结直肠癌（CRC）的发展涉及多步骤累积获得的遗传和表观遗传改变，包括DNA甲基化、组蛋白乙酰化和组蛋白甲基化，这些变化共同促使正常结肠上皮细胞向腺癌转化。在过去几十年里，研究人员投入大量精力和资源来理解携带关键基因突变的肿瘤细胞如何影响其恶性细胞行为。然而，目前尚不清楚是否存在这样一种可能性，即突变的肿瘤细胞能够触发周围正常细胞向恶性转化。肿瘤的起始和进展需要癌细胞的代谢重编程。阐明基因突变与代谢表型之间的相互作用对于理解癌症发病机制和识别新的治疗靶点至关重要。关键基因突变常常导致代谢产物合成异常，包括天冬酰胺、α-酮戊二酸和谷氨酰胺。有证据表明，代谢产物通过调节氧化还原平衡、免疫微环境、肠道微生物生态和预转移生态位的形成来促进肿瘤生长。然而，关于突变肿瘤细胞衍生的代谢产物对正常细胞恶性转化的贡献尚未明了。在所有人类癌症中，PIK3CA是最常发生突变的致癌基因之一，使其成为癌症治疗的主要目标。阿培利司，一种选择性PIK3CA抑制剂，已被批准用于治疗携带PIK3CA突变的乳腺癌患者。团队之前的工作显示，相比于同基因野生型（WT）肿瘤，阿培利司在PIK3CA突变异种移植肿瘤中显示出一定的肿瘤抑制效果。然而，早期临床试验显示，阿培利司在治疗含有PIK3CA突变的结肠癌时患者响应参差不齐。鉴于阿培利司选择性靶向PIK3CA突变肿瘤细胞的事实，这意味着仅仅针对突变肿瘤细胞可能不足以治疗结肠癌。
针对以上科研问题，2024年4月5日，济宁医学院附属医院医学研究中心张斌团队联合济宁医学院免疫学与分子医学研究所熊化保团队在Cell子刊Cell Reports Medicine（中科院1区，IF：14.3）上在线发表最新研究成果“Arachidonic acid released by PIK3CA mutant tumor cells triggers malignant transformation of colonic epithelium by inducing chromatin remodeling”， 济宁医学院附属医院医学研究中心何宝玉和别庆丽为论文的共同一作，本研究结果揭示“PIK3CA突变肿瘤细胞释放花生四烯酸（AA），通过诱导染色质重塑引发结肠上皮的恶性转化”。
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- 1、细胞培养与转染：在体外培养PIK3CA突变和野生型肿瘤细胞，对这些细胞系进行各种处理和转染实验，以研究不同条件下的细胞特性。
- 2、CRISPR/Cas9基因编辑：利用CRISPR/Cas9技术生成基因敲除细胞株，以验证PIK3CA突变对AA合成及后续效应的具体贡献。
- 3、免疫组织化学与免疫荧光分析：这些技术被用来定位和可视化特定蛋白质在细胞或组织中的表达和分布，以评估AA及相关蛋白质在细胞内的作用。
- 4、代谢组学分析：进行非靶向代谢组学分析，以全局性地识别和量化细胞内代谢物，特别是AA及其相关代谢产物的水平。
- 5、RNA提取与实时定量PCR：通过这种方法分析基因表达水平的变化，了解AA如何影响基因表达调控。
- 6、细胞功能实验：包括细胞存活率测定、克隆形成、球状体形成、侵袭能力检测等，用以评估AA对细胞增殖、迁移、侵袭等恶性表型的影响。
- 7、转录因子和染色质重塑功能验证：通过ATAC-seq数据分析DNA层面染色质开放区域，通过RNA-seq分析开放区域基因表达情况，结合染色质免疫沉淀测序分析（ChIP-seq）验证转录因子结合组蛋白H3K4me3激活调控功能。【RNA-seq/ATAC-seq/ ChIP-seq 联合分析来自Genesky Biotechnologies Inc, Shanghai 上海天昊生物科技有限公司】，证实AA通过H3K4me3影响染色质重塑和功能。
