCR对多个组织的检测，团队观察到亚群III的AKs在睾丸中高度表达（图1E）。
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图1 腺苷酸激酶亚群的表达和进化特征
为了探讨AKs在雄性生殖系统中的功能，团队使用抑制剂Ap5A和DNFB分别抑制培养精子细胞中AKs和CKs的活性。AK抑制剂显著降低了精子的总体运动能力和前向运动能力（图1F和G），CK抑制剂对精子没有显著影响（图1H和I）。这些结果表明，AKs特别是睾丸中富集的亚群III，对于哺乳动物生殖系统中精子的运动至关重要。
2. 识别AK亚群III缺陷作为人类弱精子症的潜在致病因素
为了探究AK和CK变异与精子运动性之间的遗传关联，对患有弱精子症（AZS）的患者进行了全外显子测序分析（Genesky BioTech上海天昊生物）。结果显示，在120例患者中，筛查到三人携带有AK变异，这三位患者的父母均有近亲关系。第一位患者（AK8M1R，36岁）中发现一个起始丢失变异c.2T>G:p.M1R，可能阻碍了翻译的起始（图2A，表1）。第二位患者（AK9E784fs，23岁）携带AK9基因的纯合移码缺失变异（c.2350_2362del），可能导致新生AK9肽链翻译终止（p.E784fs）。第三位患者（AK9K1352X，30岁）有一个产生终止密码子的变异c.3973A>T:p.K1325X，导致翻译提前终止（图2B，表1）。通过Sanger测序确认了所有患者及其直系家庭成员的变异（图2A和B）。这些变异均属罕见（表1），但在该队列中未发现其他AK或CK的变异。为了评估这些潜在失活变异在AK中的致病性，利用特异性抗体检测了突变精子中的蛋白表达和定位，结果显示，AK8M1R样本中AK8的水平显著降低（图2C），而AK9E784fs精子中AK9完全缺失，未发现截短形式（图2D）。免疫荧光（IF）结果显示，对照组精子的鞭毛各区域均有AK9表达，而在突变样本中则完全缺失（图2E）。![]()
图2 在患有AZS的个体中发现的AK8和AK9的双等位基因变异
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常规精液分析显示，两个AK9缺陷的精子样本表现出低运动性症状，正常前向运动精子仅占0.5%和12.5%，总运动率分别为2%和27%，符合AZS的表现（图2F）。AK9缺陷的精子能够正常受精，两位AK9缺陷的患者接受了ICSI治疗并成功生育，婴儿出生正常（表1）。AK8M1R精子的运动性和前向运动性分别为1和0（图2F）。此外，AK8M1R精子中畸形精子比例高，部分精子中段细部较薄（图2G）。通过透射电子显微镜（TEM）检查了AK8和AK9缺陷精子的轴丝，中段横切面显示线粒体鞘（MS）外层及轴丝中的外密纤维（ODF）存在，主段中纤维鞘（FS）、ODF和轴丝可以清晰区分，各组间无明显差异（图2H）。这些发现表明，AK8和AK9的变异可能是导致AZS的潜在原因。3. AK8对雄性小鼠的精子运动性和生育能力至关重要
为了确定Ak8的时间表达模式，使用RT-PCR评估了产后睾丸中第一波精子发生期间的Ak8 mRNA水平，首次检测到Ak8 mRNA是在第3周，与精子发生的开始相吻合，随后采用CRISPR/Cas9技术构建了Ak8敲除小鼠（Ak8-/-），在这些小鼠的睾丸中未检测到AK8（图3A）。Ak8-/-小鼠在长达10个月的时间表现健康，但雄性完全不育（图3B）。小鼠睾丸组织学分析发现Ak8-/-睾丸中精子释放延迟，导致附睾尾部精子浓度减少（图3C）。通过计算机辅助精子分析（CASA）测定Ak8-/-雄性的精子质量，结果显示Ak8-/-精子完全不动或者鞭毛运动受损，与患者AK8M1R的精子类似（图3D和E）。还发现Ak8-/-精子中的ATP水平显著降低（图3F）。![]()
图3 K8缺乏会导致小鼠精子运动能力受损
