自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）的特征在于社交沟通障碍和刻板行为，其在发达国家的患病率已从0.76%上升至1-2.5%。在中国，ASD的发病率约为0.7%-1%。大量研究表明，孕期暴露于环境有毒物质是导致儿童ASD发病率迅速增加的一个重要因素。特别是一些队列研究确认，母亲接触机动车尾气会增加子女患ASD的风险。
1-硝基芘（1-Nitropyrene, 1-NP）作为一种典型的硝基多环芳烃，普遍存在于柴油机尾气颗粒和烹饪排放中，是环境中的重要污染物。先前的研究显示，孕期晚期暴露于10 μg/kg剂量的1-NP与青少年后代学习记忆能力下降有关；而整个孕期暴露于10或100 μg/kg的1-NP则会导致成年阶段的焦虑样行为。尽管有这些关于1-NP暴露与神经系统疾病的关联报道，但1-NP是否能通过母体暴露引起后代出现自闭症样行为仍不清楚。孕期暴露于1-硝基芘（1-NP）通过何种具体生物学通路功能机制改变行为和表型更需要解答。
针对以上问题，2024年3月13日，安徽医科大学公共卫生学院徐德祥教授团队在国际知名期刊《先进科学（Advanced Science）》（IF=15.1）发表题为《Prenatal 1-nitropyrene exposure causes autism-like behavior partially by altering DNA hydroxymethylation in developing brain（脑发育过程中DNA羟甲基化修饰改变在产前1-硝基芘暴露诱发子代自闭症中的作用）》的研究论文。
安徽医科大学公共卫生专业硕士研究生赵婷为论文第一作者，合肥工业大学黄程青博士和安徽医科大学张医浩副教授为论文共同第一作者，徐德祥教授为论文通讯作者，王博副教授为论文共同通讯作者，安徽医科大学为第一完成单位。
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本研究结果发现孕期暴露于1-硝基芘（1-NP）通过改变发育大脑中与中间神经元迁移相关的基因DNA羟甲基化调控下游基因表达导致后代出现类似自闭症的行为表型。同时，发现补充TET酶的辅因子（α-酮戊二酸（α-KG）能够逆转1-NP引起的DNA低羟甲基化现象，缓解中间神经元迁移的迟缓并改善由1-NP引起的自闭症样行为。
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图1 动物和干预的实验方案
实验1：30只怀孕小鼠随机分为3组，分别给予不同剂量的1-NP（0, 10, 100 μg/kg）直至分娩。实验2-5：后续实验中，怀孕小鼠被分为不同的处理组，包括对照组、1-NP暴露组、α-酮戊二酸(α-KG)处理组以及1-NP+α-KG联合处理组。孕期暴露：从妊娠第0天(GD0)开始，对指定组别的怀孕小鼠口服给予1-NP或α-KG，直到特定的妊娠日（如GD13或GD17）。胎儿期：在指定时间点（如GD14或GD18），处死怀孕小鼠并收集胎儿前脑样本，用于后续分析。出生后：自然分娩后，在后代达到PND28或PND70时，选取部分小鼠进行行为测试或处死后收集前额叶皮质(mPFC)样本。社会交互测试：使用三室社交互动测试评估后代的自闭症样行为，记录雄性和雌性幼崽对陌生小鼠和空笼的嗅探时间。采用【Genesky Biotechnologies Inc, Shanghai 上海天昊生物科技有限公司】APOBEC偶联的表观遗传测序技术【针对候选基因使用多重PCR专利技术结合二代测序平台】检测CpG位点羟甲基化/羟甲基化水平相似性/羟甲基化水平差异/羟甲基化单倍型等同时实现对位点/片段/区域/基因/组间样本羟甲基化精确定量检测与分析。TET酶活性测定：提取核蛋白，检测TET酶活性。α-KG水平测定：通过液相色谱-串联质谱法测定α-KG水平。RNA测序与RT-PCR：进行RNA测序以分析差异表达基因，并通过RT-PCR验证特定基因的表达变化。免疫荧光(IF)：检测前额叶GAD67阳性中间神经元的数量和分布。Western Blot：分析特定蛋白质的表达量。电生理记录：检测前额叶皮层锥体神经元的微型抑制性突触后电流(mIPSC)，评估抑制性突触传递。