- 8、蛋白质相互作用研究：通过共免疫沉淀(co-immunoprecipitation)分析蛋白质间的相互作用，例如AA与Menin蛋白的直接结合情况。
- 9、生化酶活性测定：如体外cPLA2泛素化和结合实验，以研究AA合成途径中的关键酶活性变化。
- 10、Western Blotting：用于验证蛋白质表达水平和磷酸化状态，以确认研究假设和实验结果。
- 11、小鼠模型：利用多种小鼠模型（如原位结肠癌模型、尾静脉注射转移模型、AOM/DSS诱导的结直肠肿瘤发生模型及转基因小鼠模型）来模拟人类CRC的病理过程，评估AA的作用及测试潜在治疗策略的效果。
- 12、组学数据整合与分析：整合RNA-seq、ATAC-seq、全基因组测序、甲基化芯片和ChIP-seq数据，进行系统性的生物信息学分析【联合分析来自Genesky Biotechnologies Inc, Shanghai 上海天昊生物科技有限公司】，以全面解析AA介导的表观遗传学改变。
1. PIK3CA突变肿瘤细胞将肠上皮细胞恶性转化为肿瘤细胞并促进结直肠癌的进展
PIK3CA突变的肿瘤细胞能够恶性转化肠道上皮细胞（IECs），并促进结直肠癌（CRC）的发展。目前尚不清楚PIK3CA突变的肿瘤细胞是如何影响周围正常细胞。为此，团队设计了一个直接训化模型，如图1A所示。结果显示，由PIK3CA E545K突变肿瘤细胞和NCM460细胞混合培养产生的异种移植瘤，相比于由PIK3CA野生型（WT）肿瘤细胞和NCM460细胞混合或纯PIK3CA E545K或WT肿瘤细胞形成的异种移植瘤，显示出更高的发生率和更强大的肿瘤生长速率。接下来，团队评估了经训化后的NCM460 F2细胞在体内外的生物学功能。观察到，经PIK3CA E545K肿瘤细胞训化的NCM460细胞表现出与从纯PIK3CA WT肿瘤细胞（GFP+ DLD1WT细胞）异种移植瘤中分离出的细胞相似的肿瘤形成能力和转移潜能（图1B、1C、1D）。
随后，团队着手确定PIK3CA突变肿瘤细胞在IECs中的转化是否依赖于直接的物理接触。如图1E所示，团队采用一种远端驯化模型。观察发现，PIK3CA突变肿瘤细胞能够远程诱导非肿瘤性NCM460细胞形成可见的肿瘤，而PIK3CA WT细胞缺乏这种能力（图1F）。此外，经PIK3CA突变肿瘤细胞远程驯化的NCM460细胞表现出了与PIK3CA WT肿瘤细胞相近的致瘤性，肿瘤发生率和肿瘤生长曲线几乎相同（图1G）。PIK3CA突变肿瘤细胞成功诱发的现象使团队推测，这些细胞可能通过旁分泌机制向周围细胞传递恶性信号。正如预期的那样，接受来自PIK3CA突变癌症供体细胞的条件培养基处理的NCM460细胞和PIK3CA WT肿瘤细胞在体外功能上得到了增强，这一观察结果在使用偶氮甲烷/葡聚糖硫酸钠（AOM/DSS）诱导的结直肠肿瘤发生模型中得到了进一步证实（图1H）。来自PIK3CA E545K肿瘤细胞的条件培养基处理显著促进了AOM/DSS引起的结直肠肿瘤发生，从结肠组织学、肿瘤数量和小鼠存活率（图1I至1K）可以看出。综上所述，这些发现表明PIK3CA突变肿瘤细胞通过旁分泌机制传递恶性信号，并启动IECs的恶性转化。![]()
图1 动物模型表明PIK3CA突变细胞触发结肠上皮细胞的恶性转化
外泌体成分作为关键介质，承担着致癌突变信号的传递任务。细胞培养上清液中的旁分泌成分主要由可溶性细胞因子和细胞外囊泡（EVs）组成，其中外泌体是EVs中最主要的类型。通过分离并验证了来自PIK3CA突变肿瘤细胞和野生型（WT）肿瘤细胞的外泌体。结果显示，源自PIK3CA突变肿瘤细胞的外泌体成分和条件培养基在提高受体NCM460细胞的存活能力方面表现出了相似的效率；当去除外泌体后，条件培养基的刺激能力被完全消除，这支持了外泌体成分负责从PIK3CA突变肿瘤细胞传递恶性信号的可能性。
