多项研究表明，miR-182具有抑癌基因的作用。例如，miR-182分别通过抑制VEGF-C和UBE2T的表达来抑制结肠癌和透明细胞肾细胞癌的肿瘤发生。前期研究表明，miR-182通过诱导急性髓系细胞的细胞凋亡和抑制白血病干细胞（LSC）的自我更新和肿瘤抑制基因。前期文献表明，由启动子高甲基化引起的miR- 182的低表达促进了白血病的发生。因此，需要回答第一个问题：ALL细胞是否通过miR-182启动子的高甲基化调控下游基因表达？
异常的表观遗传模式是白血病细胞的典型标志。CpG序列的DNA甲基化修饰破坏基因启动子能力，导致抑癌基因的下调。因此，白血病细胞中经常发生的抑癌基因的高甲基化与骨髓和淋巴恶性肿瘤患者的临床结果较差有关。
针对以上科学问题，2024年3月26日，温州医科大学附属第一医院高申孟教授团队最新研究成果，以“Low expression of miR-182 caused by DNA hypermethylation accelerates acute lymphocyte leukemia development by targeting PBX3 and BCL2: miR-182 promoter methylation is a predictive marker for hypomethylation agents+BCL2 inhibitor venetoclax”发表在《Clinical Epigenetics》（IF=5.70），该研究鉴定了miR-182在ALL细胞中作为肿瘤抑制基因，DNA高甲基化导致miR-182的低表达促进ALL细胞的恶性表型。通过DAC+Ven联合治疗应用于miR-182启动子高甲基化的ALL患者的临床试验表明，miR-182启动子的甲基化水平可作为ALL患者DAC+Ven治疗的潜在生物标志物。
研究背景
DNA甲基化是最早被发现、也是目前研究最深入的表观遗传调控机制之一。DNA甲基化修饰在维持正常细胞的功能、雌性个体X染色体失活、基因组结构稳定、遗传印记、胚胎发育、肿瘤疾病和复杂疾病的进展都发挥着重要作用。
5mC具有以下特点：1）可遗传2）组织和器官特异性3）可逆性 4）可作为Biomarker反应疾病状态和暴露因素等。在基因表达调控及正常发育的广泛生物过程中发挥着重要作用，被认为是生物个体的第五个碱基。
结构基因中，5’端CpG岛中的5-mC会阻碍 转录因子复合体与DNA结合，因此DNA甲基化一般与基因沉默相关；非甲基化或去甲基化一般与基因的活化相关联。
方案设计
1. 研究材料：细胞系原代ALL细胞和正常对照（NCs）；
2. 小鼠模型：BCR-ABL（P190）诱导的B-ALL和Notch诱导的小鼠T-ALL模型；miR-182的表达量检测：实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
3. miR-182的靶基因预测：TargetScan软件预测，并用qRT-PCR检测其表达量；
4. DNA甲基化检测：使用Genesky BioTech（上海天昊生物）MethylTarget™技术靶向检测miR-182启动子区域甲基化水平；
主要内容&结果
1. miR182启动子的高甲基化引起miR182的表达降低
为了探索miR-182在ALL细胞中的功能，团队检测了38个未处理的原发性B-ALL样本和14个正常对照（NCs）中的miR-182水平。miR-182在原发性ALL组织样本中的表达明显低于NCs（图1A）。随后，团队确定了DNA高甲基化是否通过miR-182启动子上的三个CpG岛介导了miR-182的低表达。CpG岛3比CpG岛1甲基化程度更高；而CpG岛2在AML细胞中未甲基化。
图1 miR-182启动子的高甲基化导致miR-182在B-ALL细胞中的表达低于NC
2. 过表达miR182可抑制ALL细胞的增殖并诱导细胞凋亡