首先，通过对断奶后代进行社交行为测试。尽管高剂量组的断奶雄性小鼠表现出与1号陌生小鼠互动的偏好，但在低剂量组中并未观察到这一现象（图2B）。另一方面，来自高剂量组的断奶雌性测试小鼠并未显示出与1号陌生小鼠互动的偏好（图2C）。随后在断奶后代中进行了社交新奇行为测试。结果显示，低剂量组的断奶雄性测试小鼠表现出与2号陌生小鼠互动的偏好，而高剂量组的小鼠没有表现出这一偏好（图2E）。来自高剂量组的断奶雌性测试小鼠表现出了与接受高剂量1-硝基芘的雄性小鼠相似的表型（图2F）。
接下来，进一步评估了成年后代的社交行为和社交新奇行为。在社交行为测试中，来自两个1-硝基芘组的成年雄性测试小鼠并未显示出与1号陌生小鼠互动的偏好（图2H）。相反，高剂量组的成年雌性小鼠表现出与1号陌生小鼠互动的偏好，但在低剂量组中未观察到这一现象（图2I）。在社交新奇行为中，来自两个1-硝基芘组的成年雄性测试小鼠并未表现出与2号陌生小鼠互动的偏好（图2K）。另外，来自低剂量组的成年雌性小鼠表现出与2号陌生小鼠互动的偏好，而高剂量组的小鼠没有这一偏好（图2L）。以上结果均提示孕期1-NP暴露对后代社交行为产生负面影响。![]()
图2 孕期1-NP暴露对断奶后代自闭症样行为的影响
2. 孕期1-硝基芘暴露对后代前额叶皮质中抑制性突触后电流（mIPSC）的影响
为了评估断奶后代前额叶皮质(mPFC)中抑制性突触后电流(mIPSC)的变化，团队采用了兴奋性神经元的全细胞记录技术。研究发现，虽然雄性后代在经1-硝基芘(1-NP)暴露后，mIPSC的频率有所降低(图3A、B)，但两组间mIPSC的幅度并无显著差异(图3A、C)。尽管在mIPSC频率上没有差异(图3D、E)，但孕期1-硝基芘暴露导致雌性断奶后代的mIPSC幅度减小(图3D、F)。接下来，团队测量了成年后代mPFC中的mIPSC。结果表明，1-硝基芘暴露的雄性成年后代中，mIPSC的频率和幅度均有所降低(图3G-I)。尽管mIPSC的频率没有变化(图3J、K)，但暴露于1-硝基芘的雌性成年后代，其mPFC中的mIPSC幅度依然保持降低状态(图3J、L)。
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图3 孕期1-NP暴露对后代mIPSC的影响
3. 孕期1-硝基芘暴露对断奶后代前额叶皮质中GAD67+中间神经元的影响
为探究孕期1-硝基芘(1-NP)暴露对GAD67+中间神经元的影响，本研究检测了断奶雄性后代前额叶皮质(mPFC)中作为中间神经元标记物的GAD67。不出所料，暴露于1-NP的断奶雄性后代其mPFC中的GAD67蛋白水平降低(图4A、B)。随后，利用特异性神经元标记物NeuN对接触1-NP的断奶雄性后代进行了检测[29]。结果显示，两组后代mPFC中的NeuN蛋白水平无差异(图4C、D)。
免疫荧光(IF)结果显示，在mPFC的不同亚区中，GAD67+细胞占NeuN+神经元的比例在接触1-NP的断奶雄性后代中减少(图4E、F)。在各mPFC亚区中，接触1-NP与对照组雄性后代之间，NeuN+神经元的百分比无显著差异(图4E、G)。对断奶雌性后代进行了相同检测，发现接触1-NP的雌性幼崽mPFC中的GAD67蛋白水平同样降低(图4H、I)。在1-NP暴露与对照组雌性后代的mPFC中，NeuN蛋白水平也无显著差异(图4J、K)。如图4L、M所示，mPFC各亚区中GAD67+神经元相对于NeuN+神经元的比例均减少。虽然在1-NP暴露的幼崽中，mPFC的PrL区域NeuN+神经元的百分比有所增加，但在Cg1和IL区域，1-NP暴露与对照组雌性后代之间，NeuN+神经元的百分比无显著差异(图4L、N)。