为了进一步证实这一观点，研究者进行了体内实验（图2A）。一致地，来源于PIK3CA突变肿瘤细胞的条件培养基和外泌体成分均在NCM460受体细胞中诱导了肿瘤生成表型，表现为可见肿瘤的形成（图2B和2C）。使用来自PIK3CA突变肿瘤细胞的条件培养基或外泌体成分处理显著加剧了AOM/DSS诱导的结直肠肿瘤发生（图2D至2H）。这些发现强烈证实了外泌体成分作为介质，在传递与PIK3CA突变相关的致癌信号过程中发挥的关键作用。
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图2 外泌体成分作为传递基因突变信号的关键介质
3. 外泌体介导的花生四烯酸作为传递PIK3CA突变信号的关键介质
代谢特征在决定细胞命运转变中起着关键作用，并能显著影响细胞行为。鉴于驯化肠道上皮细胞（IECs）中观察到明显的致癌表型和成瘤性，团队推测隐藏在外泌体中的代谢物可能控制着恶性信号的传递。为了探究这一假设，团队进行了非靶向代谢组学分析，检查代谢物组成的差异。值得注意的是，在比较相应的对照后，AA在PIK3CA突变供体细胞、外泌体成分及NCM460受体细胞中的差异代谢物中显著上调（图3A和3B）。有趣的是，来自PIK3CA突变细胞的去外泌体培养基与来自野生型细胞的相比，AA水平差异微小（图3A、3B）。这些发现推测，PIK3CA突变细胞可能通过外泌体将AA转运至IECs，从而促进恶性信号的传递。为进一步证实我们的假设，在五个组别中定量了AA：(1) PIK3CA突变肿瘤组织中的AA水平显著高于野生型肿瘤（图3C）；(2) 结直肠癌患者血清中AA水平明显高于健康对照（图3D）；(3) 携带PIK3CA突变异种移植肿瘤的小鼠血清显示AA水平增加（图3E）；(4) 直接教育模型中外泌体富集组相较于去外泌体组，血清中AA水平有明显提升（图3F）；(5) 携带Pik3caH1047R/+突变的小鼠血清中观察到AA水平升高（图3G）。因此，上述实验模型中AA的测量与比较一致支持AA作为恶性信号传递关键介质的观点。
接下来，团队提供了五条证据来验证AA在将PIK3CA突变肿瘤细胞的恶性信号传递给IECs中的关键作用：(1) AA显著增强了AOM/DSS诱导的结直肠肿瘤发生（图3H至3K）；(2) 细胞质磷脂酶A2（cPLA2）敲除的PIK3CA突变肿瘤细胞无法远程诱导NCM460细胞的成瘤表型（图3L、3M）；(3) 来自cPLA2敲除的PIK3CA突变肿瘤细胞的外泌体成分减弱了其成瘤性（图3N至3Q）；(4) AA使得来自PIK3CA野生型肿瘤细胞的条件培养基与来自PIK3CA突变细胞的相比，在增强NCM460细胞存活能力方面表现出类似效果；(5) cPLA2的敲低或敲除显著降低了PIK3CA突变肿瘤细胞中的AA水平，并干扰了它们在NCM460细胞中诱发恶性生物学行为的能力。总的来说，数据强有力地支持了外泌体介导的AA作为传递PIK3CA突变信号的关键介质的概念。
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图3 外泌体介导的AA负责传递致癌突变信号
