早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指女性在40岁之前出现的卵巢功能减退，主要表现为月经异常（闭经、月经稀发）、卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）>25 U/L、雌激素水平波动性下降。POI的发病率为1%~4%，全球性POI发病率的分析显示为3.7%。POI临床表现为卵巢功能在40岁以前出现异常，导致月经周期紊乱、卵子质量下降和激素水平波动，不仅极大的影响了女性生育能力，患者还会面临骨质疏松症、心血管疾病、认知障碍等并发症的风险，以及由于长期激素失衡导致的心理社会问题。尽管已经鉴定了几个与POI相关的致病基因，如FMR1、GALT、NOBOX等，但POI的遗传学基础仍然复杂且未被完全解析。因此，寻找新的遗传因素对于理解POI的发病机制、提高诊断准确性和指导个性化治疗至关重要。
2024年6月11日，复旦大学张锋教授联合同济大学附属第十人民医院陈晓军教授、山东大学妇儿与生殖健康研究院秦莹莹教授和华中科技大学附属同济医院栗妍副教授等多个团队在【Science China Life Sciences】杂志（JCR Q1，中科院Top期刊，IF：8.0）上发表了题为“Deleterious variants in RNF111 impair female fertility and induce premature ovarian insufficiency in humans and mice”的封面文章。本研究结果揭示RNF111在卵巢功能中的作用机制，为理解POI的遗传基础提供了新的视角，并可能有助于开发针对RNF111相关变异的临床诊断和治疗策略。
![]()
![]()
随着全球人口老龄化趋势加剧，女性晚婚晚育成为普遍现象，这使得生育健康问题日益受到关注。特别是在现代社会中，职业压力和个人选择导致许多女性推迟生育年龄，增加了遭遇生殖障碍的风险。其中，早发性卵巢功能不全(POI)是严重影响女性生育能力的疾病。
近年来，生殖医学领域在POI的诊断、病因学研究和治疗策略方面取得了显著进展。遗传因素被认为是POI的重要诱因之一，大约12%的POI患者有早绝经或POI的家族史，这表明遗传因素在该疾病中占有重要地位。多项研究表明特定的基因变异与POI的发生密切相关，尽管已有研究鉴定出约100个与POI相关的致病基因，但这些已知基因只能解释20%至25%的POI病例，其余大多数病例的遗传原因仍然未知。RNF111是一种E3泛素连接酶，参与多种信号通路，包括TGF-β/BMP信号通路，而这一通路在卵泡发育和卵巢功能调节中扮演着核心角色。然而，RNF111的具体功能及其变异对女性生育力的影响尚未被系统研究。此外，全外显子测序（Whole-Exome Sequencing, WES）作为遗传分析和POI分子诊断的工具越来越受到重视。WES技术有助于识别新的与疾病相关的基因和变异，但目前对于POI的遗传诊断仍然存在挑战。本研究旨在通过遗传学、分子生物学和动物模型等多学科方法，基于基因组、转录组、蛋白质组等多组学技术手段，全面理解RNF111基因在POI中的作用，探讨RNF111基因的有害变异是否会导致POI和女性生育力下降。期望揭示RNF111在卵巢功能中的作用机制，为POI的遗传诊断和治疗提供新的视角和可能的靶点。![]()
1. WES测序筛选确定RNF111可能是POI家族的致病基因
在非综合征POI的中国家庭中，三个受影响的姐妹表现出不同程度的POI严重性（表1）。所有姐妹的初潮都很正常。先证者（II-2）和她的妹妹（II-3）自初潮以来就有月经稀发，而她的姐姐（II-1）在23岁时出现月经稀发并在26岁时达到绝经。II-1和II-2的超声检查显示卵巢较小。三个受影响的姐妹都通过自然或辅助生殖技术实现了生育。在患者II-1和II-2的比较基因组杂交（CGH）分析中没有发现致病性拷贝数变异（CNV）。
![]()
对这个POI家庭进行全外显子组测序（WES）分析，基于隐性遗传模式的遗传分析没有发现任何POI的候选变异。由于52岁的健康母亲有规律的月经周期，可能由父亲遗传或全新突变引起的显性致病变异的可能性。使用失去功能的不耐受概率（pLI）得分，只剩下一个候选变异，这是一个在RNF111中的罕见错义变异（c.1456C>A [p.P486T]），由所有三个受影响的姐妹共享，并从她们的父亲那里遗传而来。这个RNF111变异位于一个进化上保守的位点，并且被多个算法包括SIFT、PolyPhen-2、LRT、M-CAP和CADD预测为有害。这个有害变异在1000个人类基因组项目中不存在，在gnomAD数据库中记载的人类群体中也很罕见。如图1。
![]()
Fig. 1. Identification of a deleterious missense variant of RNF111 in a Chinese family with POI.