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图4 孕期1-NP暴露对断奶后代GAD67+中间神经元的影响
4. 孕期1-硝基芘暴露对胎脑中中间神经元迁移的影响
在妊娠第18天(GD18)，在雄性胎儿的前额叶皮质(mPFC)中检测到了GAD67。如图5A、B所示，接触1-硝基芘(1-NP)的雄性胎儿，其mPFC中的GAD67蛋白水平下调。相应地，通过免疫荧光(IF)检测不同层中的GAD67+中间神经元，结果显示虽然两组在IZ层的GAD67+中间神经元无差异，但1-NP组雄性胎儿mPFC的CP和MZ层中GAD67+中间神经元数量减少（图5C、D）。相比之下，1-NP组雄性胎儿的SVZ/VZ层中GAD67+中间神经元数量增加（图5C、D）。接着，在雌性胎儿的mPFC中也检测到了GAD67，1-NP暴露的雌性胎儿mPFC中GAD67蛋白同样下调（图5E、F）。雌性胎儿中，尽管IZ层的GAD67+中间神经元在两组间无差异，但1-NP组的CP和MZ层中GAD67+中间神经元数量减少（图5G、H）。相反，1-NP组雌性胎儿的SVZ/VZ层中GAD67+中间神经元数量增加（图5G、H）。此前的研究表明，小鼠的中间神经元从GD14开始通过横向迁移到达额叶皮质[18,30]。在本研究中，GD14时在胎脑中检测了GAD67。尽管前脑的GAD67蛋白在两组间无差异（图5I、J），但从1-NP暴露组的胎脑中发现，前脑皮质中部和远端区域（第2和第3区）的GAD67+中间神经元数量减少（图5K、L）。随后，检测了两组之间12个与中间神经元迁移相关的基因。尽管Cxcl12、Cxcr4、Cxcr7、Slit1、Efna5、Arx、Nrp1、Nrp2和Sema3A无差异（图5M-U），但Nrg1、Erbb4和Sema3F在1-NP暴露的胎脑中显示出减少（图5V-X）。![]()
图5 妊娠期1-NP暴露对胎儿大脑中间神经元迁移的影响
5. 孕期1-硝基芘暴露对胎脑中间神经元迁移相关基因DNA羟甲基化的影响
在妊娠第14天(GD14)的胎脑中，研究了孕期1-硝基芘(1-NP)暴露对中间神经元迁移相关基因中5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)含量的影响。Nrg1、Erbb4和Sema3F基因的甲基化位点序列如图6A所示。尽管在Nrg1和Erbb4基因的富含CpG片段中，5hmC水平在两组间没有差异，但在1-硝基芘暴露的胎鼠中，Sema3F基因的一个富含CpG的片段中的5hmC水平降低（图6B）。接下来，检测了Nrg1、Erbb4和Sema3F基因CpG位点的5hmC含量。结果显示，1-硝基芘组胎脑中，位于染色体1上的Nrg1基因特定CpG位点(chr1:32009246)的5hmC含量降低（图6C）。同样，1-硝基芘暴露组胎脑中，位于染色体8上的Erbb4基因两个特定CpG位点(chr8:69107743和chr8:69107866)的5hmC含量也降低。此外，1-硝基芘组胎儿中，位于Sema3F基因三个特定CpG位点(chr9:107709269、chr9:107709348和chr9:107710238)的前脑5hmC水平也降低。检测了胎脑中三种DNA去甲基酶TET1、TET2和TET3的水平，尽管1-硝基芘并未影响这些酶的表达（图6D至F），但1-硝基芘暴露组胎鼠的前脑中TET酶活性降低（图6G）。![]()