在AA的下游代谢级联反应中，环氧化酶1（COX1）、COX2或前列腺素（PG）内过氧化物H合酶将AA催化为PGs（如PGD2和PGE2）。团队尝试探索这些AA的下游代谢产物是否介导了来自PIK3CA突变肿瘤细胞到NCM460细胞的致癌信号。团队观察到PIK3CA突变CRC患者的血清或肿瘤组织中PGD2或PGE2的水平几乎与PIK3CA野生型组相当，这与AA的变化并不相符。重要的是，沉默COX1或COX2未能缓解AA诱导的NCM460细胞存活能力的增强。因此，团队得出结论，在存在PIK3CA突变的情况下，AA的下游代谢级联并不显著激活。
先前的研究表明，AA可以调节结肠癌细胞中众多基因的表达，但其背后的机制仍很大程度上未知。通过RNA测序（RNA-seq）数据显示，与对照组相比，AA处理的NCM460细胞中1,312个基因表达上调，而741个基因下调（图4A和B）。基因表达的广泛变化通常与染色质重塑紧密相关，因此，利用转座酶进行染色质可及性测序（ATAC-seq）调查了AA处理的NCM460细胞中的染色质可接近性状态。与对照相比，AA处理的NCM460细胞中有1,812个基因的可接近性增加，而567个基因的可接近性降低（图4C和D）。
转录因子（TFs）通过调节基因表达在调控肿瘤发展和恶性进展中发挥关键作用。通过对RNA-seq数据中的上调基因集和ATAC-seq的开放基因集进行了交集分析。在88个重叠基因中，鉴定了8个与癌症相关的TFs——SOX2、HIF1A、E2F1、ELF3、IRF6、MYB、ASCL2和EHF——它们在AA刺激后表达上调，并且相关染色质区域处于开放状态（图4E）。这8个TFs的基因轨迹显示，在AA处理的NCM460细胞中，与对照NCM460细胞相比，染色质可接近性显著增加（图4E）。这些发现表明，AA可能通过调节IECs中的染色质重塑，诱导一系列与癌症相关的TFs的表达。
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5. AA特异性结合到Menin蛋白并增强Menin-MLL1/2相互作用
为寻找AA潜在的相互作用蛋白，研究团队开发了一种通过整合免疫沉淀和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的方法来定量AA与亚基蛋白的痕量结合。结果观察到Menin免疫沉淀代谢物中AA丰度显著增加，与免疫球蛋白G（IgG）对照相比，抗Menin免疫沉淀中AA丰度约为31.2倍（图6A）。数据表明，AA特异性结合Compass复合物的Menin调节亚基。分子对接分析证实了这些观察结果，表明AA优先停靠在中央腔中，在Menin拇指结构域和手掌结构域形成的界面上（图6C，左），主要依赖于与Tyr323的氢键（图6C，右）。体外结合实验表明纯化的Menin WT蛋白与AA之间存在直接相互作用，相反，Menin Y323A突变体消除了与AA的结合能力（图6D-6F）。研究观察到PIK3CA突变的肿瘤细胞能够远程诱导NCM460细胞的可见实体肿瘤，而Menin Y323A突变破坏了这一过程（图6G-6I）。这些数据表明AA可以直接结合Menin在Tyr323，这一过程对于NCM460细胞的恶性转化至关重要。
团队进一步揭示AA-Menin相互作用如何影响H3K4三甲基化。首先，AA和Menin的对接区域位于中央腔，Menin和MLL蛋白的主要相互作用域位于此（图6C）。其次，靶向MLL1、MLL2或Menin的小干扰RNA显著破坏了AA引起的NCM460细胞活力的增加（详见原文补充材料）。Menin-MLL1/2相互作用在激活MLL1/2甲基转移酶活性中起着至关重要的作用。因此，研究人员推测AA可能作为闩锁加强Menin和MLL的相互作用并触发H3K4甲基化。事实上，外源补充AA明显促进了Menin和MLL1/2的相互作用，并随之增加了H3K4me3水平（图6J）。然后，cPLA2 KO降低了Menin和MLL1/2的结合，并且在补充AA后恢复了亲和力（图6K）。与此一致的是，外源性补充AA未能恢复Menin Y323A KI的NCM460细胞中Menin和MLL1/2的相互作用（图6L）。![]()