由于miR-182在ALL细胞中的表达低于在NCs中，团队探索了miR-182过表达（182OE）在ALL细胞系中的抗白血病能力，包括NALM-6、REH和Jurkat细胞。在182OE转导的细胞中，与空白载体（NC）中的进行比较miR-182的表达增加了40-120倍（图2A）。此外，通过CCK8测定法（图2B–D）测定，miR-182的过表达显着降低了细胞增殖，并通过膜联蛋白V/7-AAD测定法（图2E–G）测定了诱导的细胞凋亡。为了进一步阐明miR-182在ALL细胞中的作用，将NALM-6-182OE和NALM-6-182NC细胞等量移植到NSG小鼠中，并测量hCD45+百分比和OS（图2H）。与NALM-6-NC细胞相比，182OE-NALM-6细胞hCD45+百分比降低（图2I）和OS延长（图2J）。
图2 过表达miR-182可抑制ALL细胞的增殖并诱导细胞凋亡
3. 敲除miR182（182KO）加速小鼠BCR- ABL（P190）转化的B-ALL的发展
为了探索miR-182在体内的功能，团队使用了182KO小鼠进行了进一步的研究。从182WT和182KO B-ALL小鼠中分离GFP+细胞，检测miR-182的表达，与182WT B-ALL细胞相比，182KO B-ALLB-ALL细胞miR-182的表达完全缺失。与外周血（PB，图3A）和BM细胞（图3B）中的182WT B-ALL细胞相比，182KO B-ALL细胞中代表白血病细胞的GFP+细胞百分比显著增高。此外，Wright-Giemsa染色显示182KO中PB（图3C）和BM细胞（图3D）中ALL细胞的百分比高于182WT B-ALL细胞。这些结果显示，182KO细胞的B-ALL负荷高于182WT B-ALL细胞。
团队随后确定了182KO B-ALL细胞是否在脾脏和肝脏中有更高的渗透性。182KO B-ALL小鼠的脾脏和肝脏重量明显高于182WT B-ALL小鼠（图3E和F）。此外，与182WT B-ALL小鼠相比，182KO B-ALL小鼠的脾脏（图3G）和肝组织（图3H）有更广泛的白血病炎症。总的来说，182KO B-ALL细胞比182WT B-ALL细胞具有更高的致白血病活性。
图3 miR-182的缺失加速小鼠BCR-ABL（P190）转化的B-ALL的发展
4. 小鼠182KO B-ALL细胞比182WT B-ALL细胞更富含LIC
图4 182KO ALL细胞富集更多的LIC（B220+CD43+）细胞
5. 182KO加速小鼠Notch转化的TALL模型的发展
为了进一步研究miR-182在T-ALL细胞中的潜在作用，团队从182KO和182WT小鼠中分离BM c-Kit+细胞，构建Notch转化的T-ALL模型。来自182KO和182WT T-ALL小鼠的BM GFP+细胞完全表达CD3，而不表达CD19、Mac-1和Gr-1,说明T-ALL模型构建成功。由于胸腺组织中的白血病浸润是T-ALL细胞的重要特征，因此团队通过HE染色检查了胸腺组织。与182WT T-ALL小鼠相比，在182KO T-ALL小鼠的胸腺组织中发现了更高的白血病细胞浸润。最后，与182WT T-ALL小鼠相比，182KO T-ALL小鼠的OS显著缩短。
6. PBX3和BCL2是miR182的两个直接靶点
为了进一步探索miR-182在ALL细胞中的潜在靶点，团队通过TargetScan寻找miR-182的可能靶点。B细胞前白血病转录因子3（PBX3）和BCL2，这两个重要的致癌基因与白血病细胞的增殖、凋亡和白血病细胞的干性有关。最终被选进行以下实验。如图5A和B所示，PBX3和BCL2 mRNA的3-‘UTR中的保守区域可能与miR- 182结合。此外，将miR-182在PBX3和BCL23‘UTR的结合序列插入携带Luc基因的载体中，检测Luc活性。miR-182的过表达和miR-182的规则结合位点使Luc活性降低了两倍以上,相反，miR-182的过表达和miR-182结合位点的突变挽救了miR-182诱导的Luc活性的下降（图5C和D）。