图6 妊娠期1-NP暴露对胎儿前脑中间神经元迁移相关基因羟甲基化的影响
为探究1-硝基芘导致胎脑中与中间神经元迁移相关基因的羟甲基化改变以及TET酶活性抑制的原因，研究人员对妊娠第14天（GD14）的胎脑进行了转录组分析。KEGG和GO分析发现，1-硝基芘引起了前脑中与线粒体相关的代谢功能障碍，如烟酸/烟酰胺代谢、类固醇生物合成及长链脂肪酸代谢异常（图7A、B）。基于KEGG的基因集富集分析（GSEA）显示，氧化磷酸化途径在1-硝基芘暴露的胎脑中呈现负向富集（图7C）。基于GO的GSEA表明，电子传递链和氧化磷酸化途径在1-硝基芘暴露的胎脑前部也呈负向富集（图7D、E）。基于Reactome的GSEA显示，三羧酸循环（TCA循环）和呼吸电子传递在1-硝基芘暴露的胎脑中同样呈负向富集（图7F）。此外，尽管线粒体面积无明显差异，但在1-硝基芘暴露的胎脑中，作为中间神经元起源地的基底神经节中的线粒体嵴结构消失（图7G-I）。两种与氧化磷酸化相关的蛋白质——琥珀酸脱氢酶B（SDHB）和ATP合酶亚单位vATP5A在1-硝基芘诱导的胎脑中表达下调（图7J-L）。最后，负责线粒体α-酮戊二酸（α-KG）合成的关键酶异柠檬酸脱氢酶2（IDH2）以及TET酶的辅助因子α-KG在1-硝基芘暴露的胎脑中的含量均减少（图7M-O）。![]()
图6 妊娠期1-NP暴露对胎儿前脑中间神经元迁移相关基因羟甲基化的影响
7. α-KG补充对1-NP引起的胎脑中中间神经元迁移相关基因低羟甲基化影响
图8A至F展示了α-KG补充对1-NP诱导的中间神经元迁移相关基因低羟甲基化的影响。正如预期，孕期补充α-KG有效抑制了1-NP引起的Nrg1基因特定CpG位点(chr1: 32009246)的5hmC下降（图8A）。而且，孕期α-KG的补充还防止了1-NP导致的Sema3F基因某特定CpG位点(chr9:107710238)的5hmC减少（图8F）。α-KG的补充显示出对1-NP引起的Erbb4基因及其他Sema3F基因CpG位点5hmC下降具有一定的保护趋势（图8B至E）。接下来，分析了α-KG对1-NP导致的中间神经元迁移相关基因表达减少的影响。如图8G至I所示，孕期补充α-KG缓解了1-NP引起的胎脑中Sema3F、Nrg1和Erbb4表达的下降（图8G至I）。![]()
图8 补充𝛼-KG对1-NP诱发的胎儿前脑中间神经元迁移相关基因的低羟基甲基化和中间神经元迁移抑制的影响
8. α-KG补充对1-NP诱导的中间神经元迁移抑制作用
团队分析了α-KG补充剂对1-NP引起的中间神经元迁移抑制效果的影响。如图8J、K所示，孕期α-KG的补充逆转了1-NP导致的前脑皮质中部和远端GAD67+中间神经元数量的减少。然后评估了孕期α-KG补充对断奶雄性后代mPFC中GAD67+中间神经元的影响。如图9A、B所示，孕期α-KG的补充阻止了1-NP引起的mPFC中GAD67蛋白的下调。尽管对NeuN+神经元的影响较小（图9C、E），孕期α-KG的补充还是逆转了1-NP导致的mPFC中GAD67+神经元与NeuN+神经元比例的下降（图9C、D）。接下来，在断奶雌性后代中分析了孕期α-KG补充对mPFC中GAD67+中间神经元的影响。如图9F、G所示，α-KG补充逆转了1-NP引起的mPFC中GAD67蛋白的减少。尽管mPFC各亚区中NeuN+神经元的百分比无显著差异（图9H、J），α-KG补充的雌性后代中，1-NP引起的Cg1和IL亚区GAD67+神经元与NeuN+神经元比例的下降得到了逆转（图9H、I）。![]()
图9 妊娠期补充𝛼-KG对断奶后代中间神经元的影响
9. α-KG补充对1-NP引起的后代mIPSC传递障碍的影响
