DNA甲基化是最早被发现、也是目前研究最深入的表观遗传调控机制之一。DNA甲基化修饰在维持正常细胞的功能、雌性个体X染色体失活、基因组结构稳定、遗传印记、胚胎发育、肿瘤疾病的发生发展发挥着重要作用。5mC通常可以导致基因沉默或基因表达水平降低，肿瘤抑癌基因的过甲基化或原癌基因的低甲基化在多种肿瘤中被发现和证实。5-甲基胞嘧啶(5mC) 主要是在DNMTS（DNA甲基化转移酶）作用下基因组 DNA上的胞嘧啶第5位碳原子和甲基间的共价结合，胞嘧啶由此被修饰为5甲基胞嘧啶 (5-methylcytosine, 5-mC)。在基因表达调控及正常发育的广泛生物过程中发挥着重要作用，被认为是第五个碱基。5mC具有以下特点：1）可遗传2）组织和器官特异性3）可逆性 4）可作为biomarker反应疾病状态和暴露因素等。
DNA羟甲基化（DNA Hydroxymethylation）是DNA甲基化中5-甲基胞嘧啶（5mC）在TET家族酶的催化下发生氧化形成5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）。已有报道5hmC在人和小鼠大脑以及胚胎干细胞中广泛存在。但是在CNS系统的神经元细胞含量较高，被认为是第六碱基。5hmC作为去甲基化过程的第一步，则会导致基因激活或基因表达水平增高，研究表明DNA的5hmC在多种肿瘤中有明显降低。5hmC具有以下特点：1）组织和器官特异性2）可逆性 3）动态变化4）可作为biomarker反应疾病状态和暴露因素等。
因此，DNA甲基化和DNA羟甲基化是甲基化和去甲基化的动态平衡的体现，在维持正常细胞的功能、雌性个体X染色体失活、基因组结构稳定、遗传印记、胚胎发育、肿瘤疾病的发生发展具有至关重要的作用，是基因沉默和表达的关键调控因素。
因此，分析基因组的5mC和5hmC水平具有重要的科学和临床操作以及诊断的指导意义。
2022年3月24日美国华盛顿大学医学院研究人员发现DNA甲基化和羟甲基化调控对免疫细胞的发育和功能至关重要，并揭示了先天性淋巴细胞之间不同的调控程序。此项成果“Whole-genome profiling of DNA methylation and hydroxymethylation identifies distinct regulatory programs among innate lymphocytes”发表在《Nature Immunology》杂志（IF=25.606）。
在这项研究中，作者对先天淋巴细胞的DNA甲基化和羟甲基化进行了全基因组的表征，并确定了NK细胞、2型先天淋巴细胞（ILC2）和3型先天淋巴细胞（ILC3）之间的差异甲基化区域(DMRs)和差异羟甲基化区域(DHMRs)。此外，使用DNA羟甲基化酶（TET2）缺失的小鼠模型验证了羟甲基化在先天淋巴细胞功能程序中起着因果作用。随着甲基化分析的灵敏度提升，针对ILC和NK细胞祖细胞的实验将在进一步研究先天淋巴细胞谱系的传承中发挥重要作用。
研究对象：小鼠不同组织器官（脾脏、小肠、肺）分选的细胞
研究方法：联合MeDIP-seq和MRE-seq进行全基因组甲基化水平检测及分析；
5hmC-Seal技术对全基因组羟甲基化水平检测及分析；
1. 先天淋巴细胞（ILC）特异性转录程序的DMRs
NK细胞与ILC2，NK细胞与ILC3，ILC2与ILC3，两两比较，鉴定出9011个独特的DMRs(图1b)。DMRs主要富集在基因内区域，其次是基因间区域，提示远端调控元件的参与。同时也在启动子区富集，表明其在调节启动子活性方面发挥作用。
NK细胞的DMRs比ILC2s或ILC3s多2-3倍，ILC2s比ILC3s多2-3倍，每个比较中高甲基化和低甲基化DMRs的数量大致相等(图1c)。PCA分析表明，ILC2s和ILC3s沿着PC1从NK细胞中分离，而PC2分离了ILC2s和ILC3s，这表明NK细胞是最不同的子集，而ILC2s和ILC3s细胞相对更相似(图1d)。
甲基化数据+RNA测序数据（免疫基因组计划）联合分析发现大量的DMRs与DEGs相关（图1e），而且高甲基化与基因表达呈负相关。