与患者I相似，少数精子在中段和主段之间显示出狭窄（图3G和H）。连接中段和主段的结构称为环状带。对精子超微结构和SEPT6水平的检查表明，这一区域的狭窄可能并非由环状带缺陷引起（图3I和J），而是发现一些Ak8-/-精子部分丧失了线粒体鞘，可能是造成这种情况的原因（图3J）。Ak8-/-精子中的几种结构蛋白，如辐射轮（RS）、连接蛋白-动力蛋白调节复合物（N-DRC）和内动力臂（IDA），观察结果均正常（图3K-P）。在附睾中，Ak8-/-精子显示出运动性和ATP产生的双重降低。此外，由于线粒体鞘缺陷，少数精子在中段出现狭窄。这些发现表明，AK8的缺失导致睾丸中精子细胞的释放延迟。4.小鼠中AK9的缺失损害了精子的ATP代谢，导致雄性不育
与Ak8相似，Ak9也在精子发生过程中被检测到，随后在小鼠中被敲除（Ak9-/-）。蛋白质印迹（WB）证实Ak9在Ak9-/-小鼠的睾丸和精子中完全不存在（图4A）。在Ak9-/-小鼠附睾的精子鞭毛中也未观察到AK9（图4B和C）。
为了测试雄性生育能力，Ak9-/-和Ak9+/+雄性与野生型雌性交配两个月。根据每窝后代数量评估，Ak9-/-雄性完全不育（图4D）。之前有研究报道雄性不育可能是由于精子发生缺陷导致的受精能力下降，因此，为了确定不育是否由精子发生受损引起，对Ak9-/-雄性的该过程进行了评估。纯合子和对照同窝仔之间睾丸的宏观外观或重量没有差异，用H&E染色进行组织学分析也没有观察到差异，并且附睾切片显示附睾尾部和头部区域的管道充满精子（图4E）。因此，Ak9-/-动物的精子形态看似正常（图4G），研究结果表明Ak9-/-小鼠没有明显的精子发生缺陷。![]()
图4 AK9对小鼠精子活力和ATP的产生至关重要
接下来，CASA显示Ak9-/-缺陷精子的总运动性和前向运动性显著降低（图4H和I）。这些发现与先证者的实验结果一致。鉴于AK9在调节腺苷酸稳态方面的潜在功能，测量了Ak9-/-和Ak9+/+精子的ATP水平，结果显示Ak9-/-精子中ATP生成显著降低（图4J）。Ak9-/-精子中的结构蛋白RS、N-DRC和IDA被观察为正常（图4K-R）。总的来说，这些观察表明Ak9-/-动物的精子运动性减弱，且没有显著的形态缺陷，提示ATP代谢失调可能与精子运动性降低有关。
为了进一步探索AK8在精子鞭毛中的功能，利用特异性抗AK8抗体鉴定与AK8相互作用的蛋白质。质谱分析鉴定到RSPH3B作为AK8的相互作用，并通过WB验证了这一结果（图5A）。由于RSPH3B是一种已知的辐轮结构（RS）蛋白，这表明AK8可能与RS相关联（图5B）。
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图5 AK8和AK9作为轴丝的组成部分
与AK8类似，AK9也是一种轴丝相关的蛋白（图5B）。此外，位于纤毛鞘（FS）中的GAPDS蛋白被观察到围绕AK9，从而证实了AK9在轴丝中的位置（图5F）。使用抗AK9抗体检测睾丸中与AK9相互作用的蛋白，质谱鉴定出的各种AK9相互作用蛋白包括RS成分RSPH9，表明AK9与RS相关联（图5G）。AK9完全与RS蛋白LRRC23共定位（图5H）。另外，通过免疫荧光(IF)和WB显示，Lrrc23−/−小鼠的精子中AK9完全缺失（图5D、E、I和J）。人类LRRC23缺陷的精子中也观察到类似的缺失（图5K）。此外，AK9的缺失不影响LRRC23或AK8的存在（图5L和M）。透射电子显微镜(TEM)显示，Ak8-/-和Ak9-/-的鞭毛长度与野生型相似，并可见RS（图5N）。这表明AK8和AK9对于RS的结构支撑没有显著贡献（图5O）。
6. AK8/9参与将ATP输送到鞭毛中能量消耗部位的过程
AK8和AK9如何促进鞭毛内ATP运输的具体机制仍不清楚。为了探究此问题，本研究使用小分子探针追踪了人和小鼠精子中的ATP，发现在Ak8-/-鞭毛的主要片段中ATP水平显著降低（图6A-C），且ATP在MS中积聚（图6B），表明AK8可能调节从MS到鞭毛更远端区域的ATP转移。