2. 大型POI队列和DOR队列验证变异位点人群频率和其他有害RNF111突变位点
通过分析来自1030名POI患者的大型队列的WES数据，识别出4个潜在致病的RNF111变异体（SIFT评分为0，GERP++ RS>5），这四个突变也被SIFT、PolyPhen-2、LRT、CADD和GERP等多种其他生物信息学工具预测为有害变异。对500例DOR人群的WES数据分析，在两名患者中发现了两个预测为致病的RNF111变异（表2）。其中一名患者携带错义变异c.1432C>T[p.P478S]，这进一步表明该变异对女性不孕的重要性。综上所述，这些发现表明RNF111在POI和女性不孕症中的遗传学意义。![]()
3. 公共数据库比对验证RNF111功能和表达模式
利用先前研究中发布的人类和猕猴卵巢的scRNA-seq数据，来调查灵长类卵巢中RNF111的表达模式。观察到人类卵母细胞中RNF111的表达显著高于颗粒细胞，在猕猴的scRNA-seq数据中，RNF111作为卵母细胞的标记基因出现。由于数据中的22个卵母细胞数量不足以将卵母细胞细分为不同的发育阶段，通过免疫荧光分析了小鼠卵巢和卵母细胞中RNF111的表达模式，观察到与体细胞相比，RNF111主要在发育中的卵母细胞中表达（图2）。这些表达模式表明RNF111/RNF111可能在人类、猴子和老鼠的卵巢中发挥类似的作用。因此，小鼠是进一步功能研究RNF111对POI遗传贡献的合适模型。![]()
Fig. 2. RNF111/RNF111 is highly expressed in oocytes.
4. 小鼠功能实验发现Rnf111突变体的雌性生育能力受损
为了模拟在POI病例中观察到的单倍体有害RNF111变异的功能性影响，构建了两种携带杂合Rnf111突变的小鼠模型：错义突变（Rnf111+/M，对应于POI家族中的人类RNF111变异c.1456C>A）和无效突变（Rnf111+/−，涉及第7外显子的缺失导致移码突变）。使用与Rnf111第7外显子匹配的引物进行RT-qPCR，显示Rnf111+/−胚胎中Rnf111的表达显著降低，在纯合突变体（Rnf111−/−）中检测不到，Rnf111基因敲除在中期妊娠致死。生育测试揭示了两种Rnf111+/M和Rnf111+/−雌鼠的生育能力受损。在整个交配期间，每只雌鼠的幼仔总数从WT雌鼠的平均38.0只显著下降到Rnf111+/−雌鼠的15.4只。在整个交配期间，每只雌鼠的幼仔总数从WT雌鼠的平均38.0只显著下降到Rnf111+/−雌鼠的15.4只；Rnf111+/M雌鼠在交配期间也产生了较少的幼仔，平均为28.9只。首次生育年龄在Rnf111+/M、Rnf111+/−和WT雌鼠之间没有显著差异。Rnf111+/−雌鼠表现出比WT雌鼠显著更长的窝间隔。此外，两种突变雌鼠的每窝幼仔数量显著减少，WT雌鼠平均每窝有7.1只幼仔，而Rnf111+/M和Rnf111+/−雌鼠分别为6.0只和4.3只（图3）。表明Rnf111+/M和Rnf111+/−两种突变体都损害了女性生育能力，且与无效突变相比，错义突变的影响较弱。
![]()
Fig. 3. Impaired female fertility in two mouse Rnf111 mutants.