图6 AA与Menin蛋白特异性结合，并增强了Menin-MLL1/2的相互作用体外共免疫沉淀实验一致显示，AA确实明显增强了重组Menin与截断的MLL1蛋白之间的相互作用（图6M）。最后，计算结构分析表明，AA的参与增强了Menin和MLL1的相互作用，对接得分更低（图6N）。这些结果表明，AA可能通过Tyr323位点与Menin结合，介导Menin和MLL的相互作用。Menin-AA-MLL联合体可以形象地比喻为“榫卯结构”，其中AA充当闩锁，在维持Menin-MLL复合体的稳定性和完整性方面起着重要作用（图6O）。
6. Menin-MLL1相互作用抑制剂VTP50469和p110α选择性抑制剂阿培利司联合使用可抑制肿瘤
研究团队使用AOM/ DSS诱导的结直肠肿瘤发生模型实施了VTP50469指导的治疗策略（图7A）。虽然在PIK3CA WT细胞培养基组中治疗效果没有明显差异，但在VTP50469处理后，PIK3CA突变细胞培养基组的肿瘤数量明显减少，小鼠存活时间明显延长（图7B-7D）。一致的结果表明，VTP50469具有优先抑制携带PIK3CA突变的实体瘤的特性。接下来，采用患者来源的异种移植瘤（PDX）模型来评估VTP50469单独使用或与阿培利司联合使用的治疗效果（图7E）。在PIK3CA WT PDX模型中，联合用药仅导致肿瘤生长减速（图7F）。然而，在PIK3CA突变体PDX模型中，VTP50469和阿培利司的组合导致肿瘤消退（图7G）。总之，这些结果表明，VTP50469和阿培利司的联合可能是一种有效的治疗PIK3CA突变的癌症的方法。
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图7 Menin-MLL1相互作用抑制剂VTP50469和选择性p110a抑制剂alpelisib联合使用可导致肿瘤抑制
1、本研究发现AA通过与Menin蛋白相互作用，增强了H3K4三甲基化，导致组蛋白修饰改变，这是恶性转化的关键步骤。基于这一发现，提出了使用Menin-MLL1相互作用抑制剂VTP50469与p110α选择性抑制剂阿培利司联合治疗PIK3CA突变CRC的策略。这为临床实践中针对特定基因突变的个性化治疗提供了新的可能性。2、本研究揭示了PIK3CA突变如何通过非典型途径（如代谢产物AA）影响周围细胞的表观遗传状态，而非直接的信号传导通路。这扩展了对PIK3CA突变在癌症发展中作用的认识，有助于未来开发更精准的预防和干预策略。3、本研究指出AA水平与PIK3CA突变状态的相关性，提示血清AA水平可能作为CRC患者中PIK3CA突变状态的一个生物标志物。这可能为疾病的早期检测和监测提供新的手段，甚至在高风险人群中实施预防性干预。4、在动物模型中，联合疗法显著抑制了携带PIK3CA突变的CRC肿瘤生长，表明这种治疗策略可能在临床上有效。临床试验可以进一步验证这一组合疗法的安全性和有效性，为PIK3CA突变的CRC患者提供新的治疗希望。5、本研究证明了PIK3CA突变的肿瘤细胞比PIK3CA WT肿瘤细胞合成更多的AA。然而，AA是否会影响肿瘤细胞的染色质重塑，进而影响其恶性行为，仍有待进一步研究。因此，需要更多的研究来全面阐明AA作为肿瘤细胞中组蛋白甲基化调节因子的功能。![]()
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