在每一两两比较中，每种细胞类型约有50%的DMRs被共享(图1f)。一般来说，对于每个亚群，低甲基化DMRs比高甲基化DMRs更容易共享(NK细胞：1458共享低甲基化DMRs与832共享高甲基化DMRs；ILC2：723对123；ILC3：616对55；扩展数据图1c。因此，选择性去甲基化可能比选择性甲基化在指定成熟的先天性淋巴细胞转录组方面发挥更普遍的作用。
2. 先天淋巴细胞（ILC）特异性转录程序的DHMRs
许多活跃的去甲基化区域同时包含 5mC 和5hmC，这是我们当前分析未捕获的动态平衡。因此，我们使用hmC-Seal实验分析了5hmC在NK细胞、ILC2s和ILC3s中的全基因组分布。三次两两比较，得到了7384个一致的独特DHMRs(图2a)。DHMRs主要集中在内含子区域和基因间区域，在外显子和启动子区域相对较少。研究发现NK细胞与ILC2s和ILC3s的比较中有更多DHMRs，而且高于ILC2s与ILC3s的比较，并且两者之间有相当数量的DHMRs是相同的(图2b)。使用5hmC丰度的PCA分析表明NK细胞与ILC2s和ILC3s强烈分离。
接下来，整合DHMR分析与DEGs，观察到DNA羟甲基化与基因表达之间存在正相关关系。对于每一个两两比较，只有少数的DHMRs直接与DMRs重叠(图2c)。在重叠区域中，大多数高甲基化的DMRs都是低羟甲基化的，反之亦然(图2d)。然后，通过GO富集分析探究DMRs和DHMRs是否与不同生物途径的调控相关。DMR相关的GO更多地与免疫细胞的分化和发育相关，而DHMR相关的GO更多地与淋巴细胞的活化相关。总之，这些分析表明，DNA甲基化调节先天性淋巴细胞的发育，而DNA羟甲基化更多地调节效应活性。
此外研究人员还将决定谱系的转录因子（LDTF）与去甲基化联系起来，并证明了DNA甲基化/羟甲基化的独特模式与开放染色质区域（OCR）、组蛋白修饰和TF结合点的关系及羟甲基化和NK细胞超级增强子（SE）之间的关联。利用缺乏DNA羟甲基化酶TET2的小鼠，研究人员证明了TET2在ILC3的标志细胞因子和炎症ILC2的白细胞介素-17A（IL-17A）最佳生产中是必须的。这些发现为研究先天性淋巴细胞的表观遗传调控提供了一个强大的资源，并解读了支配其身份的调控逻辑。
固有淋巴细胞（ILC）包含具有特殊功能的多种表型特征。DNA甲基化和羟甲基化对表观遗传的保真性和命运传承至关重要。在固有淋巴细胞中，这些修饰的情况是未知的。在本研究中，作者研究了小鼠固有淋巴样细胞3 (ILC3)、固有淋巴样细胞2(ILC2)和自然杀伤细胞(NK)中的5-甲基胞嘧啶 (5mC)和5-羟甲基胞嘧啶 (5hmC) 的全基因组分布。确定了ILC和NK细胞亚群之间的差异甲基化区域(DMRs)和差异羟甲基化区域(DHMRs)，并将它们与转录标记相关联。同时将谱系决定转录因子 (LDTF)与去甲基化联系起来，并展示了与开放染色质区域 (OCR)、组蛋白修饰和TF结合位点相关的DNA甲基化/羟甲基化的独特模式。
DNA甲基化的检测技术目前已极为成熟，包括全基因组甲基化的850K芯片、WGBS、RRBS、MeDIPseq，候选基因甲基化的BSseq、BSP、MSP、MethylTarget等，基本原理大多是基于亚硫酸盐对非甲基化修饰胞嘧啶的转化作用，在此不作赘述，今天我们看下羟甲基化（5hmC）常见的主要检测技术有哪些呢？
1. 氧化亚硫酸氢盐测序oxBS-seq[2]
该技术在将传统的BS-Seq技术与化学氧化相结合，先利用高钌酸钾KRuO4将DNA上的5hmC氧化成5fC，再用重亚硫酸盐处理，5fC和没有任何修饰的C就被转化成U，而5mC则不会被转化仍然保持为C。如此则可以特异性的检测5mC，BS-Seq和oxBS-Seq联合测序也可间接实现对5hmC单碱基分辨率的检测。其技术原理示意图如下：
2. TET辅助的重亚硫酸盐测序(TAB-seq) [3]
先用糖基把羟甲基化的C保护起来，然后用TET蛋白（Ten-eleven translocation methylcytosine dioxygenase 1），把甲基化的C转化成羟基化的C，进一步将羟甲基化的C转化成甲酰化的C和羧基化的C。这样，就可以把羟甲基化的C和甲基化的C给区分开来，从而特异性的检测5hmC。其技术原理示意图：