在Ak9-/-小鼠的鞭毛主要片段中也观察到ATP含量减少（图6D和E），尽管Ak9-/-与野生型小鼠在中段的ATP含量上无明显差异（图6E）。有趣的是，Ak9-/-鞭毛主要片段中的ATP分布显著高于Ak9+/+鞭毛（图6F）。鉴于AK9位于RS3，团队对Lrrc23-/-和Iqub-/-小鼠精子鞭毛的ATP分布进行了检查，与Ak9-/-鞭毛的结果一致，Lrrc23-/-鞭毛的主要区段中ATP信号强度显著降低，宽度显著增加（图6G-I）。这一结果表明，AK9可能沿着鞭毛的纵向轴聚集ATP。![]()
图6 AK8/9在调节轴突中ATP转移中的作用
对AK9缺陷的人类精子进行了类似检测，得到了相似的结果（图6J和K）。为了排除这些变化可能源自鞭毛侧向结构改变的可能性，评估了GAPDS（纤毛鞘标记物）和AC-TUBULIN（轴丝标记物）的水平。在这两个结构中，未观察到AK9缺陷和正常对照（NC）精子之间有实质性的结构差异（图6L和M）。因此，AK8和AK9似乎都能调节鞭毛内ATP的分布，其中AK8有助于将ATP从MS输送到主片段，而AK9则有助于沿轴丝纵向轴积累ATP。已有研究表明AK8通过与鞭毛中的CFAP45协同作用维持轴丝中的核苷酸稳态。相比之下，目前没有证据表明AK9参与鞭毛中核苷酸稳态的维持。为了进一步研究AK9的功能，通过质谱法分析了精子的胞内代谢组（图7A）。在Ak9+/+和Ak9-/-组之间发现代谢物有显著差异，表明AK9敲除后发生了显著的代谢变化（图7B）。使用KEGG对代谢物进行富集分析，变化最大的途径与嘌呤和嘧啶代谢相关（图7C）。核苷酸降解途径中的几种代谢物显示出显著差异，表明核苷酸降解显著增加（图7D和E）。Adenosine在Ak9-/-精子中的水平急剧下降（图7D），可能是由于ATP转移障碍导致许多核苷酸未能被有效利用而浪费。此外，各种核苷酸的磷酸化水平变化提示AK9的缺失导致核苷酸磷酸化紊乱（图7F和G）。ATP/ADP和ADP/AMP比率的变化进一步表明AMP+ATP转化为ADP显著减少（图7F）。有趣的是，ATP产生的主要来源糖酵解和氧化磷酸化（OXPHOS）并未受到显著影响（图7H）。
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图7 AK9在精子核苷酸稳态维持中的作用
与Ak9-/-小鼠精子一样，在AK9缺陷的人类精子中也观察到腺苷显著降低。几种核苷酸的比率也发生了变化。此外，还测量了线粒体膜电位（MMPs）以了解线粒体的能量状态。结果显示，患者的精子MP值与对照组相似，表明正常的OXPHOS存在（图7F和G）。总之，数据表明AK9调节核苷酸磷酸化并影响精子中的核苷酸代谢。
本研究深入探讨了睾丸AK亚组亚中的AK8和AK9在雄性生殖系统中的组织分布和表达模式以及水平。通过动物模型的构建，研究者们明确了AK8和AK9的亚细胞定位，并解析了AK8/AK9调控鞭毛内ATP转运、决定精子运动的分子功能机制。此外，研究者还在弱畸精子症患者队列中鉴定出3例携带AK8或AK9基因的罕见纯合突变的病例，进一步证实AK8和AK9基因缺陷是人和小鼠弱畸精子症的致病因素。综上，该研究成果进一步丰富了男性不育遗传学病因，为患者的遗传咨询和临床精准干预提供了重要的理论依据。
1. 功能恢复与补偿机制：通过CRISPR或其他基因编辑技术尝试恢复AK8或AK9在缺陷模型中的表达，评估其对精子运动性、代谢和生育能力的影响。2. 临床关联性研究：开展大规模临床研究，评估AK8和AK9变异及其他导致弱精子症的致病基因突变在男性不育人群中的频率，及其与特定不育类型（如特发性弱精子症）的关联。其次研究这些基因变异对辅助生殖技术（如ICSI、IVF）成功率的影响，探索是否可以作为预后标志物或治疗干预的靶标。3. 个性化治疗策略：针对携带特定AK8或AK9变异的不育患者，探索个性化的治疗方案，如药物治疗（针对能量代谢的调节剂）或基因疗法。在辅助生殖技术中，考虑对携带变异的精子进行筛选或采用预处理，以提高治疗成功率。Driving innovation for better life