随后，团队测量了mir-182过表达或miR-NC的ALL细胞中PBX3和BCL2的蛋白表达。在NALM-6和Jurkat细胞中，过表达miR-182显著降低了PBX3和BCL2的蛋白表达（图5E和F）。与人类细胞中的结果一致，小鼠182KO B-ALL细胞比182WT B-ALL细胞具有更高的Bcl2和Pbx3蛋白表达（图5G）。
图5 PBX3和BCL2是miR-182的两个直接靶点
7. HMA通过miR-182-PBX3/BCL2轴具有抗ALL作用
团队的研究结果表明，由于miR-182启动子的高甲基化，miR-182在ALL细胞中的表达低于正常细胞。此外，miR-182降低了PBX3/BCL2蛋白的表达。因此，团队确定AZA和DAC是否通过miR-182-PBX3/BCL2轴具有抗ALL作用。用AZA和DAC处理ALL细胞4天，然后首先检测miR-182的表达。与预期的一样，AZA和DAC在所有四种ALL细胞系中都增加了miR-182的表达（图6A）。
团队探讨DAC处理后miR-182基因表达的增加是否是由于miR-182启动子甲基化水平的降低所致。根据MethylTarget测序结果表明，DAC处理使NALM-6细胞中CpG 3的甲基化频率从98降低到19%（图6B），使Jurkat细胞中的甲基化频率从97降低到21%（图6C）。团队还测量经过或不经过DAC处理的ALL4样本的甲基化水平，DAC处理将ALL4中的甲基化频率从84%降低到5%（图6D）。
图6 在ALL细胞中，HMAs通过miR-182-PBX3/BCL2轴具有显著的抗ALL活性
总的来说，CpG 岛3的甲基化可能介导了ALL细胞中miR-182的沉默，而DAC通过降低miR-182启动子上CpG 3的甲基化来增加miR-182的水平。
8. DAC与Ven联合降低高甲基化的ALL样本的细胞活力
ALL样本的平均甲基化水平高于NCs，但部分ALL样本仍表现出较低的甲基化频率(图1F)。团队探讨了DNA高甲基化是否与miR-182的低表达有关。由于19个B-ALL样本的中位甲基化频率为29.3%，团队以29%为阈值。在DNA高甲基化（>29%）的ALL样本中，miR-182的表达明显低于DNA低甲基化的样本（<29%）（图7A）。团队的数据表明，BCL2是miR-182的直接靶点。随后，团队确定了miR-182启动子高甲基化介导的miR-182低表达是否与ALL样本中高水平的BCL2蛋白相关。收集5个高甲基化和五个低甲基化的ALL样本，测定BCL2蛋白水平。与预期的一样，miR-182启动子高甲基化的ALL样本比低甲基化的样本具有更高的BCL2蛋白表达（图7B）。
图7 miR-182启动子甲基化是DAC+Ven治疗的预测标志物
据报道，Ven对表达高水平BCL2蛋白的白血病细胞敏感，团队探讨了在具有miR-182启动子高甲基化的ALL细胞中，DAC是否与Ven具有协同活性。6个ALL样本（4个高甲基化和2个低甲基化）分别用DAC（5.0 μM）+Ven（0.1 μM）或它们中的任何一个处理24 h，并测定细胞活力。在4个miR-182启动子高甲基化的早期ALL样本（图7C-F）中，DAC+Ven协同降低了细胞活力，但在两个miR-182启动子低甲基化的早期ALL样本中却没有（图7G和H）。
研究意义与展望
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【Nat Commun】山东大学王传新/杜鲁涛/李娟团队多中心多阶段循证发现乳腺癌血液高甲基化标志物，构建新甲基化检测体系实现乳腺癌无创和早期筛查
【Circulation】高血压形成机制和表观标志物：OVGP1启动子低甲基化激活基因和招募MYH9蛋白重塑血管功能诱发高血压
【Cancer Res】山东大学王传新/杜鲁涛团队发现结直肠癌甲基化标志物，提前2年预测疾病发生进展
【Clin Transl Med】哈尔滨医科大学赵亚双团队成果发现，循环游离DNA甲基化标志物可用于特异性筛查和诊断结直肠癌
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