为了分析母体α-KG补充对雄性后代mPFC中1-NP导致的mIPSC传递障碍的作用。尽管对mIPSC幅度无影响（图10A、C），孕期α-KG的补充能挽救雄性后代中由1-NP引起的mIPSC频率下降（图10A、B）。然后在雌性后代中分析了孕期α-KG补充对1-NP引起的mPFC中mIPSC传递障碍的影响。结果显示，四组雌性在mIPSC频率上无差异（图10D、E）。有趣的是，孕期α-KG的补充能保护mPFC中mIPSC幅度不受1-NP诱导的下降（图10D、F）。
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图10 妊娠期补充𝛼-KG对1-NP诱导的mIPSC传播障碍和自闭症样行为的影响
10. α-KG补充对1-NP引起的后代自闭症样行为的影响
团队人员评估了孕期α-KG补充对雄性后代中1-NP诱导的自闭症样行为的效应。结果显示，孕期α-KG的补充能预防雄性后代的社交行为障碍（图10G），并缓解雄性后代的社交新奇行为障碍（图10H）。接下来，在雌性后代中评估了孕期α-KG补充对1-NP引发的自闭症样行为的影响。结果显示，孕期α-KG的补充能保护雌性后代免受社交行为障碍的影响（图10I），同时也能保护雌性后代的社交新奇行为障碍（图10J）。孕期暴露于1-硝基芘（1-NP）可以导致后代出现类似自闭症的行为，这一效应部分是通过改变发育中大脑中与中间神经元迁移相关的基因DNA羟甲基化实现的。具体而言，研究发现1-NP暴露减少了前额叶皮质中γ-氨基丁酸脱羧酶67（GAD67）阳性中间神经元的数量，阻碍了这些神经元的横向迁移，并下调了与神经元迁移相关的基因（如Nrg1, Erbb4, 和Sema3F）的表达。机制上，1-NP通过抑制胎儿前脑中的十-十一转移酶（TET）活性，减少了这些基因的DNA羟甲基化水平。研究还指出，补充α-酮戊二酸（α-KG），作为TET酶的辅因子，能够逆转1-NP引起的DNA低羟甲基化现象，缓解中间神经元迁移的迟缓，并改善由1-NP引起的自闭症样行为。基于本研究系统严谨的高水平实验结论和结果，考虑以下几点来进一步提升治疗效果和患者管理以及给予公共卫生专家和决策者参与制定社会公共政策：公共卫生影响：揭示了环境污染物1-NP与自闭症谱系障碍（ASD）风险增加之间的新联系，为预防ASD提供了环境因素上的证据，尤其是针对居住在高污染区域的孕妇。生物学机制理解：深化了对自闭症发病机制的理解，特别是关于神经发育过程中关键基因调控异常的角色，以及环境因素如何通过表观遗传途径影响这一过程。性别差异的考量：研究指出了孕期1-NP暴露导致的自闭症样行为在性别上的特异性差异，为今后研究自闭症的性别偏向性提供了线索。潜在治疗策略：提出了一种可能的干预手段，即通过调节α-KG代谢来预防或减轻由环境毒素引起的神经发育障碍，为ASD的预防和治疗提供了新的方向。环境政策制定：研究成果可为政府和环保机构制定更严格的空气质量和车辆排放标准提供科学依据，以保护孕妇和胎儿免受有害化学物质的伤害。综上所述，这项研究不仅增进了对自闭症病因学的科学理解，还为预防和治疗提供了潜在的靶点，具有重要的临床和公共卫生意义。参考文献：Zhao T, Huang CQ, Zhang YH, Zhu YY, Chen XX, Wang T, Shao J, Meng XH, Huang Y, Wang H, Wang HL, Wang B, Xu DX. Prenatal 1-Nitropyrene Exposure Causes Autism-Like Behavior Partially by Altering DNA Hydroxymethylation in Developing Brain. Adv Sci. 2024 May 16:e2306294. doi: 10.1002/advs.202306294. Epub ahead of print. PMID: 38757379.