为了进一步研究Rnf111突变雌性小鼠的不育症，对3周至6个月大的雌性小鼠的卵巢进行了组织学分析。卵泡计数揭示了两种突变体中卵巢储备的显著减少，Rnf111+/−雌鼠从2个月大开始原始卵泡的数量显著减少，而Rnf111+/M雌鼠从3个月大开始，3个月大的Rnf111+/−雌鼠生长中的卵泡（初级和次级卵泡）数量显著减少，但Rnf111+/M雌鼠没有。鉴于观察到的初级和次级卵泡数量没有增加，卵巢储备的减少可能不是由于原始卵泡的过度激活，而是由于初始卵巢储备较小的结果。使用CUBIC方法在产后第1天测量了新生小鼠的初始卵巢储备，与WT小鼠相比，两种突变体的初始卵巢储备显著减少（图4）。表明了单倍体Rnf111突变可以通过减少初始卵巢储备的大小来损害卵巢功能。
![]()
Fig. 4. Diminished ovarian reserve in heterozygous Rnf111 mutant female mice.
6. Rnf111+/−卵巢中女性性腺发育和BMP信号通路的失调
性成熟的Rnf111+/−雌鼠卵巢中RNA-seq结果显示，共有1,414个基因（672个上调和742个下调）在Rnf111+/−和WT卵巢之间显示出差异表达。GO富集分析发现最丰富的前十条生物学过程包括女性性腺发育和BMP信号通路的负向调节。GSEA揭示了Rnf111+/−卵巢中那些与卵巢功能相关基因的显著上调。RT-qPCR证实了Rnf111+/−卵巢中BMP信号通路和卵泡生成的失调。在Rnf111+/−和WT卵巢中进行了定量蛋白质组学分析验证了与RNA-seq结果的强相关性。此外，Rnf111+/−雌鼠与WT雌鼠相比，窝间隔更长，表明Rnf111的失调可能诱导卵巢功能障碍，超排卵实验进一步证实了Rnf111+/−雌鼠的卵巢功能障碍。如图5。以上表明Rnf111单倍体不足扰乱了卵巢功能。
![]()
Fig. 5. Haploinsufficiency of Rnf111 caused dysregulation of folliculogenesis and BMPsignaling.
本研究通过鉴定RNF111中的有害变异，为理解POI的遗传基础提供了新的视角，揭示了RNF111在卵巢功能中的潜在作用，特别是在TGF-β/BMP信号通路中的调节作用，进一步增进对POI病理机制的认识。本研究成果有助于开发新的诊断方法，尤其是针对RNF111基因的变异，可能为有生育问题的女性提供个性化的医疗方案。此外，为POI和DOR患者提供了更多的遗传信息，有助于更好地评估和管理这些患者的生育健康。对于后续临床研究，仍需要对更多的POI患者进行基因组测序，以识别更多的与疾病相关的基因和变异。对RNF111的功能进行更深入的研究，包括其在卵泡发育和卵母细胞成熟中的具体作用机制的研究也是有必要的。期望基于RNF111的功能研究，开发针对该基因变异可能的治疗方案，包括基因疗法或药物干预，也为有遗传风险的女性提供更准确的生育咨询和预测。参考文献[1] Song C, Qin Y, Li Y, Yang B, Guo T, Ma W, Xu D, Xu K, Fu F, Jin L, Wu Y, Tang S, Chen X, Zhang F. Deleterious variants in RNF111 impair female fertility and induce premature ovarian insufficiency in humans and mice. Sci China Life Sci. 2024 Jul;67(7):1325-1337. doi: 10.1007/s11427-024-2606-6. Epub 2024 Jun 11. PMID: 38874713.Driving innovation for better life