3. APOBEC偶联甲基化测序(ACE-seq) [4]
不同于传统的BS-Seq，该技术使用AID/APOBEC家族DNA脱氨酶APOBEC3A (A3A)代替化学脱氨，保证了DNA的完整性。首先，利用T4 β-葡糖基转移酶（βGT）将5hmC转化成5ghmC，5ghmC不会被A3A酶脱氨基，这样A3A能够特异地脱去C及5mC的氨基使其变为U，而5ghmC则因为不被该酶识别，测序时仍被检测为C。这样，可将5hmC与C及5mC区分开来，实现特异性检测5hmC。该技术原理示意图如下：
4. 5hmC-Seal技术[5]
该技术是利用糖基转移酶的作用将含有叠氮基团的葡萄糖特异性的共价标记到片段化DNA的5hmC上，然后再通过高效的点击化学反应接上biotin进行可实现高效的富集并构建DNA文库；利用高通量测序并比对分析的方法即可以获得5hmC在基因组上的分布情况。对于抗体富集的方法，该方法的富集效率更高，5hmC的基因图谱更加精确。该技术原理示意图如下：
总结展望
（1） DNA甲基化和DNA羟甲基化是甲基化和去甲基化的动态平衡的执行过程标志物，在维持正常细胞的功能、雌性个体X染色体失活、基因组结构稳定、遗传印记、胚胎发育、肿瘤疾病的发生发展具有至关重要的作用，是基因沉默和表达的关键调控因素。
（2） 5mC和5hmC都具有以下特点：1）可遗传2）组织和器官特异性3）可逆性 4）可作为biomarker反应疾病状态和暴露因素等。因此都可以作为不同疾病和机体状态的Biomarker。
（3） 未来在临床时间操作中，基于5mC和5hmC以上特点，特别是肿瘤疾病因为肿瘤生长伴随着细胞脱落和释放到循环肿瘤细胞（CTCs）血液中；循环肿瘤细胞（CTCs）中cfDNA携带着肿瘤细胞的信号包括DNA碱基突变（ctDNA）和修饰（5mC和5hmC）等。相较于ctDNA，5mC和5hmC可以做到组织特异性和溯源性，可能更具有无创性和广阔的应用场景。
参考文献：
[1]. Peng V, et al. Whole-genome profiling of DNA methylation and hydroxymethylation identifies distinct regulatory programs among innate lymphocytes. Nat Immunol. 23(4):619-631(2022).
[2] Booth, M. J. et al. Quantitative sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine at single-base resolution. Science 336, 934–937 (2012).
[3] Yu, M. et al. Base-resolution analysis of 5-hydroxymethylcytosine in the mammalian genome. Cell 149, 1368–1380 (2012).
[4] Schutsky, E. K. et al. Nondestructive, base-resolution sequencing of 5-hydroxymethylcytosine using a DNA deaminase. Nat. Biotechnol. 36,1083–1090 (2018).
[5]. Han D, et al. A Highly Sensitive and Robust Method for Genome-wide 5hmC Profiling of Rare Cell Populations. Mol Cell. 18;63(4):711-719(2016).
【Gut】肝癌早期诊断的中国方案：无创性外周血游离DNA 5hmC方法
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